Summary
La pancreatite cronica (CP) è una malattia caratterizzata da infiammazione e fibrosi del pancreas, spesso associata a dolori addominali intrattabili. Questo articolo si concentra sul perfezionamento della tecnica per generare un modello murino di CP tramite infusione del dotto biliare con acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS).
Abstract
La pancreatite cronica (CP) è una malattia complessa che coinvolge l'infiammazione pancreatica e la fibrosi, l'atrofia ghiandolare, il dolore addominale e altri sintomi. Diversi modelli di roditori sono stati sviluppati per studiare la CP, di cui il modello di infusione del dotto biliare acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS) replica le caratteristiche del dolore neuropatico osservato nella CP. Tuttavia, l'infusione di farmaci per i dotti biliari nei topi è tecnicamente impegnativa. Questo protocollo dimostra la procedura di infusione di TNBS del dotto biliare per la generazione di un modello murino CP. La TNBS è stata infusa nel pancreas attraverso l'ampolla di Vater nel duodeno. Questo protocollo ha ottimizzato il volume del farmaco, le tecniche chirurgiche e la gestione del farmaco durante la procedura. I topi trattati con TNBS hanno mostrato caratteristiche di CP riflesse da riduzioni del peso corporeo e del pancreas, cambiamenti nei comportamenti associati al dolore e morfologia pancreatica anormale. Con questi miglioramenti, la mortalità associata all'iniezione di TNBS è stata minima. Questa procedura non è solo fondamentale nella generazione di modelli di malattia pancreatica, ma è anche utile nella somministrazione locale di farmaci pancreatici.
Introduction
La pancreatite cronica (CP) è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata da atrofia del pancreas, fibrosi, dolore addominale ed eventuale perdita delle funzioni sia esocrine che endocrine1. Gli attuali trattamenti medici e chirurgici non sono curativi ma vengono intrapresi per alleviare i sintomi che sono la conseguenza della malattia: dolore addominale refrattario, disfunzione endocrina ed esocrina. Pertanto, sono urgentemente necessari trattamenti più efficaci2. I modelli animali forniscono uno strumento essenziale per sviluppare una migliore comprensione della malattia e studiare potenziali terapie3. Sono stati sviluppati diversi modelli murini per CP, di cui modelli di ceruleina e/o alcol sono comunemente usati. Ceruleina, un oligopeptide che stimola la secrezione pancreatica, ha dimostrato di indurre in modo riproducibile un modello CP con atrofia pancreatica, fibrosi, tra gli altri4. Un altro modello comune utilizza iniezioni seriali di L-arginina, che produce insufficienza esocrina simile a quella osservata nei pazienti umani5. La CP può anche essere indotta dalla legatura completa o parziale del dotto pancreatico, così come dall'ipertensione del dotto pancreatico6,7. Nonostante la varietà di modelli animali disponibili per CP, nessuno di questi modelli riproduce efficacemente il dolore addominale sperimentato dai pazienti CON CP8.
Studi precedenti hanno dimostrato che l'iniezione pancreatica locale di acido solfonico 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS) replica il dolore persistente sperimentato dai pazienti CON CP9,10,11. I topi trattati con TNBS hanno dimostrato ipersensibilità addominale e aumento dei comportamenti correlati al dolore, nonché una "ipersensibilità generalizzata" agli stimoli dolorosi, un fenomeno che è stato osservato nei pazienti con CP10. Oltre a imitare accuratamente il dolore CP, il modello TNBS replica anche altre caratteristiche patologiche della condizione umana come la fibrosi, l'infiltrazione di cellule mononucleate e la sostituzione delle cellule acinari con tessuto adiposo10,12. Tuttavia, l'infusione di TNBS attraverso il dotto biliare è una procedura tecnicamente impegnativa nei topi che può causare la morte. Per quanto ne sappiamo, non esiste un protocollo visivo per mostrare come viene eseguita l'infusione del dotto biliare. In questo articolo, dimostriamo la procedura dell'infusione di duzione biliare di TNBS per generare un modello murino CP. Questa procedura aiuterà a generare preziosi modelli animali per lo studio della CP e di altre malattie pancreatiche e può essere utilizzata per infondere altri materiali (ad esempio, virus, cellule) nel pancreas13.
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Protocol
Tutte le procedure sono state condotte con l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso la Medical University of South Carolina e il Ralph H. Johnson Medical Center. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 8-10 settimane. I topi erano alloggiati sotto un ciclo standard di 12 luci / 12 oscuri con accesso ad libitum al cibo e all'acqua.
1. Preparazione della soluzione iniettabile di TNBS
- Preparare il 10% di etanolo in soluzione salina allo 0,9%. Sciogliere lo stock TNBS (vedi Tabella dei materiali)in etanolo al 10% ad una concentrazione finale di 7,5 mM aggiungendo 7,5 μL di TNBS in 1 mL di etanolo al 10%.
ATTENZIONE: TNBS presenta un rischio chimico. Preparare la soluzione all'interno di una cappa aspirante e utilizzare dispositivi di protezione individuale come guanti, occhiali e un camice da laboratorio per evitare il contatto diretto con TNBS. - Caricare 50 μL di soluzione di TNBS al 0,75% in una siringa da insulina con un ago calibro 31. Caricare 50 μL di etanolo al 10% in soluzione salina in una siringa delle stesse dimensioni del controllo del veicolo. Posizionare le siringhe sul ghiaccio e proteggerle dalla luce fino a quando necessario.
2. Preparazione e chirurgia del topo
- Rasare i capelli dall'area chirurgica addominale.
- Iniettare una dose preventiva dell'analgesico (ad es. buprenorfina 0,1 mg/kg p.i.) prima dell'intervento chirurgico.
- Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con l'1,5-2% di isoflurano e 1 L/min di ossigeno. Confermare l'anestesia pizzicando le dita dei piedi e osservando l'animale per mancanza di riflesso.
- Posizionare il mouse su un pad chirurgico riscaldato durante l'intervento chirurgico. Applicare un unguento veterinario su ciascun occhio quando il topo è sotto anestesia.
- Disinfettare il sito chirurgico pulendo l'area chirurgica 3x con il 2% di iodio, seguito dal 70% di alcol (Tabella dei materiali).
- Eseguire una laparotomia con micro forbici per generare un'incisione di 0,5-1 cm.
- Esporre delicatamente il duodeno e individuare il dotto biliare comune utilizzando tamponi di cotone (Tabella dei materiali).
- Posizionare una micro clip emo-retta (Tabella dei materiali) sul condotto comune prossimale per impedire il flusso di TNBS o soluzioni di veicoli nel fegato e nella cistifellea ( Figura1A, B).
- Esporre delicatamente il duodeno e inserire l'ago nel dotto pancreatico attraverso la papilla di Vater.
- Una volta che l'ago è all'interno del condotto, posizionare una micro clip emo-emo curva (Tabella dei materiali) sopra il duodeno che circonda l'ago ( Figura1A) per fissare l'ago in posizione e impedire alla soluzione iniettata di entrare nel duodeno.
- Infondere gradualmente la soluzione (TNBS o veicolo) nel dotto pancreatico nel corso di un minuto.
NOTA: TNBS deve essere infuso lentamente per un minuto di tempo ed è facile controllare la velocità di infusione quando il pancreas viene perfuso con una siringa da insulina con un ago da 5/16 pollici e 31G. Mantenere la mano il più stabile possibile per evitare di pungere il dotto biliare. Se TNBS viene iniettato con successo, il colore giallo può essere visibile all'interno del pancreas. - Dopo l'infusione, rimuovere con attenzione il micro morsetto vicino al fegato, quindi rimuovere il micro morsetto che tiene l'ago e il duodeno.
- Riportare con attenzione il duodeno nella sua posizione originale.
- Lasciare 0,5 ml di soluzione salina sterile calda (36-37 °C) nella cavità addominale prima della chiusura, per aiutare il duodeno a tornare nella sua posizione originale e aiutare con il recupero della peristalsi.
- Chiudere l'incisione nello strato muscolare usando la sutura continua con un punto 5-0. Chiudere la pelle usando la sutura interrotta con un punto 4-0.
- Posizionare la gabbia contenente topi su una piastra riscaldante per consentire il recupero dall'anestesia.
- Confermare che i topi sono caldi e capaci di movimento spontaneo prima di riportarli nella stanza di attesa.
- Continuare a fornire un analgesico (ad esempio, buprenorfina 0,1 mg / kg i.p.) ogni 12 ore e calore supplementare per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
3. Monitoraggio del comportamento del mouse
- Rimuovere le suture al giorno 7 post-operatorio.
- Monitorare la salute e il comportamento del topo ogni giorno durante la prima settimana post-operatoria. Fai attenzione ai segni di angoscia come vocalizzazione, postura della schiena curva o locomozione ridotta. Misura il peso corporeo a giorni alterni.
- Utilizzare monofili di Von Frey (VFF) per misurare l'ipersensibilità meccanica addominale prima e 2, 3 settimane dopo l'intervento chirurgico come descritto9,14.
- Applicare VVFF di diverse forze applicate in ordine crescente alla zona addominale superiore 10 volte ogni 1-2 s. Considera l'innalzamento, la retrazione o la leccatura dell'addome (risposta di astinenza) come una risposta positiva.
- Applicare uno stimolo più forte se non si osserva una risposta positiva e uno stimolo più debole se si osserva una risposta positiva. La soglia di prelievo è la forza alla quale il mouse risponde il 50% delle volte.
4. Raccolta e analisi istologica del tessuto pancreatico
- Sacrificare i topi in anestesia per lussazione cervicale e sezionare attentamente il pancreas dall'intestino e da altri organi.
- Fissare il pancreas in paraformaldeide al 10% per 24 ore, incorporarlo nella paraffina, tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore e posizionarle su vetrini per la colorazione.
- Eseguire l'ematossilina-eosina e la colorazione tricroma di Masson utilizzando metodi standard come precedentemente riportato4.
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Representative Results
Le procedure di infusione del dotto biliare sono state ottimizzate per ridurre la mortalità dei topi associata a questa procedura10. TNBS è stato somministrato per la prima volta in un volume totale di 35 μL o 50 μL. L'iniezione di TNBS in un volume di 50 μL potrebbe raggiungere l'intero pancreas e indurre un fenotipo di malattia più omogeneo (Figura 1B). Inoltre, l'iniezione di TNBS utilizzando siringa da insulina con ago 31G potrebbe controllare meglio la velocità di infusione rispetto alle siringhe normali e alle dimensioni dell'ago. Anche i TNBS appena preparati conservati sul ghiaccio e utilizzati entro un'ora dalla preparazione del farmaco hanno prodotto risultati migliori rispetto ai TNBS preparati per più di un'ora. Con questi miglioramenti, la mortalità dei riceventi è stata controllata ed è rimasta sotto il 10%.
La perdita di peso corporeo è una delle caratteristiche di CP. I topi nel gruppo di controllo hanno perso circa il 6% del loro peso corporeo originale durante i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico, quindi gradualmente recuperati (104,6% del peso corporeo originale al giorno 21) (Figura 1C). Al contrario, i topi che ricevevano TNBS hanno perso in media circa il 15% del loro peso corporeo originale durante i primi 5 giorni e hanno riacquistato peso in seguito (99,8% del peso corporeo originale al giorno 21) (Figura 1C). Inoltre, rispetto ai controlli, i topi TNBS hanno mostrato un aumento dell'ipersensibilità meccanica addominale a 2 e 3 settimane dopo l'iniezione di TNBS (Figura 1D), che era probabilmente associato ad un aumento del dolore addominale10.
Per confermare che l'infusione di TNBS del dotto biliare ha effettivamente indotto cambiamenti pancreatici che imitano la CP umana, abbiamo raccolto tessuti pancreatici da TNBS o topi di controllo trattati con veicoli a 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. Sia le dimensioni che il peso per peso corporeo del pancreas sono stati significativamente ridotti nei topi TNBS rispetto ai controlli (Figura 2A, B), suggerendo una marcata atrofia pancreatica coerente con i risultati negli esseri umani con CP grave e a lungo termine. Inoltre, il pancreas dei topi di controllo è apparso normale senza evidenti cambiamenti morfologici, mentre i topi TNBS hanno mostrato vacuolizzazione con massiccia perdita di cellule acinari sostituite da infiltrazione di cellule adipose e fibrosi (Figura 2C). Questi risultati erano coerenti con i rapporti di altri studi9,10.
Figura 1: Infusione del dotto biliare TNBS per la generazione di topi CP. (A) Illustrazione dell'iniezione del dotto biliare. (B) Dotto biliare dopo iniezione di 50 μL di inchiostro. (C) Medie della variazione del peso corporeo nei topi che ricevono TNBS o veicolo. (D) Soglia di risposta addominale in TNBS e topi di controllo a 3 settimane dopo l'infusione. I dati sono stati analizzati utilizzando il software di analisi disponibile (ad esempio, GraphPad 8.2.1). I dati sono presentati come ± SEM. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il t-test dello studente, ** p < 0,01 è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Caratterizzazione della CP in topi trattati con TNBS. (A) Micrografie del pancreas da topi di controllo (CTR) e TNBS. (B) Il peso medio del pancreas diviso per il peso corporeo del topo nei topi CTR e TNBS. (C) Colorazione di ematossilina ed eosina di sezioni pancreatiche di topi CTR e TNBS. Barra di scala = 100 μm. I dati sono presentati come ± SEM. **, p < 0,01 dal t-test dello studente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'infusione del dotto biliare di TNBS per indurre pancreatite cronica è tecnicamente impegnativa nei topi, poiché fino al 22,5% dei topi può morire entro 3-4 giorni dall'infusione del farmaco10. Qui, questo rapporto ha perfezionato la procedura sulla base di studi precedenti e ha ridotto la mortalità precoce dei topi a <10%. Ad esempio, l'aumento del volume del farmaco (da 35 μL a 50 μL) può garantire che i farmaci raggiungano l'intero pancreas. L'uso di una siringa da insulina e di una dimensione dell'ago più piccola (31G) riduce il potenziale danno al dotto pancreatico e la perdita di bile nella cistifellea o nell'addome, che molto probabilmente causerebbe la morte del topo entro i primi giorni dopo l'intervento chirurgico. Il bloccaggio di entrambe le estremità del dotto biliare può impedire al TNBS di fuoriuscire alla cistifellea e all'intestino, il che può causare mortalità. Le clip emo-emo trattengono il TNBS all'interno del pancreas iniettato, migliorando l'efficacia e riducendo i danni ad altri tessuti. Inoltre, TNBS non è stabile a temperature superiori a 0 °C. Pertanto, utilizzando TNBS appena preparati, l'induzione CP ha ottenuto risultati stabili.
Questo protocollo induce efficacemente CP nei topi maschi C57BL / 6J a 8-12 settimane di età e genera un modello che imita i principali sintomi della pancreatite cronica, tra cui perdita di peso corporeo, atrofia pancreatica, fibrosi e probabile dolore addominale. Rispetto ad altri modelli murini CP, il modello TNBS è ampiamente utilizzato per valutare gli effetti analgesici oltre all'infiammazione10,15,16. L'altro vantaggio del modello TNBS è che il farmaco viene iniettato direttamente nel pancreas, il che riduce i danni ad altri organi che possono interferire con lo studio17. Questo modello murino TNBS CP può essere utilizzato per studiare la patogenesi e le opzioni di trattamento insieme ad altri modelli di pancreatite cronica.
Una limitazione di questo studio è che sono stati utilizzati solo topi tra le 8-10 settimane di età. Poiché i topi di età diverse possono avere dimensioni del pancreas diverse, che di conseguenza influenzano lo sviluppo di TNBS-CP. Pertanto, se i topi di età / dimensioni diverse devono essere somministrati una dose diversa di TNBS deve essere testata. Tuttavia, questo studio dimostra le procedure per eseguire con successo l'infusione del dotto pancreatico che può aiutare con studi incentrati sulle malattie pancreatiche.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR& D Merit I01BX004536) e dal National Institute of Health che concede # 1R01DK105183, DK120394 e DK118529 a HW. Ringraziamo il Dr. Hongju Wu per aver condiviso l'esperienza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
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