Summary
La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad caracterizada por inflamación y fibrosis del páncreas, a menudo asociada con dolor abdominal intratable. Este artículo se centra en refinar la técnica para generar un modelo de ratón de CP mediante infusión de conductos biliares con ácido sulfónico trinitrobenceno 2,4,6 (TNBS).
Abstract
La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad compleja que involucra inflamación pancreática y fibrosis, atrofia glandular, dolor abdominal y otros síntomas. Se han desarrollado varios modelos de roedores para estudiar la CP, de los cuales el modelo de infusión de ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS) del conducto biliar 2,4,6 replica las características del dolor neuropático observado en la PC. Sin embargo, la infusión de medicamentos para las vías biliares en ratones es técnicamente desafiante. Este protocolo demuestra el procedimiento de infusión de TNBS de conducto biliar para la generación de un modelo de ratón CP. TNBS se infundió en el páncreas a través de la ampolla de Vater en el duodeno. Este protocolo optimizó el volumen de medicamentos, las técnicas quirúrgicas y el manejo de medicamentos durante el procedimiento. Los ratones tratados con TNBS mostraron características de PC reflejadas por las reducciones de peso corporal y páncreas, los cambios en los comportamientos asociados al dolor y la morfología pancreática anormal. Con estas mejoras, la mortalidad asociada con la inyección de TNBS fue mínima. Este procedimiento no solo es crítico en la generación de modelos de enfermedad pancreática, sino que también es útil en la administración local de medicamentos pancreáticos.
Introduction
La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la atrofia del páncreas, fibrosis, dolor abdominal y eventual pérdida de las funciones exocrina y endocrina1. Los tratamientos médicos y quirúrgicos actuales no son curativos, sino que se llevan a cabo para aliviar los síntomas que son la consecuencia de la enfermedad: dolor abdominal refractario, disfunción endocrina y exocrina. Por lo tanto, se necesitan urgentemente tratamientos más efectivos2. Los modelos animales proporcionan una herramienta esencial para desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad e investigar posibles terapias3. Se han desarrollado múltiples modelos de ratón para PC, de los cuales se utilizan comúnmente modelos de ceruleína y / o alcohol. Se ha demostrado que la ceruleína, un oligopéptido que estimula la secreción pancreática, induce de forma reproducible un modelo de PC con atrofia pancreática, fibrosis, entre otros4. Otro modelo común utiliza inyecciones seriadas de L-arginina, que produce insuficiencia exocrina similar a la observada en pacientes humanos5. La PC también puede ser inducida por ligadura completa o parcial del conducto pancreático, así como por hipertensión del conducto pancreático6,7. A pesar de la variedad de modelos animales disponibles para la PC, ninguno de estos modelos reproduce eficazmente el dolor abdominal experimentado por los pacientes conPC 8.
Estudios previos mostraron que la inyección pancreática local de ácido 2,4,6 -trinitrobenceno sulfónico (TNBS) replica el dolor persistente experimentado por los pacientes con PC9,10,11. Los ratones tratados con TNBS demostraron hipersensibilidad abdominal y un aumento de los comportamientos relacionados con el dolor, así como una "hipersensibilidad generalizada" a los estímulos dolorosos, un fenómeno que se ha observado en pacientes con PC10. Además de imitar con precisión el dolor CP, el modelo TNBS también replica otras características patológicas de la condición humana como la fibrosis, la infiltración de células mononucleares y el reemplazo de células acinares con tejido graso10,12. Sin embargo, la infusión de TNBS a través del conducto biliar es un procedimiento técnicamente desafiante en ratones que puede causar la muerte. Hasta donde sabemos, no existe un protocolo visual que muestre cómo se realiza la infusión de conductos biliares. En este artículo, demostramos el procedimiento de la infusión de ducción biliar de TNBS para generar un modelo de ratón CP. Este procedimiento ayudará a generar valiosos modelos animales para el estudio de la PC y otras enfermedades pancreáticas y se puede utilizar para infundir otros materiales (por ejemplo, virus, células) en el páncreas13.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur y el Centro Médico Ralph H. Johnson. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J entre 8-10 semanas de edad. Los ratones fueron alojados bajo un ciclo estándar de 12 luces / 12 oscuros con acceso ad libitum a los alimentos y al agua.
1. Preparación de TNBS solución inyectable
- Preparar etanol al 10% en solución salina al 0,9%. Disolver TNBS (ver Tabla de Materiales)en etanol al 10% a una concentración final de 7,5 mM añadiendo 7,5 μL de TNBS en 1 mL de etanol al 10%.
PRECAUCIÓN: El TNBS presenta un peligro químico. Prepare la solución dentro de una campana extractora de humos y use equipo de protección personal como guantes, gafas y una bata de laboratorio para evitar el contacto directo con TNBS. - Cargue 50 μL de solución de TNBS al 0,75% en una jeringa de insulina con una aguja calibre 31. Cargue 50 μL de etanol al 10% en solución salina en una jeringa del mismo tamaño que el control del vehículo. Coloque las jeringas sobre hielo y protéjalas de la luz hasta que sea necesario.
2. Preparación y cirugía del ratón
- Afeitar el vello de la zona quirúrgica abdominal.
- Inyecte una dosis preventiva del analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg p.i.) antes de la cirugía.
- Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con 1,5-2% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los los días y observando al animal por falta de reflejo.
- Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada durante la cirugía. Aplique ungüento veterinario en cada ojo cuando el ratón esté bajo anestesia.
- Desinfectar el sitio quirúrgico limpiando el área quirúrgica 3 veces con 2% de yodo, seguido de alcohol al 70%(Tabla de Materiales).
- Realizar una laparotomía con micro tijeras para generar una incisión de 0,5-1 cm.
- Exponga suavemente el duodeno y localice el conducto biliar común utilizando hisopos de algodón(Tabla de materiales).
- Coloque un microclip hemo recto(Tabla de Materiales)sobre el conducto común proximal para evitar el flujo de TNBS o soluciones de vehículos hacia el hígado y la vesícula biliar (Figura 1A,B).
- Exponga suavemente el duodeno e inserte la aguja en el conducto pancreático a través de la papila de Vater.
- Una vez que la aguja esté dentro del conducto, coloque un micro clip hemo curvo(Tabla de materiales)sobre el duodeno que rodea la aguja(Figura 1A)para asegurar la aguja en su lugar y evitar que la solución inyectada entre en el duodeno.
- Infundir gradualmente la solución (TNBS o vehículo) en el conducto pancreático en el transcurso de un minuto.
NOTA: TNBS necesita ser infundido lentamente durante un minuto de tiempo, y es fácil controlar la velocidad de infusión cuando el páncreas se perfunde con una jeringa de insulina con una aguja de 5/16 pulgadas y 31G. Mantenga la mano lo más estable posible para evitar pinchar el conducto biliar. Si TNBS se inyecta con éxito, el color amarillo puede ser visible dentro del páncreas. - Después de la infusión, retire cuidadosamente la micro pinza cerca del hígado y luego retire la micro pinza que sostiene la aguja y el duodeno.
- Devuelva cuidadosamente el duodeno a su posición original.
- Deje 0,5 ml de solución salina estéril tibia (36-37 ° C) en la cavidad abdominal antes del cierre, para ayudar a que el duodeno vuelva a su posición original y ayudar con la recuperación de la peristalsis.
- Cierre la incisión en la capa muscular con sutura continua con un punto 5-0. Cierre la piel con sutura interrumpida con una puntada de 4-0.
- Coloque la jaula que contiene ratones en una almohadilla térmica para permitir la recuperación de la anestesia.
- Confirme que los ratones están calientes y son capaces de movimiento espontáneo antes de devolverlos a la sala de espera.
- Continúe proporcionando un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) cada 12 h y calor suplementario durante 48 h después de la cirugía.
3. Supervisión del comportamiento del ratón
- Retire las suturas en el día 7 después de la cirugía.
- Monitoree la salud y el comportamiento del ratón diariamente durante la primera semana después de la cirugía. Esté atento a los signos de angustia, como vocalización, postura encorvada de la espalda o reducción de la locomoción. Mide el peso corporal cada dos días.
- Utilizar monofilamentos de Von Frey (VFF) para medir la hipersensibilidad mecánica abdominal antes, y 2, 3 semanas después de la cirugía como se describe9,14.
- Aplique VFFs de diferentes fuerzas aplicadas en orden ascendente a la zona abdominal superior 10x cada 1-2 s. Considere la elevación, retracción o lamido del abdomen (respuesta de abstinencia) como una respuesta positiva.
- Aplicar un estímulo más fuerte si no se observa una respuesta positiva, y un estímulo más débil si se observa una respuesta positiva. El umbral de retirada es la fuerza a la que el ratón responde el 50% de las veces.
4. Recolección y análisis histológico del tejido pancreático
- Sacrifique a los ratones bajo anestesia por dislocación cervical y diseccione cuidadosamente el páncreas del intestino y otros órganos.
- Fije el páncreas en paraformaldehído al 10% durante 24 h, incrute parafina, corte secciones de tejido de 5 μm de espesor y colóquelas en portaobjetos de vidrio para teñirlos.
- Realizar la tinción de hematoxilina-eosina y tricrómica de Masson utilizando métodos estándar como se informó anteriormente4.
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Representative Results
Los procedimientos de infusión de conductos biliares se optimizaron para reducir la mortalidad de ratones asociada con este procedimiento10. TNBS se administró por primera vez en un volumen total de 35 μL o 50 μL. La inyección de TNBS en un volumen de 50 μL podría llegar a todo el páncreas e inducir un fenotipo de enfermedad más homogéneo(Figura 1B). Además, la inyección de TNBS utilizando una jeringa de insulina con aguja 31G podría controlar mejor la velocidad de infusión en relación con las jeringas regulares y los tamaños de aguja. Los TNBS recién preparados almacenados en hielo y utilizados dentro de una hora de la preparación del fármaco también produjeron mejores resultados en comparación con los TNBS preparados durante más de una hora. Con estas mejoras, se controló la mortalidad de los receptores y se mantuvo por debajo del 10%.
La pérdida de peso corporal es una de las características de la PC. Los ratones en el grupo de control perdieron alrededor del 6% de su peso corporal original durante los primeros 3 días después de la cirugía, luego se recuperaron gradualmente (104.6% del peso corporal original en el día 21) (Figura 1C). En contraste, los ratones que recibieron TNBS perdieron en promedio alrededor del 15% de su peso corporal original durante los primeros 5 días y recuperaron peso después (99.8% del peso corporal original en el día 21)(Figura 1C). Además, en comparación con los controles, los ratones TNBS mostraron un aumento de la hipersensibilidad mecánica abdominal a las 2 y 3 semanas después de la inyección de TNBS(Figura 1D),lo que probablemente se asoció con un aumento del dolor abdominal10.
Para confirmar que la infusión de TNBS del conducto biliar indujo efectivamente cambios pancreáticos que imitaban la PC humana, recolectamos tejidos pancreáticos de TNBS o ratones de control tratados con vehículos a las 3 semanas después de la cirugía. Tanto el tamaño como el peso por peso corporal del páncreas se redujeron significativamente en ratones TNBS en comparación con los controles(Figura 2A,B),lo que sugiere una marcada atrofia pancreática consistente con los hallazgos en humanos con PC grave y a largo plazo. Además, el páncreas de los ratones control parecía normal sin cambios morfológicos obvios, mientras que los ratones TNBS mostraron vacuolización con pérdida masiva de células acinares reemplazadas por infiltración de células grasas y fibrosis(Figura 2C). Estos hallazgos fueron consistentes con los informes de otros estudios9,10.
Figura 1: Infusión de conductos biliares TNBS para la generación de ratones CP. (A) Ilustración de la inyección de conductos biliares. (B) Conducto biliar después de la inyección de 50 μL de tinta. (C) Promedios de cambio de peso corporal en ratones que reciben TNBS o vehículo. (D) Umbral de respuesta abdominal en TNBS y ratones de control a las 3 semanas después de la infusión. Los datos se analizaron utilizando el software de análisis disponible (por ejemplo, GraphPad 8.2.1). Los datos se presentan como media ± SEM. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la prueba t de Student, ** p < 0,01 se consideró estadísticamente significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Caracterización de CP en ratones tratados con TNBS. (A) Micrografías del páncreas de ratones control (CTR) y TNBS. (B) El peso medio del páncreas dividido por el peso corporal del ratón en ratones CTR y TNBS. (C) Tinción de hematoxilina y eosina de secciones de páncreas de ratones CTR y TNBS. Barra de escala = 100 μm. Los datos se presentan como media ± SEM. **, p < 0,01 por la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La infusión de TNBS en las vías biliares para inducir pancreatitis crónica es técnicamente un desafío en ratones, ya que hasta el 22,5% de los ratones pueden morir dentro de los 3-4 días posteriores a la infusión del medicamento10. Aquí, este informe refinó el procedimiento basado en estudios previos y redujo la mortalidad temprana de ratones a <10%. Por ejemplo, el aumento del volumen de medicamentos (de 35 μL a 50 μL) puede garantizar que los medicamentos lleguen a todo el páncreas. El uso de una jeringa de insulina y un tamaño de aguja más pequeño (31G) reduce el daño potencial al conducto pancreático y la fuga de bilis en la vesícula biliar o el abdomen, lo que probablemente causaría la muerte del ratón dentro de los primeros días después de la cirugía. El pinzamiento de ambos extremos del conducto biliar puede evitar que el TNBS se filtre a la vesícula biliar y al intestino, lo que puede causar mortalidad. Los clips hemo restringen el TNBS dentro del páncreas inyectado, mejorando la eficacia al tiempo que reducen los daños a otros tejidos. Además, el TNBS no es estable a temperaturas superiores a 0 °C. Por lo tanto, mediante el uso de TNBS recién preparado, la inducción cp logró resultados estables.
Este protocolo induce eficazmente la PC en ratones machos C57BL / 6J a las 8-12 semanas de edad y genera un modelo que imita los principales síntomas de la pancreatitis crónica, incluida la pérdida de peso corporal, la atrofia pancreática, la fibrosis y el probable dolor abdominal. En comparación con otros modelos de ratón CP, el modelo TNBS es ampliamente utilizado para evaluar los efectos analgésicos además de la inflamación10,15,16. La otra ventaja del modelo TNBS es que el fármaco se inyecta directamente en el páncreas, lo que reduce el daño a otros órganos que pueden interferir con el estudio17. Este modelo de ratón TNBS CP se puede utilizar para estudiar la patogénesis, así como las opciones de tratamiento junto con otros modelos de pancreatitis crónica.
Una limitación de este estudio es que solo se utilizaron ratones entre 8-10 semanas de edad. Dado que los ratones de diferentes edades pueden tener diferentes tamaños de páncreas, lo que en consecuencia afecta el desarrollo de TNBS-CP. Por lo tanto, es necesario probar si los ratones de diferentes edades / tamaños deben recibir una dosis diferente de TNBS. Sin embargo, este estudio demuestra los procedimientos para realizar con éxito la infusión del conducto pancreático que pueden ayudar con los estudios centrados en las enfermedades pancreáticas.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Veteranos (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536), y el Instituto Nacional de Salud otorga subvenciones # 1R01DK105183, DK120394 y DK118529 a HW. Agradecemos al Dr. Hongju Wu por compartir experiencias técnicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
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