Summary
Kronik pankreatit (CP), genellikle inatçı karın ağrısı ile ilişkili olan pankreasın iltihabı ve fibrozisi ile karakterize bir hastalıktır. Bu makalede, 2,4,6 -trinitrobenzen sülfiyonik asit (TNBS) ile safra kanalı infüzyonu yoluyla CP'nin fare modelini oluşturma tekniğinin iyileştirilmesine odaklanmaktadır.
Abstract
Kronik pankreatit (CP), pankreas iltihabı ve fibrozis, glandüler atrofi, karın ağrısı ve diğer semptomları içeren karmaşık bir hastalıktır. Safra kanalı 2,4,6 -trinitrobenzen sülfikonik asit (TNBS) infüzyon modelinin CP'de görülen nöropatik ağrının özelliklerini çoğalttığı CP'yi incelemek için çeşitli kemirgen modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, farelerde safra yolu ilaç infüzyonu teknik olarak zordur. Bu protokol, cp fare modeli üretimi için safra kanalı TNBS infüzyon prosedürünü gösterir. TNBS, duodenumdaki Vater ampullası aracılığıyla pankreasa aşılandı. Bu protokol, işlem sırasında ilaç hacmini, cerrahi teknikleri ve ilaç kullanımını optimize etti. TNBS ile tedavi edilen fareler, vücut ağırlığı ve pankreas kilo azalmaları, ağrıya bağlı davranışlardaki değişiklikler ve anormal pankreas morfolojisi ile yansıtıldığı gibi CP özellikleri gösterdi. Bu gelişmelerle TNBS enjeksiyonu ile ilişkili mortalite en az düzeydeydi. Bu prosedür sadece pankreas hastalığı modellerinin oluşturulmasında kritik değildir, aynı zamanda lokal pankreas ilacı dağıtımında da yararlıdır.
Introduction
Kronik pankreatit (CP), pankreas atrofisi, fibrozis, karın ağrısı ve hem ekzokrin hem de endokrin fonksiyonların nihai kaybı ile karakterize kronik bir enflamatuar hastalıktır1. Mevcut tıbbi ve cerrahi tedaviler iyileştirici değildir, ancak hastalığın sonucu olan semptomları hafifletmek için üstlenilir: refrakter karın ağrısı, endokrin ve ekzokrin disfonksiyon. Bu nedenle, acilen daha etkili tedavilere ihtiyaç vardır2. Hayvan modelleri, hastalığın daha iyi anlaşılması ve potansiyel terapötiklerin araştırılması için gerekli bir araç sağlar3. CP için cerulein ve/veya alkol modellerinin yaygın olarak kullanıldığı birden fazla fare modeli geliştirilmiştir. Bir oligopeptid uyarıcı pankreas salgısı olan Cerulein'in, pankreas atrofisi, fibrozis içeren bir CP modelini tekrar tekrar teşvik ettiği gösterilmiştir4. Başka bir yaygın model, insan hastalarda gözlemlenene benzer ekzokrin yetmezlik üreten L-arginin seri enjeksiyonlarını kullanır5. CP ayrıca komple veya kısmi pankreas kanalı ligasyonu ve pankreas kanalıhipertansiyonu 6,7ile de indüklenebilir. CP için mevcut hayvan modellerinin çeşitliliğine rağmen, bu modellerin hiçbiri CP hastalarının yaşadığı karın ağrısını etkili bir şekilde yeniden üretmez8.
Önceki çalışmalar, 2,4,6 -trinitrobenzen sülfikonik asit (TNBS) lokal pankreas enjeksiyonunun CP hastalarının yaşadığı kalıcı ağrıyı9, 10,11çoğaldığını göstermiştir. TNBS ile tedavi edilen fareler, karın aşırı duyarlılığı ve ağrıya bağlı davranışların artmasının yanı sıra, CP hastalarında gözlenen bir fenomen olan ağrılı uyaranlara "genelleştirilmiş aşırı duyarlılık" göstermiştir10. CP ağrısını doğru bir şekilde taklit etmenin yanı sıra, TNBS modeli ayrıca fibrozis, mononükleer hücre infiltrasyon ve acınar hücrelerin yağ dokusu ile değiştirilmesi gibi insan durumunun diğer patolojik özelliklerini de çoğaltır10,12. Bununla birlikte, safra kanalı ile TNBS infüzyonu, farelerde ölüme neden olabilecek teknik olarak zorlu bir prosedürdür. Bilgimize göre, safra kanalı infüzyonunun nasıl yapıldığını gösteren görsel bir protokol yoktur. Bu yazıda, bir CP fare modeli oluşturmak için TNBS safra kanalı infüzyonunun prosedürünü gösteriyoruz. Bu prosedür CP ve diğer pankreas hastalıklarının incelenmesi için değerli hayvan modelleri üretmeye yardımcı olacak ve pankreas13'ediğer malzemeleri (örneğin virüs, hücreler) aşılamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi ve Ralph H. Johnson Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin onayıyla gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8-10 haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanılmıştır. Fareler, yiyecek ve suya reklam libitumaccess ile standart bir 12 ışık / 12 karanlık döngü altında barındırıldı.
1. Enjeksiyon için TNBS çözeltisinin hazırlanması
- % 0.9 salin içinde% 10 etanol hazırlayın. %10 etanol 1 mL'ye 7,5 μL TNBS ekleyerek stok TNBS'yi (bkz. Malzeme Tablosu)%10 etanol içinde 7,5 mM'lik nihai konsantrasyonda çözün.
DİkKAT: TNBS kimyasal bir tehlike oluşturur. Çözeltiyi bir duman kaputunun içine hazırlayın ve TNBS ile doğrudan teması önlemek için eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipmanlar kullanın. - 50 μL%0,75 TNBS çözeltisini 31 kalibrelik bir iğne ile bir insülin şırıngasına yükleyin. Salin içinde araç kontrolü ile aynı boyutta bir şırınna 50 μL%10 etanol yükleyin. Şırınnaları buza yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar ışıktan koruyun.
2. Fare hazırlama ve ameliyat
- Karın cerrahi bölgesinden saçları tıraş edin.
- Ameliyattan önce analjezik dozda (örneğin, buprenorfin 0.1 mg/kg i.p.) bir adet önceden enjekte edin.
- Fareyi% 1.5-2 izofluran ve 1 L / dk oksijen ile genel anestezi altında indükle ve koruyun. Parmakları sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği nedeniyle gözlemleyerek anesteziyi onaylayın.
- Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. Fare anestezi altındayken her göze veteriner merhem uygulayın.
- Cerrahi bölgeyi %2 iyotla 3x silerek, ardından %70 alkol(Malzeme Masası)ile dezenfekte edin.
- 0,5-1 cm'lik bir kesi oluşturmak için mikro makasla laparotomi gerçekleştirin.
- Duodenumu hafifçe maruz bırak ve pamuklu çubuklar ( Malzeme Masası ) kullanarak ortak safrakanalınıbulun.
- TNBS veya araççözeltilerininkaraciğere ve safra kesesine akışını önlemek için proksimal ortak kanalın üzerine düz bir mikro hemo klipsi ( Malzeme Tablosu ) yerleştirin (Şekil 1A, B).
- Duodenumu hafifçe maruz koyun ve iğneyi Vater'in papillası aracılığıyla pankreas kanalına yerleştirin.
- İğne kanalın içine girdikten sonra, iğneyi yerine sabitlemek ve enjekte edilençözeltininduodenuma girmesini önlemek için iğneyi çevreleyen duodenumun üzerine kavisli bir mikro hemo klipsi(Malzeme Tablosu ) yerleştirin .
- Çözeltiyi (TNBS veya araç) bir dakika boyunca pankreas kanalına yavaş yavaş aşılayın.
NOT: TNBS'nin bir dakika içinde yavaşça aşılanması gerekir ve pankreas 5/16 inç ve 31G iğneli bir insülin şırıngası ile perfüzyon edildiğinde infüzyon hızını kontrol etmek kolaydır. Safra kanalına batmamak için eli mümkün olduğunca sabit tutun. TNBS başarıyla enjekte edilirse, pankreasın içinde sarı renk görülebilir. - İnfüzyondan sonra, karaciğerin yakınındaki mikro kelepçeyi dikkatlice çıkarın ve ardından iğneyi ve duodenumu tutan mikro kelepçeyi çıkarın.
- Duodenumu dikkatlice orijinal konumuna getirin.
- Duodenumun orijinal konumuna dönmesine yardımcı olmak ve peristalsin iyileşmesine yardımcı olmak için kapanmadan önce karın boşluğunda 0,5 mL sıcak steril salin (36-37 °C) bırakın.
- 5-0 dikiş ile sürekli dikiş kullanarak kas tabakasındaki kesiği kapatın. 4-0 dikiş ile yarıda kalan dikiş kullanarak cildi kapatın.
- Anesteziden iyileşmeyi sağlamak için fareleri içeren kafesi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Farelerin sıcak olduğunu ve bekleme odasına geri dönmeden önce spontan hareket edebildiğini onaylayın.
- Her 12 saatte bir analjezik (örneğin, buprenorfin 0.1 mg/kg i.p.) ve ameliyat sonrası 48 saat için ek ısı sağlamaya devam edin.
3. Fare davranışını izleme
- Ameliyat sonrası 7. günde dikişleri çıkarın.
- Ameliyat sonrası ilk hafta boyunca fare sağlığını ve davranışını günlük olarak izleyin. Seslendirme, kambur sırt duruşu veya daha az hareket etme gibi sıkıntı belirtilerine dikkat edin. Vücut ağırlığını her gün ölçün.
- Von Frey monofilamentlerini (VFF' ler) karın mekanik aşırı duyarlılığını ölçmek için kullanın ve ameliyat sonrası9,14olarak tanımlandığı gibi2,3 hafta.
- Her 1-2 sn'de 10x olan üst karın bölgesine artan sırada farklı uygulanan kuvvetlerin VFF'lerini uygulayın. Karnın yükseltilmesini, geri çekilmesini veya yalamasını (çekilme yanıtı) olumlu bir yanıt olarak düşünün.
- Olumlu bir yanıt gözlenmezse daha güçlü bir uyaran, olumlu bir yanıt gözlenirse daha zayıf bir uyaran uygulayın. Çekilme eşiği, farenin zamanın% 50'sini yanıtladığı kuvvettir.
4. Pankreas dokusunun toplanması ve histolojik analizi
- Servikal çıkık ile anestezi altındaki fareleri kurban edin ve pankreası bağırsaktan ve diğer organlardan dikkatlice parçalara ayırmayın.
- Pankreası 24 saat boyunca% 10 paraformaldehitte sabitleyin, parafin içine gömün, 5 μm kalınlığında doku bölümlerini kesin ve boyama için cam slaytlara yerleştirin.
- Hematoksilin-eosin ve Masson'un üç renkli boyamasını daha önce bildirildiği gibi standart yöntemler kullanarak gerçekleştirin4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Safra kanalı infüzyon prosedürleri, bu prosedürle ilişkili fare mortalitesini azaltmak için optimize edilmiştir10. TNBS ilk olarak toplam 35 μL veya 50 μL hacimde verildi. TNBS'nin 50 μL'lik bir hacimde enjeksiyonu tüm pankreasa ulaşabilir ve daha homojen bir hastalık fenotipine neden olabilir (Şekil 1B). Ek olarak, 31G iğne ile insülin şırıngası kullanılarak TNBS enjeksiyonu, düzenli şırıngalara ve iğne boyutlarına göre infüzyon hızını daha iyi kontrol edebilir. Buz üzerinde saklanan ve ilaç hazırlandıktan sonraki bir saat içinde kullanılan taze hazırlanmış TNBS, bir saatten uzun süre hazırlanan TNBS'ye kıyasla daha iyi sonuç verdi. Bu gelişmelerle alıcıların mortalitesi kontrol altına alındı ve %10'un altında kaldı.
Vücut ağırlığı kaybı CP'nin özelliklerinden biridir. Kontrol grubundaki fareler ameliyattan sonraki ilk 3 gün boyunca orijinal vücut ağırlıklarının yaklaşık% 6'sını kaybettiler, daha sonra yavaş yavaş iyileştiler (21. günde orijinal vücut ağırlığının% 104.6'sı) (Şekil 1C). Buna karşılık, TNBS alan fareler ilk 5 gün boyunca orijinal vücut ağırlıklarının ortalama% 15'ini kaybettiler ve daha sonra kilo aldı (21. günde orijinal vücut ağırlığının% 99.8'i) (Şekil 1C). Ek olarak, kontrollere kıyasla, TNBS fareleri, TNBS enjeksiyonundan 2 ve 3 hafta sonra karın mekanik aşırı duyarlılığının arttığını göstermiştir (Şekil 1D), muhtemelen artan karın ağrısı ile ilişkiliydi10.
Safra kanalı TNBS infüzyonunun insan CP'yi taklit eden pankreas değişikliklerini etkili bir şekilde tetiklediğini doğrulamak için, ameliyat sonrası 3 haftada TNBS veya araç tedavili kontrol farelerinden pankreas dokuları topladık. Pankreasın vücut ağırlığı başına hem boyut hem de ağırlık, TNBS farelerinde kontrollere kıyasla önemli ölçüde azaldı (Şekil 2A, B), şiddetli ve uzun süreli CP'li insanlardaki bulgularla tutarlı belirgin pankreas atrofisi olduğunu düşündürdü. Ek olarak, kontrol farelerinden gelen pankreas belirgin morfolojik değişiklikler olmadan normal olarak ortaya çıkarken, TNBS fareleri yağ hücresi infiltasyonu ve fibrozis ile değiştirilen büyük acınar hücre kaybı ile vakuolizasyon gösterdi (Şekil 2C). Bu bulgular diğer çalışmalardan elde edilen raporlarla tutarlıydı9,10.
Şekil 1: CP fare üretimi için TNBS safra yolu infüzyonu. (A) Safra kanalı enjeksiyonunun illüstrasyonu. (B) Safra kanalı 50 μL mürekkep enjeksiyonundan sonra. (C) TNBS veya araç alan farelerde vücut ağırlığı değişiminin ortalamaları. (D) TNBS'de abdominal yanıt eşiği ve infüzyondan 3 hafta sonra fareleri kontrol eder. Veriler mevcut analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi (örneğin, GraphPad 8.2.1). Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır <. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. TNBS ile tedavi edilen farelerde CP karakterizasyonu. (A) Kontrolden pankreasın mikrografileri (TO) ve TNBS fareleri. (B) TO ve TNBS farelerinde ortalama pankreas ağırlığı fare vücut ağırlığına bölünür. (C) CTR ve TNBS farelerinin pankreas bölümlerinin hematoksilin ve eozin lekesi. Ölçek çubuğu =100 μm. Veriler, Öğrenci t testi tarafından ortalama ± SEM. **, s < 0.01 olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronik pankreatit indükle etmek için TNBS'nin safra kanalı infüzyonu, farelerde teknik olarak zordur, çünkü farelerin% 22,5'i ilaç infüzyonunun 3-4 gün içinde ölebilir10. Burada, bu rapor önceki çalışmalara dayanarak prosedürü iyileştirdi ve erken fare ölüm oranını% <10'a düşürdü. Örneğin, artan ilaç hacmi (35 μL'den 50μL'ye kadar) ilaçların tüm pankreasa ulaşmasını sağlayabilir. Bir insülin şırıngası ve daha küçük bir iğne boyutu (31G) kullanmak, pankreas kanalına potansiyel hasarı ve safra kesesine veya karın içine safra sızdırmasını azaltır, bu da büyük olasılıkla ameliyattan sonraki ilk birkaç gün içinde farenin ölümüne neden olur. Safra kanalının her iki ucunun kenetlenerek TNBS'nin safra kesesine ve bağırsaca sızmasını önleyebilir ve bu da mortaliteye neden olabilir. Hemo klipsleri, enjekte edilen pankreas içindeki TNBS'yi dizginleyerek etkinliği artırırken diğer dokulardaki hasarları azaltır. Ek olarak, TNBS 0 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda stabil değildir. Bu nedenle, yeni hazırlanmış TNBS kullanılarak CP indüksiyonu kararlı sonuçlar elde etti.
Bu protokol, erkek C57BL/6J farelerde 8-12 haftalıkken CP'yi etkili bir şekilde indükler ve vücut ağırlığı kaybı, pankreas atrofisi, fibrozis ve olası karın ağrısı da dahil olmak üzere kronik pankreatitin önemli semptomlarını taklit eden bir model oluşturur. Diğer CP fare modelleriyle karşılaştırıldığında, TNBS modeli iltihap10 , 15,16'yaek olarak analjezik etkileri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. TNBS modelinin diğer avantajı, ilacın doğrudan pankreasa enjekte edilmiş olmasıdır, bu da çalışmaya müdahale edebilecek diğer organların hasarını azaltır17. Bu TNBS CP fare modeli, patogenezin yanı sıra diğer kronik pankreatit modelleri ile birlikte tedavi seçeneklerini incelemek için kullanılabilir.
Bu çalışmanın bir sınırlaması, sadece 8-10 haftalık farelerin kullanılmış olmasıdır. Farklı yaşlardaki fareler farklı pankreas boyutlarına sahip olabileceğinden, bu da TNBS-CP gelişimini etkiler. Bu nedenle farklı yaş/boyutlardaki farelere farklı dozda TNBS verilip verilmemesi gerektiğinin test edilmesi gerekir. Bununla birlikte, bu çalışma pankreas hastalıklarına odaklanan çalışmalara yardımcı olabilecek pankreas kanalı infüzyonunu başarıyla gerçekleştirme prosedürlerini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Gazi İşleri Bakanlığı (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir # 1R01DK105183, DK120394 ve DK118529'dan HW'ye. Dr. Hongju Wu'ya teknik deneyimlerini paylaştığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
