Summary
Chronische pancreatitis (CP) is een ziekte die wordt gekenmerkt door ontsteking en fibrose van de alvleesklier, vaak geassocieerd met hardnekkige buikpijn. Dit artikel richt zich op het verfijnen van de techniek om een muismodel van CP te genereren via galweginfusie met 2,4,6 -trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS).
Abstract
Chronische pancreatitis (CP) is een complexe ziekte waarbij alvleesklierontsteking en fibrose, glandulaire atrofie, buikpijn en andere symptomen betrokken zijn. Verschillende knaagdiermodellen zijn ontwikkeld om CP te bestuderen, waarvan het galkanaal 2,4,6 -trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) infusiemodel de kenmerken van neuropathische pijn repliceert die bij CP worden gezien. Galweg medicijninfusie bij muizen is echter technisch uitdagend. Dit protocol demonstreert de procedure van galweg TNBS-infusie voor het genereren van een CP-muismodel. TNBS werd toegediend in de alvleesklier via het ampulla van Vater in de twaalfvingerige darm. Dit protocol optimaliseerde het medicijnvolume, chirurgische technieken en medicijnbehandeling tijdens de procedure. Met TNBS behandelde muizen vertoonden kenmerken van CP zoals weerspiegeld door gewichtsverminderingen van het lichaamsgewicht en de alvleesklier, veranderingen in pijngerelateerd gedrag en abnormale pancreasmorfologie. Met deze verbeteringen was de mortaliteit geassocieerd met TNBS-injectie minimaal. Deze procedure is niet alleen van cruciaal belang bij het genereren van pancreasziektemodellen, maar is ook nuttig bij de lokale toediening van pancreasgeneesmiddelen.
Introduction
Chronische pancreatitis (CP) is een chronische ontstekingsziekte die wordt gekenmerkt door de atrofie van de alvleesklier, fibrose, buikpijn en uiteindelijk verlies van zowel exocriene als endocriene functies1. De huidige medische en chirurgische behandelingen zijn niet curatief, maar worden uitgevoerd om symptomen te verlichten die het gevolg zijn van de ziekte: refractaire buikpijn, endocriene en exocriene disfunctie. Daarom zijn effectievere behandelingen dringend nodig2. Diermodellen bieden een essentieel hulpmiddel voor het ontwikkelen van een beter begrip van de ziekte en het onderzoeken van potentiële therapieën3. Er zijn meerdere muismodellen voor CP ontwikkeld, waarvan ceruleïne- en/of alcoholmodellen veel worden gebruikt. Van ceruleïne, een oligopeptide dat de secretie van de alvleesklier stimuleert, is aangetoond dat het reproduceerbaar een CP-model induceert met pancreasatrofie, fibrose, onder andere4. Een ander veel voorkomend model maakt gebruik van seriële injecties van L-arginine, die exocriene insufficiëntie produceert die vergelijkbaar is met die waargenomen bij menselijke patiënten5. CP kan ook worden geïnduceerd door volledige of gedeeltelijke ligatie van de ductus pancreatischeul,- en pancreaskanaalhypertensie6,7. Ondanks de verscheidenheid aan diermodellen die beschikbaar zijn voor CP, reproduceert geen van deze modellen effectief de buikpijn die wordt ervaren door CP-patiënten8.
Eerdere studies toonden aan dat lokale pancreasinjectie van 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) de aanhoudende pijn repliceert die wordt ervaren door CP-patiënten9,10,11. Met TNBS behandelde muizen vertoonden abdominale overgevoeligheid en verhoogd pijngerelateerd gedrag, evenals een "gegeneraliseerde overgevoeligheid" voor pijnlijke stimuli, een fenomeen dat is waargenomen bij CP-patiënten10. Naast het nauwkeurig nabootsen van CP-pijn, repliceert het TNBS-model ook andere pathologische kenmerken van de menselijke conditie, zoals fibrose, mononucleaire celinfiltratie en vervanging van acinaire cellen door vetweefsel10,12. TNBS-infusie via galwegen is echter een technisch uitdagende procedure bij muizen die de dood kan veroorzaken. Voor onze weten is er geen visueel protocol om aan te tonen hoe galweginfusie wordt uitgevoerd. In dit artikel demonstreren we de procedure van de gal-duction infusie van TNBS om een CP-muismodel te genereren. Deze procedure zal helpen bij het genereren van waardevolle diermodellen voor de studie van CP en andere pancreasziekten en kan worden gebruikt om andere materialen (bijv. Virus, cellen) in de pancreas te injecteren13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committees aan de Medical University of South Carolina en het Ralph H. Johnson Medical Center. C57BL/6J mannelijke muizen tussen de 8-10 weken oud werden gebruikt in deze studie. Muizen werden gehuisvest onder een standaard 12 licht / 12 donkere cyclus met ad libitumtoegang tot voedsel en water.
1. Bereiding van TNBS oplossing voor injectie
- Bereid 10% ethanol in 0,9% zoutoplossing. Los voorraad TNBS (zie Tabel met materialen) op in 10% ethanol tot een eindconcentratie van 7,5 mM door 7,5 μL TNBS toe te voegen aan 1 ml 10% ethanol.
LET OP: TNBS vormt een chemisch gevaar. Bereid de oplossing in een zuurkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, brillen en een laboratoriumjas om direct contact met TNBS te voorkomen. - Laad 50 μL 0,75% TNBS-oplossing in een insulinespuit met een naald van 31 gauge. Laad 50 μL 10% ethanol in zoutoplossing in een spuit van dezelfde grootte als de voertuigbesturing. Plaats de spuiten op ijs en bescherm ze tegen licht totdat ze nodig zijn.
2. Muisvoorbereiding en chirurgie
- Scheer het haar van de abdominale operatieruimte.
- Injecteer één preventieve dosis van het pijnstillend (bijv. buprenorfine 0,1 mg/kg i.p.) vóór de operatie.
- Induceer en onderhoud de muis onder algemene anesthesie met 1,5-2% isofluraan en 1 l/min zuurstof. Bevestig de verdoving door in de tenen te knijpen en het dier te observeren op een gebrek aan reflex.
- Plaats de muis tijdens de operatie op een verwarmde chirurgische pad. Breng veterinaire zalf aan op elk oog wanneer de muis onder narcose is.
- Desinfecteer de operatieplaats door het operatiegebied 3x af te vegen met 2% jodium, gevolgd door 70% alcohol(Tabel met materialen).
- Voer een laparotomie uit met een microschaar om een incisie van 0,5-1 cm te genereren.
- Leg de twaalfvingerige darm voorzichtig bloot en lokaliseer het gemeenschappelijke galkanaal met behulp van wattenstaafjes(Tabel met materialen).
- Plaats een rechte micro hemoclip(Materiaaltabel)over het proximale gemeenschappelijke kanaal om de stroom van TNBS of voertuigoplossingen in de lever en de galblaas te voorkomen(Figuur 1A,B).
- Leg de twaalfvingerige darm voorzichtig bloot en steek de naald in het pancreaskanaal via de papilla van Vater.
- Zodra de naald zich in het kanaal bevindt, plaatst u een gebogen microhemoclip(Materialentabel)over de twaalfvingerige darm rond de naald(figuur 1A)om de naald op zijn plaats te houden en te voorkomen dat de geïnjecteerde oplossing in de twaalfvingerige darm terechtkomt.
- Injecteer de oplossing (TNBS of vehikel) geleidelijk in de ductus pancreatische buiging in de loop van een minuut.
OPMERKING: TNBS moet langzaam worden toegediend gedurende een minuut tijd, en het is gemakkelijk om de infusiesnelheid te regelen wanneer de alvleesklier wordt doordrenkt met een insulinespuit met een 5/16 inch en 31G naald. Houd de hand zo stabiel mogelijk om te voorkomen dat je in de galwegen prikt. Als TNBS met succes wordt geïnjecteerd, kan de gele kleur zichtbaar zijn in de alvleesklier. - Verwijder na infusie voorzichtig de microklem in de buurt van de lever en verwijder vervolgens de microklem die de naald en de twaalfvingerige darm vasthoudt.
- Breng de twaalfvingerige darm voorzichtig terug naar zijn oorspronkelijke positie.
- Laat 0,5 ml warme steriele zoutoplossing (36-37 °C) in de buikholte voor sluiting, om de twaalfvingerige darm te helpen terugkeren naar zijn oorspronkelijke positie en te helpen bij het herstel van de peristaltiek.
- Sluit de incisie in de spierlaag met behulp van een continue hechting met een 5-0 steek. Sluit de huid met een onderbroken hechting met een 4-0 hechting.
- Plaats de kooi met muizen op een verwarmingskussen om herstel van de anesthesie mogelijk te maken.
- Bevestig dat de muizen warm zijn en in staat tot spontane beweging voordat u ze terugbrengt naar de wachtkamer.
- Blijf elke 12 uur een pijnstillend zuur (bijv. buprenorfine 0,1 mg / kg i.p.) en aanvullende warmte gedurende 48 uur na de operatie.
3. Het gedrag van muizen controleren
- Verwijder hechtingen op dag 7 na de operatie.
- Controleer de gezondheid en het gedrag van muizen dagelijks tijdens de eerste week na de operatie. Let op tekenen van nood, zoals vocaliseren, gebogen rughouding of verminderde voortbeweging. Meet het lichaamsgewicht om de dag.
- Gebruik Von Frey monofilamenten (VFF's) om abdominale mechanische overgevoeligheid vóór en 2, 3 weken na de operatie te meten zoals beschreven9,14.
- Breng VFF's van verschillende toegepaste krachten in oplopende volgorde 10x elke 1-2 s aan op de bovenste buikstreek. Beschouw het opheffen, intrekken of likken van de buik (ontwenningsreactie) als een positieve reactie.
- Pas een sterkere stimulus toe als er geen positieve respons wordt waargenomen en een zwakkere stimulus als een positieve respons wordt waargenomen. De opnamedrempel is de kracht waarmee de muis 50% van de tijd reageert.
4. Verzameling en histologische analyse van pancreasweefsel
- Offer de muizen op onder anesthesie door cervicale dislocatie en ontleed de alvleesklier zorgvuldig uit de darm en andere organen.
- Fixeer de alvleesklier gedurende 24 uur in 10% paraformaldehyde, sluit ze in paraffine, snijd weefselsecties van 5 μm dikte en plaats ze op glazen dia's voor kleuring.
- Voer hematoxyline-eosine en Masson's trichrome kleuring uit met behulp van standaardmethoden zoals eerder gemeld4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De galweginfusieprocedures werden geoptimaliseerd om de sterfte bij muizen geassocieerd met deze procedure te verminderen10. TNBS werd eerst gegeven in een totaal volume van 35 μL of 50 μL. Injectie van TNBS in een volume van 50 μL kan de hele alvleesklier bereiken en een homogener ziektefenotype induceren(figuur 1B). Bovendien kan injectie van TNBS met behulp van insulinespuit met 31G-naald de infusiesnelheid beter regelen in vergelijking met gewone spuiten en naaldformaten. Vers bereide TNBS opgeslagen op ijs en gebruikt binnen een uur na medicijnbereiding leverde ook een beter resultaat op in vergelijking met TNBS dat langer dan een uur werd bereid. Met deze verbeteringen werd de mortaliteit van de ontvangers onder controle gehouden en bleef deze onder de 10%.
Gewichtsverlies is een van de kenmerken van CP. Muizen in de controlegroep verloren ongeveer 6% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht tijdens de eerste 3 dagen na de operatie en herstelden vervolgens geleidelijk (104,6% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht op dag 21) (Figuur 1C). Muizen die TNBS kregen, verloren daarentegen gemiddeld ongeveer 15% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht tijdens de eerste 5 dagen en herwonnen daarna (99,8% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht op dag 21) (figuur 1C). Bovendien vertoonden TNBS-muizen, in vergelijking met controles, verhoogde abdominale mechanische overgevoeligheid na 2 en 3 weken na TNBS-injectie(figuur 1D),wat waarschijnlijk geassocieerd was met verhoogde buikpijn10.
Om te bevestigen dat de galweg TNBS-infusie effectief pancreasveranderingen veroorzaakte die menselijke CP nabootsen, verzamelden we pancreasweefsels van TNBS of met voertuigen behandelde controlemuizen 3 weken na de operatie. Zowel de grootte als het gewicht per lichaamsgewicht van de alvleesklier waren significant verminderd bij TNBS-muizen in vergelijking met controles(figuur 2A,B),wat wijst op duidelijke pancreasatrofie in overeenstemming met de bevindingen bij mensen met ernstige en langdurige CP. Bovendien leek de alvleesklier van de controlemuizen normaal zonder duidelijke morfologische veranderingen, terwijl TNBS-muizen vacuolisatie vertoonden met massaal verlies van acinaire cellen vervangen door vetcelinfiltratie en fibrose(figuur 2C). Deze bevindingen kwamen overeen met rapporten uit andere studies9,10.
Figuur 1: TNBS galweginfusie voor cp-muizengeneratie. (A) Illustratie van galweginjectie. (B) Galkanaal na injectie van 50 μL inkt. (C)Gemiddelden van de verandering in lichaamsgewicht bij muizen die TNBS of vehikel krijgen. DAbdominale responsdrempel bij TNBS en controlemuizen 3 weken na infusie. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van beschikbare analysesoftware (bijv. GraphPad 8.2.1). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van de Student's t-test, ** p < 0,01 werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Karakterisering van CP in met TNBS behandelde muizen. (A)Microfoto's van de alvleesklier van controle (CTR) en TNBS muizen. (B)Het gemiddelde alvleeskliergewicht gedeeld door het lichaamsgewicht van de muis in CTR- en TNBS-muizen. (C)Hematoxyline en eosinekleuring van pancreassecties van CTR- en TNBS-muizen. Schaalbalk = 100 μm. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. **, p < 0,01 door de t-test van student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Galweginfusie van TNBS om chronische pancreatitis te induceren is technisch uitdagend bij muizen, omdat tot 22,5% van de muizen binnen 3-4 dagen na medicijninfusie kan sterven10. Hier verfijnde dit rapport de procedure op basis van eerdere studies en verminderde de vroege muizensterfte tot <10%. Het verhoogde medicijnvolume (van 35 μL tot 50μL) kan er bijvoorbeeld voor zorgen dat de medicijnen de hele alvleesklier bereiken. Het gebruik van een insulinespuit en een kleinere naaldgrootte (31G) vermindert mogelijke schade aan de pancreaskanalen en het lekken van gal in de galblaas of de buik, wat hoogstwaarschijnlijk de dood van muizen zou veroorzaken binnen de eerste paar dagen na de operatie. Het klemmen van beide uiteinden van de galwegen kan voorkomen dat TNBS lekt naar de galblaas en de darm, wat sterfte kan veroorzaken. De hemoclips houden TNBS in de geïnjecteerde alvleesklier vast, waardoor de werkzaamheid wordt verbeterd en schade aan andere weefsels wordt verminderd. Bovendien is TNBS niet stabiel bij temperaturen boven 0 °C. Door het gebruik van vers bereide TNBS bereikte CP-inductie daarom stabiele resultaten.
Dit protocol induceert effectief CP bij mannelijke C57BL / 6J-muizen op de leeftijd van 8-12 weken en genereert een model dat belangrijke symptomen van chronische pancreatitis nabootst, waaronder lichaamsgewichtverlies, pancreasatrofie, fibrose en waarschijnlijke buikpijn. In vergelijking met andere CP-muismodellen wordt het TNBS-model veel gebruikt om pijnstillende effecten te evalueren naast ontsteking10,15,16. Het andere voordeel van het TNBS-model is dat het medicijn rechtstreeks in de alvleesklier wordt geïnjecteerd, wat schade aan andere organen vermindert die de studie kunnen verstoren17. Dit TNBS CP-muismodel kan worden gebruikt om pathogenese en behandelingsopties samen met andere chronische pancreatitismodellen te bestuderen.
Een beperking van deze studie is dat alleen muizen tussen de 8-10 weken oud werden gebruikt. Omdat muizen op verschillende leeftijden verschillende pancreasgroottes kunnen hebben, die bijgevolg de ontwikkeling van TNBS-CP beïnvloeden. Daarom moet worden getest of muizen van verschillende leeftijden/maten een andere dosis TNBS moeten krijgen. Niettemin toont deze studie de procedures aan om met succes pancreaskanaalinfusie uit te voeren die kunnen helpen bij studies gericht op pancreasaandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) en het National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394 en DK118529 aan HW. We bedanken Dr. Hongju Wu voor het delen van technische ervaring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
