Summary
Kronisk bukspottkörtelinflammation (CP) är en sjukdom som kännetecknas av inflammation och fibros i bukspottkörteln, ofta associerad med svårbehandlad buksmärta. Denna artikel fokuserar på att förfina tekniken för att generera en musmodell av CP via gallgångsinfusion med 2,4,6 -trinitrobensulfonsyra (TNBS).
Abstract
Kronisk bukspottkörtelinflammation (CP) är en komplex sjukdom som involverar bukspottskörtelinflammation och fibros, körtel atrofi, buksmärta och andra symtom. Flera gnagare modeller har utvecklats för att studera CP, varav gallgången 2,4,6 -trinitrobenzen sulfonic acid (TNBS) infusionsmodell replikerar funktionerna i neuropatisk smärta sett i CP. Gallgångsläkemedelsinfusion hos möss är dock tekniskt utmanande. Detta protokoll visar förfarandet för gallgång TNBS infusion för generering av en CP mus modell. TNBS infunderades i bukspottkörteln genom ampullen vater i årondenum. Detta protokoll optimerade läkemedelsvolym, kirurgiska tekniker och läkemedelshantering under proceduren. TNBS-behandlade möss visade funktioner i CP som återspeglas av kroppsvikt och bukspottkörtel viktminskning, förändringar i smärta-associerade beteenden och onormal bukspottskörteln morfologi. Med dessa förbättringar var dödligheten i samband med TNBS injektion minimal. Detta förfarande är inte bara avgörande för att generera modeller för bukspottskörtelsjukdomar utan är också användbart vid lokal läkemedelsleverans av bukspottskörteln.
Introduction
Kronisk bukspottkörtelinflammation (CP) är en kronisk inflammatorisk sjukdom som kännetecknas av bukspottkörtelns atrofi, fibros, buksmärta och eventuell förlust av både exokrina och endokrina funktioner1. Nuvarande medicinska och kirurgiska behandlingar är inte botande men utförs för att lindra symtom som är följden av sjukdomen: eldfast buksmärta, endokrin och exokrin dysfunktion. Därför behövs effektivare behandlingar brådskande2. Djurmodeller är ett viktigt verktyg för att utveckla en bättre förståelse av sjukdomen och undersöka potentiella terapier3. Flera musmodeller för CP har utvecklats, varav cerulein- och/eller alkoholmodeller används ofta. Cerulein, en oligopeptidstimulerande bukspottskörtelsekretion, har visat sig reproducerbart inducera en CP-modell med bukspottskörteln atrofi, fibros, blandandra 4. En annan vanlig modell använder seriella injektioner av L-arginin, som producerar exocrine otillräcklighet liknar den som observerats hos mänskliga patienter5. CP kan också induceras genom fullständig eller partiell bukspottskörtelkanal ligatur, liksom bukspottskörteln kanal hypertoni6,7. Trots de olika djurmodeller som finns tillgängliga för CP, reproducerar ingen av dessa modeller effektivt buksmärtan som upplevs av CP-patienter8.
Tidigare studier visade att lokal bukspottskörtelinjektion av 2,4,6-trinitrobensulfonsyra (TNBS) replikerar den ihållande smärtan hos CP-patienter 9,10,11. TNBS-behandlade möss visade buken överkänslighet och ökade smärtrelaterade beteenden samt en "generaliserad överkänslighet" mot smärtsamma stimuli, ett fenomen som har observerats hos CP patienter10. Förutom att noggrant efterlikna CP-smärta replikerar TNBS-modellen också andra patologiska egenskaper hos det mänskliga tillståndet som fibros, mononukleär cellinfiltration och ersättning av acinarceller medfettvävnad 10,12. TNBS infusion via gallgång är dock ett tekniskt utmanande förfarande hos möss som kan orsaka dödsfall. Vår kännedom om det finns inget visuellt protokoll som visar hur gallgångsinfusion utförs. I den här artikeln visar vi proceduren för galla duction infusion av TNBS för att generera en CP mus modell. Detta förfarande kommer att bidra till att generera värdefulla djurmodeller för studier av CP och andra bukspottkörtelsjukdomar och kan användas för att ingjuta andra material (t.ex. virus, celler) i bukspottkörteln13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer genomfördes med godkännande av institutionella djurvårds- och användningskommittéer vid Medical University of South Carolina och Ralph H. Johnson Medical Center. C57BL/6J hanmöss mellan 8-10 veckors ålder användes i denna studie. Möss var inrymda under en standard 12 ljus / 12 mörk cykel med ad libitumaccess till mat och vatten.
1. Beredning av TNBS-lösning för injektion
- Förbered 10% etanol i 0,9% saltlösning. Lös upp lager-TNBS (se materialförteckning)i 10 % etanol till en slutlig koncentration på 7,5 mM genom att tillsätta 7,5 μL TNBS i 1 ml 10 % etanol.
VARNING: TNBS utgör en kemisk fara. Förbered lösningen inuti en rökhuv och använd personlig skyddsutrustning som handskar, skyddsglasögon och en labbrock för att undvika direktkontakt med TNBS. - Ladda 50 μL 0,75% TNBS-lösning i en insulinspruta med en 31-gauge nål. Ladda 50 μL 10% etanol i saltlösning i en spruta av samma storlek som fordonets kontroll. Placera sprutorna på is och skydda dem från ljus tills det behövs.
2. Musberedning och kirurgi
- Raka håret från buk operationsområdet.
- Injicera en förebyggande dos av smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin 0, 1 mg/kg i.p.) före operationen.
- Inducera och behåll musen under narkos med 1,5-2% isofluran och 1 L/min syre. Bekräfta bedövningen genom att nypa tårna och observera djuret för brist på reflex.
- Placera musen på en uppvärmd kirurgisk dyna under operationen. Applicera veterinärsalva på varje öga när musen är under anestesi.
- Desinficera operationsstället genom att torka operationsområdet 3x med 2% jod, följt av 70% alkohol(Materialförteckning).
- Utför en laparotomi med mikrosax för att generera ett snitt på 0,5-1 cm.
- Exponera försiktigt årondenumet och lokalisera den gemensamma gallgången med bomullspinne (Materialförteckning).
- Placera en rak mikromjukklämma(Materialförteckning)över den proximala gemensamma kanalen för att förhindra flödet av TNBS- eller fordonslösningar i levern och gallblåsan(figur 1A,B).
- Exponera försiktigt årondenumet och för in nålen i bukspottskörteln genom Vaters papilla.
- När nålen är inne i kanalen, placera en böjd mikromjukklämma(Table of Materials)över det duoden som omger nålen (figur 1A) för att fästa nålen på plats och förhindra att den injicerade lösningen kommer in i årondenumet.
- Gradvis ingjuta lösningen (TNBS eller fordonet) i bukspottskörteln under loppet av en minut.
OBS: TNBS måste infunderas långsamt under en minuts tid, och det är lätt att kontrollera infusionshastigheten när bukspottkörteln är perfused med en insulinspruta med en 5/16 tum och 31G nål. Håll handen så stabil som möjligt för att undvika att sticka gallgången. Om TNBS injiceras framgångsrikt kan gul färg vara synlig inuti bukspottkörteln. - Efter infusionen, ta försiktigt bort mikroklämman nära levern och ta sedan bort mikroklämman som håller nålen och åronden.
- Sätt försiktigt tillbaka åronet i sitt ursprungliga läge.
- Lämna 0,5 ml varm steril saltlösning (36-37 °C) i bukhålan före stängning, för att hjälpa årondenum att återgå till sitt ursprungliga läge och hjälpa till med återhämtning av peristalsis.
- Stäng snittet i muskelskiktet med kontinuerlig sutur med en 5-0 stygn. Stäng huden med avbruten sutur med en 4-0 stygn.
- Placera buret som innehåller möss på en värmedyna för att möjliggöra återhämtning från anestesin.
- Bekräfta att mössen är varma och kan spontana rörelser innan de återvänder till häktet.
- Fortsätt att ge smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin 0, 1 mg/kg i.p.) var 12:e timme och kompletterande värme i 48 timmar efter operationen.
3. Övervaka musbeteende
- Ta bort suturer vid dag 7 efter operationen.
- Övervaka musens hälsa och beteende dagligen under den första veckan efter operationen. Se upp för tecken på ångest som vokalisering, hunched tillbaka hållning eller minskad rörelse. Mät kroppsvikten varannan dag.
- Använd Von Frey monofilament (VFFs) för att mäta buken mekanisk överkänslighet före, och 2, 3 veckor efter kirurgi enligtbeskrivningen 9,14.
- Applicera VFFs av olika tillämpade krafter i stigande ordning till övre bukområdet 10x var 1-2 s. Betrakta höjning, upprullning eller slickning av buken (abstinensrespons) som ett positivt svar.
- Applicera en starkare stimulans om ett positivt svar inte observeras och en svagare stimulans om ett positivt svar observeras. Uttagströskeln är den kraft vid vilken musen svarar 50% av tiden.
4. Insamling och histologisk analys av bukspottskörtelvävnad
- Offra mössen under anestesi genom livmoderhalsförskjutning och dissekera försiktigt bukspottkörteln från tarmarna och andra organ.
- Fixera bukspottkörteln i 10% paraformaldehyd i 24 timmar, bädda in i paraffin, skär vävnadssektioner med 5 μm tjocklek och placera dem på glasrutschbanor för färgning.
- Utför hematoxylin-eosin och Massons trichrome färgning med standardmetoder som tidigare rapporterats4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gallgång infusion förfaranden optimerades för att minska mus dödlighet i samband med detta förfarande10. TNBS gavs först i en total volym på 35 μL eller 50 μL. Injektion av TNBS i en volym av 50 μL kan nå hela bukspottkörteln och inducera en mer homogen sjukdom fenotyp (figur 1B). Dessutom kan injektion av TNBS med insulinspruta med 31G-nål bättre kontrollera infusionshastigheten i förhållande till vanliga sprutor och nålstorlekar. Nyberedda TNBS lagrade på is och används inom en timme efter läkemedelspreparat gav också bättre resultat jämfört med TNBS beredda längre än en timme. Med dessa förbättringar kontrollerades mottagarnas dödlighet och förblev under 10%.
Kroppsvikt är en av egenskaperna hos CP. Möss i kontrollgruppen förlorade cirka 6% av sin ursprungliga kroppsvikt under de första 3 dagarna efter operationen och återhämtade sig sedan gradvis (104,6% av den ursprungliga kroppsvikten dag 21) (Figur 1C). Möss som fick TNBS förlorade däremot i genomsnitt cirka 15% av sin ursprungliga kroppsvikt under de första 5 dagarna och återfick vikt efteråt (99,8% av den ursprungliga kroppsvikten dag 21) (Figur 1C). Dessutom, jämfört med kontroller, visade TNBS möss ökad buk mekanisk överkänslighet vid 2 och 3 veckor efter TNBS injektion (Figur 1D), som sannolikt var förknippad med ökad buksmärta10.
För att bekräfta att gallgången TNBS infusion effektivt inducerad bukspottskörtelförändringar som efterliknar mänskliga CP, samlade vi bukspottskörteln vävnader från TNBS eller fordonsbehandlade kontroll möss vid 3 veckor efter kirurgi. Både storlek och vikt per kroppsvikt i bukspottkörteln minskade signifikant hos TNBS-möss jämfört med kontroller (Figur 2A, B), vilket tyder på markant bukspottskörtelatrofi överensstämmer med resultaten hos människor med svår och långsiktig CP. Dessutom verkade bukspottkörteln från kontrollmössen normal utan uppenbara morfologiska förändringar, medan TNBS möss visade vacuolization med massiv förlust av acinarceller ersatta av fettcellsinfiltration och fibros (Figur 2C). Dessa resultat överensstämde med rapporter från andra studier9,10.
Figur 1:TNBS gallgångsinfusion för generering av CP-möss. B)Gallgång efter injektion av 50 μL bläck. c)Medelvärden för kroppsviktsförändring hos möss som får TNBS eller fordon. (D) Buksvarströskel i TNBS och kontrollmöss 3 veckor efter infusionen. Data analyserades med hjälp av tillgänglig analysprogramvara (t.ex. GraphPad 8.2.1). Data presenteras som ± SEM. Skillnader mellan grupper analyserades med hjälp av studentens t-test, ** p < 0,01 ansågs statistiskt signifikant. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Karakterisering av CP hos TNBS-behandlade möss. A)Mikrografer av bukspottkörteln från kontrollmöss (CTR) och TNBS. B)Den genomsnittliga bukspottkörtelvikten dividerat med muskroppsvikt i CTR- och TNBS-möss. C)Hematoxylin och eosinfärgning av bukspottkörteldelar av CTR- och TNBS-möss. Skalstång =100 μm. Uppgifterna presenteras som ± SEM. **, s < 0,01 efter Studentens t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gallgångsinfusion av TNBS för att inducera kronisk pankreatit är tekniskt utmanande hos möss, eftersom upp till 22,5% av mössen kan dö inom 3-4 dagar efter läkemedelsinfusion10. Här förfinade denna rapport förfarandet baserat på tidigare studier och minskade tidig musdödlighet till <10%. Till exempel kan den ökade läkemedelsvolymen (från 35 μL till 50 μL) säkerställa att drogerna når hela bukspottkörteln. Användning av en insulinspruta och en mindre nålstorlek (31G) minskar potentiella skador på bukspottskörtelns kanal och läckaget av galla i gallblåsan eller buken, vilket sannolikt skulle orsaka musdöd inom de första dagarna efter operationen. Fastspänning av gallgångens båda ändar kan förhindra att TNBS läcker till gallblåsan och tarmarna, vilket kan orsaka dödlighet. Hemoklämmorna håller fast TNBS i den injicerade bukspottkörteln, vilket förbättrar effekten samtidigt som skadorna på andra vävnader minskar. Dessutom är TNBS inte stabilt vid temperaturer över 0 °C. Genom att använda nyberedda TNBS uppnådde CP-induktion därför stabila resultat.
Detta protokoll inducerar effektivt CP hos manliga C57BL/6J möss vid 8-12 veckors ålder och genererar en modell som efterliknar stora symtom på kronisk bukspottkörtelinflammation, inklusive kroppsvikt förlust, bukspottskörteln atrofi, fibros och sannolika buken smärta. Jämfört med andra CP-musmodeller används TNBS-modellen ofta för att utvärdera smärtstillande effekter förutom inflammation10,15,16. Den andra fördelen med TNBS-modellen är att läkemedlet injiceras direkt i bukspottkörteln, vilket minskar skador på andra organ som kan störa studien17. Denna TNBS CP mus modell kan användas för att studera patogenes samt behandlingsalternativ tillsammans med andra kroniska bukspottkörtelinflammation modeller.
En begränsning av denna studie är att endast möss mellan 8-10 veckors ålder användes. Eftersom möss i olika åldrar kan ha olika bukspottkörtelstorlekar, vilket följaktligen påverkar TNBS-CP-utvecklingen. Därför måste huruvida möss i olika åldrar/storlekar ska få en annan dos TNBS testas. Ändå visar denna studie förfarandena för att framgångsrikt utföra bukspottskörtelkanalinfusion som kan hjälpa till med studier fokuserade på bukspottskörtelsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar att de inte har intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Institutionen för veteranfrågor (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) och National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394 och DK118529 till HW. Vi tackar Dr. Hongju Wu för att dela teknisk erfarenhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
