Summary
Pancreatite crônica (PC) é uma doença caracterizada por inflamação e fibrose do pâncreas, frequentemente associada a dor abdominal intratável. Este artigo se concentra na refinação da técnica para gerar um modelo de camundongo de CP via infusão de ducto biliar com ácido sulfônico de 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS).
Abstract
Pancreatite crônica (PC) é uma doença complexa que envolve inflamação pancreática e fibrose, atrofia glandular, dor abdominal e outros sintomas. Vários modelos de roedores foram desenvolvidos para estudar CP, dos quais o ducto biliar 2,4,6 -trinitrobenzeno modelo de infusão de ácido sulfônico (TNBS) replica as características da dor neuropática vista em CP. No entanto, a infusão de drogas de ducto biliar em camundongos é tecnicamente desafiadora. Este protocolo demonstra o procedimento de infusão tnbs do ducto biliar para a geração de um modelo de mouse CP. TNBS foi infundido no pâncreas através da ampola de Vater no duodeno. Este protocolo otimizeu o volume de medicamentos, técnicas cirúrgicas e o manuseio de drogas durante o procedimento. Os camundongos tratados com TNBS apresentaram características de CP refletidas por reduções de peso corporal e pâncreas, alterações nos comportamentos associados à dor e morfologia pancreática anormal. Com essas melhorias, a mortalidade associada à injeção de TNBS foi mínima. Este procedimento não é apenas crítico na geração de modelos de doenças pancreáticas, mas também é útil na entrega de medicamentos pancreáticos locais.
Introduction
Pancreatite crônica (PC) é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela atrofia do pâncreas, fibrose, dor abdominal e eventual perda das funções exócrina e endócrina1. Os tratamentos médicos e cirúrgicos atuais não são curativos, mas são realizados para aliviar sintomas que são consequência da doença: dor abdominal refratária, disfunção endócrina e exócrina. Portanto, tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários2. Os modelos animais fornecem uma ferramenta essencial para desenvolver uma melhor compreensão da doença e investigar possíveis terapêuticas3. Vários modelos de mouse para CP foram desenvolvidos, dos quais modelos de ceruleina e/ou álcool são comumente usados. Cerulein, um oligopeptide estimulando a secreção pancreática, tem sido mostrado para induzir reproduivelmente um modelo de CP com atrofia pancreática, fibrose, entre outros4. Outro modelo comum utiliza injeções seriais de L-arginina, que produz insuficiência exócrina semelhante à observada em pacientes humanos5. A CP também pode ser induzida por ligadura completa ou parcial do ducto pancreático, bem como hipertensão do ducto pancreático6,7. Apesar da variedade de modelos animais disponíveis para PC, nenhum desses modelos reproduz efetivamente a dor abdominal experimentada pelos pacientes de PC8.
Estudos anteriores mostraram que a injeção pancreática local de 2,4,6 -trinitrobenzene ácido sulfônico (TNBS) replica a dor persistente experimentada pelos pacientes de PC9,10,11. Os camundongos tratados com TNBS demonstraram hipersensibilidade abdominal e aumentaram os comportamentos relacionados à dor, bem como uma "hipersensibilidade generalizada" a estímulos dolorosos, fenômeno que tem sido observado em pacientes com PC10. Além de imitar com precisão a dor de CP, o modelo TNBS também replica outras características patológicas da condição humana, como fibrose, infiltração de células mononucleares e substituição de células acinar por tecido gorduroso10,12. No entanto, a infusão de TNBS via ducto biliar é um procedimento tecnicamente desafiador em camundongos que pode causar a morte. Pelo que sabemos, não há protocolo visual para mostrar como a infusão do ducto biliar é realizada. Neste artigo, demonstramos o procedimento da infusão de dução bile de TNBS para gerar um modelo de mouse CP. Este procedimento ajudará a gerar modelos animais valiosos para o estudo de CP e outras doenças pancreáticas e pode ser usado para infundir outros materiais (por exemplo, vírus, células) no pâncreas13.
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Protocol
Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H. Johnson Medical Center. Neste estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J entre 8 e 10 semanas de idade. Os camundongos estavam alojados sob um ciclo escuro padrão de 12 luz/12 com litbitumaccess ad libitumaccess à comida e à água.
1. Preparação da solução TNBS para injeção
- Prepare 10% de etanol em 0,9% salina. Dissolver o estoque TNBS (ver Tabela de Materiais) em 10% de etanol para uma concentração final de 7,5 mM adicionando 7,5 μL de TNBS em 1 mL de 10% de etanol.
ATENÇÃO: A TNBS apresenta um risco químico. Prepare a solução dentro de um capô de fumaça e use equipamentos de proteção individual, como luvas, óculos e um jaleco para evitar contato direto com a TNBS. - Carregue 50 μL de solução TNBS de 0,75% em uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 31. Carregue 50 μL de 10% de etanol em soro fisiológico em uma seringa do mesmo tamanho do controle do veículo. Coloque as seringas no gelo e proteja-as da luz até que seja necessário.
2. Preparação e cirurgia do rato
- Raspe o cabelo da área cirúrgica abdominal.
- Injete uma dose preventiva do analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) antes da cirurgia.
- Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurane e 1 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia beliscando os dedo dos dedo e observando o animal por falta de reflexo.
- Coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia. Aplique pomada veterinária em cada olho quando o rato estiver sob anestesia.
- Desinfetar o local cirúrgico limpando a área cirúrgica 3x com 2% de iodo, seguido por 70% de álcool(Tabela de Materiais).
- Faça uma laparotomia com micro tesoura para gerar uma incisão de 0,5-1 cm.
- Exponha suavemente o duodeno e localize o ducto biliar comum utilizando cotonetes de algodão (Tabela de Materiais).
- Coloque um micro clipe de micro hemo retosobreo duto comum proximal para evitar o fluxo de TNBS ou soluções de veículo no fígado e na vesícula biliar(Figura 1A,B).
- Exponha suavemente o duodeno e insira a agulha no ducto pancreático através da papila de Vater.
- Uma vez que a agulha esteja dentro do duto, coloque um micro clipe de micro hemo curva(Tabela de Materiais) sobre o duodeno ao redor da agulha (Figura 1A) para fixar a agulha no lugar e evitar que a solução injetada entre no duodeno.
- Infundir gradualmente a solução (TNBS ou veículo) no duto pancreático ao longo de um minuto.
NOTA: O TNBS precisa ser infundido lentamente ao longo de um minuto de tempo, e é fácil controlar a velocidade de infusão quando o pâncreas é perfundido com uma seringa de insulina com uma agulha de 5/16 polegadas e 31G. Mantenha a mão o mais estável possível para evitar picar o ducto biliar. Se o TNBS for injetado com sucesso, a cor amarela pode ser visível dentro do pâncreas. - Após a infusão, remova cuidadosamente o micro grampo perto do fígado e, em seguida, remova o micro grampo segurando a agulha e o duodeno.
- Retorne cuidadosamente o duodeno à sua posição original.
- Deixe 0,5 mL de soro estéril quente (36-37 °C) na cavidade abdominal antes do fechamento, para ajudar o duodeno a retornar à sua posição original e auxiliar na recuperação da peristalse.
- Feche a incisão na camada muscular usando sutura contínua com um ponto de 5-0. Feche a pele usando sutura interrompida com um ponto 4-0.
- Coloque a gaiola contendo ratos em uma almofada de aquecimento para permitir a recuperação da anestesia.
- Confirme se os ratos são quentes e capazes de movimento espontâneo antes de devolvê-los para a sala de espera.
- Continue fornecendo um analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) a cada 12h e calor suplementar para 48 h pós-cirurgia.
3. Monitorando o comportamento do mouse
- Remova as suturas no 7º dia pós-cirurgia.
- Monitore a saúde e o comportamento do rato diariamente durante a primeira semana pós-cirurgia. Cuidado com sinais de angústia, como vocalização, postura curvada nas costas ou menor locomoção. Meça o peso corporal dia não.
- Use monofilamentos Von Frey (VFFs) para medir a hipersensibilidade mecânica abdominal antes, e 2, 3 semanas após a cirurgia, conforme descrito9,14.
- Aplique VFFs de diferentes forças aplicadas na ordem ascendente à área abdominal superior 10x a cada 1-2 s. Considere o aumento, retração ou lambida do abdômen (resposta de retirada) como uma resposta positiva.
- Aplique um estímulo mais forte se uma resposta positiva não for observada, e um estímulo mais fraco se uma resposta positiva for observada. O limiar de retirada é a força com que o mouse responde 50% das vezes.
4. Coleta e análise histológica do tecido pancreático
- Sacrifique os camundongos sob anestesia por deslocamento cervical, e disseca cuidadosamente o pâncreas do intestino e outros órgãos.
- Fixar o pâncreas em 10% de paraformaldeído por 24 horas, incorporar em parafina, cortar seções teciduais de 5 μm de espessura e colocá-los em lâminas de vidro para coloração.
- Realize a hematoxylin-eosina, e a coloração tricrática de Masson usando métodos padrão como relatado anteriormente4.
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Representative Results
Os procedimentos de infusão do ducto biliar foram otimizados para reduzir a mortalidade do camundongo associada a este procedimento10. O TNBS foi dado pela primeira vez em um volume total de 35 μL ou 50 μL. A injeção de TNBS em um volume de 50 μL poderia atingir todo o pâncreas e induzir um fenótipo de doença mais homogêneo(Figura 1B). Além disso, a injeção de TNBS usando seringa de insulina com agulha 31G poderia controlar melhor a velocidade de infusão em relação às seringas regulares e tamanhos de agulhas. TNBS recém-preparado armazenado no gelo e usado dentro de uma hora de preparação de medicamentos também produziu melhor resultado em comparação com tnbs preparado por mais de uma hora. Com essas melhorias, a mortalidade dos beneficiários foi controlada e permaneceu abaixo de 10%.
A perda de peso corporal é uma das características do CP. Os camundongos do grupo controle perderam cerca de 6% do peso corporal original durante os primeiros 3 dias após a cirurgia, depois se recuperaram gradualmente (104,6% do peso corporal original no dia 21) (Figura 1C). Em contrapartida, os camundongos que receberam TNBS perderam em média cerca de 15% de seu peso corporal original durante os primeiros 5 dias e recuperaram peso depois (99,8% do peso corporal original no dia 21) (Figura 1C). Além disso, em comparação com os controles, os camundongos TNBS apresentaram aumento da hipersensibilidade mecânica abdominal em 2 e 3 semanas após a injeção de TNBS(Figura 1D),que provavelmente foi associada ao aumento da dor abdominal10.
Para confirmar que a infusão do ducto biliar TNBS efetivamente induziu alterações pancreáticas imitando CP humano, coletamos tecidos pancreáticos de TNBS ou ratos de controle tratados com veículos em 3 semanas após a cirurgia. Tanto o tamanho quanto o peso por corpo do pâncreas foram significativamente reduzidos em camundongos TNBS em comparação com os controles (Figura 2A, B), sugerindo atrofia pancreática marcada consistente com os achados em humanos com CP grave e de longo prazo. Além disso, o pâncreas dos camundongos de controle parecia normal sem alterações morfológicas óbvias, enquanto os camundongos TNBS apresentaram vacuolização com perda maciça de células acinar substituídas por infiltração de células de gordura e fibrose(Figura 2C). Esses achados foram consistentes com os relatos de outros estudos9,10.
Figura 1: Infusão do ducto biliar TNBS para geração de camundongos CP. (A) Ilustração da injeção do ducto biliar. (B) Ducto biliar após injeção de 50 μL de tinta. (C) Médias de variação de peso corporal em camundongos que recebem TNBS ou veículo. (D) Limiar de resposta abdominal em TNBS e controlar camundongos em 3 semanas após a infusão. Os dados foram analisados utilizando software de análise disponível (por exemplo, GraphPad 8.2.1). Os dados são apresentados como média ± SEM. As diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando-se o t-teste do Aluno, ** p < 0,01 foi considerada estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Caracterização de CP em camundongos tratados com TNBS. (A) Micrografias do pâncreas a partir do controle (CTR) e camundongos TNBS. (B) O peso médio do pâncreas dividido pelo peso corporal do rato em camundongos CTR e TNBS. (C) Hemaoxilina e eosina de seções de pâncreas de camundongos CTR e TNBS. Barra de escala =100 μm. Os dados são apresentados como média ± SEM. **, p < 0,01 pelo T-Teste do Estudante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A infusão do ducto biliar de TNBS para induzir pancreatite crônica é tecnicamente desafiadora em camundongos, pois até 22,5% dos camundongos podem morrer dentro de 3-4 dias de infusão de medicamentos10. Aqui, este relatório refinou o procedimento com base em estudos anteriores e reduziu a mortalidade precoce do camundongo para <10%. Por exemplo, o aumento do volume de drogas (de 35 μL a 50μL) pode garantir que as drogas atinjam todo o pâncreas. O uso de uma seringa de insulina e um tamanho menor de agulha (31G) reduz danos potenciais ao ducto pancreático e ao vazamento de bile na vesícula biliar ou no abdômen, o que provavelmente causaria a morte do rato nos primeiros dias após a cirurgia. A fixação das duas extremidades do ducto biliar pode impedir que o TNBS vaze para a vesícula biliar e o intestino, o que pode causar mortalidade. Os clipes de hemo contêm TNBS dentro do pâncreas injetado, melhorando a eficácia e reduzindo danos a outros tecidos. Além disso, o TNBS não está estável a temperaturas acima de 0 °C. Portanto, utilizando TNBS recém-preparada, a indução de CP alcançou resultados estáveis.
Este protocolo efetivamente induz CP em camundongos C57BL/6J masculinos com 8-12 semanas de idade e gera um modelo que imita os principais sintomas da pancreatite crônica, incluindo perda de peso corporal, atrofia pancreática, fibrose e provável dor abdominal. Em comparação com outros modelos de mouses CP, o modelo TNBS é amplamente utilizado para avaliar efeitos analgésicos, além da inflamação10,15,16. A outra vantagem do modelo TNBS é que a droga é injetada diretamente no pâncreas, o que reduz danos a outros órgãos que podem interferir no estudo17. Este modelo de mouse TNBS CP pode ser usado para estudar patogênese, bem como opções de tratamento, juntamente com outros modelos crônicos de pancreatite.
Uma limitação deste estudo é que apenas camundongos entre 8 e 10 semanas de idade foram utilizados. Uma vez que camundongos em idades diferentes podem ter tamanhos de pâncreas de diferença, o que consequentemente afeta o desenvolvimento do TNBS-CP. Portanto, se os camundongos em diferentes idades/tamanhos devem receber uma dose diferente de TNBS precisa ser testado. No entanto, este estudo demonstra os procedimentos para realizar com sucesso a infusão do ducto pancreático que pode ajudar em estudos focados em doenças pancreáticas.
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Disclosures
Todos os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (VA-ORD BLR&D Mérito I01BX004536), e pelo Instituto Nacional de Saúde ( 1R01DK105183, DK120394 e DK118529 à HW). Agradecemos ao Dr. Hongju Wu por compartilhar experiência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
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