Summary
Kronisk pancreatitis (CP) er en sygdom karakteriseret ved betændelse og fibrose i bugspytkirtlen, ofte forbundet med uhåndterlige mavesmerter. Denne artikel fokuserer på raffinering af teknikken til at generere en musemodel af CP via galdegangsinfusion med 2,4,6 -trinitrobenzene suldonsyre (TNBS).
Abstract
Kronisk bugspytitis (CP) er en kompleks sygdom, der involverer betændelse i bugspytkirtlen og fibrose, kirtelatrofi, mavesmerter og andre symptomer. Flere gnavermodeller er blevet udviklet til at studere CP, hvoraf galdegangen 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) infusionsmodel replikerer funktionerne i neuropatisk smerte set i CP. Imidlertid er galdekanal lægemiddelinfusion hos mus teknisk udfordrende. Denne protokol demonstrerer proceduren for galdegangen TNBS infusion til generering af en CP musemodel. TNBS blev infunderet i bugspytkirtlen gennem Ampulla af Vater i duodenum. Denne protokol optimeret stof volumen, kirurgiske teknikker, og narkotika håndtering under proceduren. TNBS-behandlede mus viste funktioner i CP som afspejles af kropsvægt og bugspytkirtel vægttab, ændringer i smerte-associerede adfærd, og unormal bugspytkirtel morfologi. Med disse forbedringer var dødeligheden forbundet med TNBS-injektion minimal. Denne procedure er ikke kun kritisk i at generere kræft i bugspytkirtlen sygdom modeller, men er også nyttig i lokale bugspytkirtel lægemiddel levering.
Introduction
Kronisk pancreatitis (CP) er en kronisk inflammatorisk sygdom karakteriseret ved atrofi i bugspytkirtlen, fibrose, mavesmerter, og eventuel tab af både exocrin og endokrine funktioner1. Nuværende medicinske og kirurgiske behandlinger er ikke helbredende, men er forpligtet til at lindre symptomer, der er konsekvensen af sygdommen: ildfast mavesmerter, endokrine og eksokrine dysfunktion. Derfor er der et presserende behov for mere effektive behandlinger2. Dyremodeller er et vigtigt redskab til at udvikle en bedre forståelse af sygdommen og undersøge potentielle terapeutiske3. Der er udviklet flere musemodeller til CP, hvoraf cerulein- og/eller alkoholmodeller er almindeligt anvendt. Cerulein, en oligopeptid stimulerende bugspytkirtel sekretion, har vist sig at reproducerucibly fremkalde en CP model byder bugspytkirtel atrofi, fibrose, blandt andre4. En anden almindelig model bruger serielle injektioner af L-arginin, som producerer eksocrin insufficiens svarende til den, der observeres hos humane patienter5. CP kan også være induceret af fuldstændig eller delvis bugspytkirtelkanal ligation, samt bugspytkirtel kanal hypertension6,7. På trods af de mange forskellige dyremodeller, der er tilgængelige til CP, reproducerer ingen af disse modeller effektivt mavesmerter, som CP-patienteroplever 8.
Tidligere undersøgelser viste , at lokal bugspytkirtel injektion af 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) replikerer den vedvarende smerte opleves af CP patienter9,10,11. TNBS-behandlede mus demonstrerede abdominal overfølsomhed og øget smerterelateret adfærd samt en "generaliseret overfølsomhed" over for smertefulde stimuli, et fænomen, der er blevet observeret hos CP-patienter10. Ud over præcist efterligne CP smerte, TNBS model replikerer også andre patologiske træk ved den menneskelige tilstand såsom fibrose, mononuklear celle infiltration, og udskiftning af acinare celler med fedtvæv10,12. Men, TNBS infusion via galdegang er en teknisk udfordrende procedure i mus, der kan forårsage død. Så vidt vi ved, er der ingen visuel protokol til at vise, hvordan galdegangsinfusion udføres. I denne artikel demonstrerer vi proceduren for galdeduktionsinfusionen af TNBS for at generere en CP-musemodel. Denne procedure vil bidrage til at generere værdifulde dyremodeller til undersøgelse af CP og andre bugspytkirtelsygdomme og kan bruges til at indgyde andre materialer (f.eks. virus, celler) i bugspytkirtlen13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev gennemført med godkendelse af de institutionelle Animal Care and Use Udvalg på Medical University of South Carolina og Ralph H. Johnson Medical Center. C57BL/6J hanmus mellem 8-10 uger blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev anbragt under en standard 12 lys / 12 mørk cyklus med ad libitum adgang til mad og vand.
1. Forberedelse af TNBS-opløsning til injektion
- Forbered 10% ethanol i 0,9% saltvand. TNBS(se materialetabellen)opløses i 10 % ethanol til en endelig koncentration på 7,5 mM ved tilsætning af 7,5 μL TNBS i 1 mL 10% ethanol.
FORSIGTIG: TNBS udgør en kemisk fare. Forbered opløsningen inde i en røghætte og brug personlige værnemidler såsom handsker, beskyttelsesbriller og en kittel for at undgå direkte kontakt med TNBS. - Læg 50 μL 0,75% TNBS-opløsning i en insulinsprøjte med en 31-gauge nål. Læg 50 μL 10% ethanol i saltvand i en sprøjte af samme størrelse som køretøjskontrol. Placer sprøjterne på is og beskyt dem mod lys, indtil det er nødvendigt.
2. Museforberedelse og -kirurgi
- Barber håret fra det abdominale kirurgiske område.
- Indsprøjt en forebyggende dosis af smertestillende (f.eks. buprenorphin 0,1 mg/kg i.p.) før operationen.
- Inducer og vedligehold musen under generel anæstesi med 1,5-2% isoflurane og 1 L/min ilt. Bekræft bedøvelsen ved at klemme tæerne og observere dyret for manglende refleks.
- Placer musen på en opvarmet kirurgisk pad under operationen. Påfør veterinær salve på hvert øje, når musen er under bedøvelse.
- Desinficer det kirurgiske sted ved at tørre det kirurgiske område 3x med 2% jod, efterfulgt af 70% alkohol (Materialetabel).
- Udfør en laparotomi med mikrosaks for at generere et snit på 0,5-1 cm.
- Forsigtigt udsætte duodenum og lokalisere den fælles galdegang ved hjælp af vatpinde (Tabel af materialer).
- Placer en lige mikro hæmo klip (Tabel over materialer) over den proksimale fælles kanal for at forhindre strømmen af TNBS eller køretøj løsninger i leveren og galdeblæren ( Figur1A, B).
- Forsigtigt udsætte duodenum og indsætte nålen i bugspytkirtlen kanalen gennem papilla af Vater.
- Når nålen er inde i kanalen, skal du placere en buet mikrohæmoclips (Materialetabel) over duodenumet omkring nålen (Figur 1A) for at fastgøre nålen på plads og forhindre den injicerede opløsning i at komme ind i duodenummet.
- Gradvist indgyde opløsningen (TNBS eller køretøjet) i bugspytkirtlen kanalen i løbet af et minut.
BEMÆRK: TNBS skal infunderes langsomt over et minut tid, og det er let at kontrollere infusionshastigheden, når bugspytkirtlen er gennemsyret af en insulinsprøjte med en 5/16 tommer og 31G nål. Hold hånden så stabil som muligt for at undgå at stikke galdegangen. Hvis TNBS injiceres, gul farve kan være synlig inde i bugspytkirtlen. - Efter infusion skal du forsigtigt fjerne mikroklemmen nær leveren og derefter fjerne mikroklemmen, der holder nålen og duodenum.
- Vend forsigtigt duodenum til sin oprindelige position.
- Lad 0,5 mL varm steril saltvand (36-37 °C) i bughulen før lukningen for at hjælpe duodenum med at vende tilbage til sin oprindelige position og hjælpe med genopretningen af peristalsis.
- Luk snittet i muskellaget ved hjælp af kontinuerlig sutur med en 5-0 søm. Luk huden med afbrudt sutur med en 4-0 søm.
- Placer buret indeholdende mus på en varmepude for at tillade genopretning fra anæstesi.
- Bekræft, at musene er varme og i stand til spontan bevægelse, før de returneres til opbevaringsrummet.
- Fortsæt med at give et smertestillende middel (f.eks buprenorphin 0,1 mg/kg i.p.) hver 12 timer og supplerende varme i 48 timer efter operationen.
3. Overvågning af musens adfærd
- Fjern suturer på dag 7 efter operationen.
- Overvåg musens sundhed og adfærd dagligt i løbet af den første uge efter operationen. Hold øje med tegn på nød såsom vokalisering, bøjet ryg kropsholdning, eller reduceret bevægelse. Mål kropsvægten hver anden dag.
- Brug Von Frey monofilamenter (VFFs) til at måle abdominal mekanisk overfølsomhed før, og 2, 3 uger efter operationen som beskrevet9,14.
- Påfør VFFFs af forskellige anvendte kræfter i stigende rækkefølge til det øvre abdominalområde 10x hver 1-2 s. Overvej at hæve, tilbagetrækning, eller slikke af maven (tilbagetrækning svar) som en positiv reaktion.
- Anvende en stærkere stimulus, hvis et positivt svar ikke observeres, og en svagere stimulus, hvis et positivt svar observeres. Tilbagetrækningstærsklen er den kraft, hvormed musen reagerer 50% af tiden.
4. Indsamling og histologisk analyse af bugspytkirtelvæv
- Ofre musene under anæstesi ved cervikal dislokation, og forsigtigt dissekere bugspytkirtlen fra tarmen og andre organer.
- Fix bugspytkirtlen i 10% paraformaldehyd i 24 timer, indlejre i paraffin, skåret væv sektioner af 5 μm tykkelse, og læg dem på glas dias til farvning.
- Udfør hæmatoxylin-eosin, og Masson's trikrom farvning ved hjælp af standard metoder som tidligere rapporteret4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Galdegangen infusionsprocedurer blev optimeret til at reducere musens dødelighed forbundet med denne procedure10. TNBS blev først givet i et samlet volumen på 35 μL eller 50 μL. Injektion af TNBS i et volumen på 50 μL kan nå hele bugspytkirtlen og fremkalde en mere homogen sygdomsfænotype (Figur 1B). Derudover kan injektion af TNBS ved hjælp af insulinsprøjte med 31G-nål bedre styre infusionshastigheden i forhold til almindelige sprøjter og nålestørrelser. Frisklavet TNBS opbevaret på is og anvendes inden for en time efter lægemiddelforberedelse gav også bedre resultat i forhold til TNBS forberedt længere end en time. Med disse forbedringer blev modtagernes dødelighed kontrolleret og forblev under 10%.
Vægttab er et af kendetegnene ved CP. Mus i kontrolgruppen mistede omkring 6% af deres oprindelige kropsvægt i løbet af de første 3 dage efter operationen og kom sig derefter gradvist (104,6% af den oprindelige kropsvægt på dag 21) (Figur 1C). I modsætning hertil mistede mus, der fik TNBS, i gennemsnit ca. 15 % af deres oprindelige kropsvægt i løbet af de første 5 dage og kom på igen bagefter (99,8 % af den oprindelige kropsvægt på dag 21) (Figur 1C). Sammenlignet med kontroller viste TNBS-mus desuden øget abdominal mekanisk overfølsomhed ved 2 og 3 uger efter TNBS-injektion (Figur 1D), som sandsynligvis var forbundet med øget mavesmerter10.
For at bekræfte, at galdegangen TNBS infusion effektivt induceret bugspytkirtel ændringer efterligne menneskelige CP, vi indsamlet bugspytkirtelvæv fra TNBS eller køretøj-behandlede kontrol mus på 3 uger efter operationen. Både størrelse, og vægt pr mindstevægt i bugspytkirtlen blev signifikant reduceret i TNBS mus sammenlignet med kontrol (Figur 2A,B), tyder markant bugspytkirtel atrofi i overensstemmelse med resultaterne hos mennesker med svær og langsigtet CP. Derudover syntes bugspytkirtlen fra kontrolmusene normal uden åbenlyse morfologiske ændringer, mens TNBS mus viste vakuolisering med massivt tab af acinare celler erstattet af fedtcelleinfiltration og fibrose (Figur 2C). Disse resultater var i overensstemmelse med rapporter fra andre undersøgelser9,10.
Figur 1: TNBS galdegangsinfusion til generering af S-mus. (A) Illustration af galdegangsindsprøjtning. (B) Galdegangen efter injektion af 50 μL blæk. (C) Gennemsnit af ændringer i kropsvægt hos mus, der modtager TNBS eller køretøj. (D) Abdominal responstærskel i TNBS og kontrolmus efter 3 uger efter infusionen. Data blev analyseret ved hjælp af tilgængelig analysesoftware (f.eks. GraphPad 8.2.1). Data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af studentens t-test, ** p < 0,01 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Karakterisering af CP hos TNBS-behandlede mus. (A) Mikrografer i bugspytkirtlen fra kontrol (CTR) og TNBS mus. (B) Den gennemsnitlige bugspytkirtelvægt divideret med mus kropsvægt i CTR og TNBS mus. (C) Hæmatoxylin og eosin farvning af bugspytkirtlen dele af CTR og TNBS mus. Skalalinje =100 μm. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM. **, p < 0,01 af Student's t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Galdegangsinfusion af TNBS for at fremkalde kronisk pancreatitis er teknisk udfordrende hos mus, da op til 22,5% af musene kan dø inden for 3-4 dage efter lægemiddelinfusion10. Her raffinerede denne rapport proceduren baseret på tidligere undersøgelser og reducerede den tidlige musedødelighed til <10%. For eksempel kan det øgede lægemiddelvolumen (fra 35 μL til 50μL) sikre, at stofferne når hele bugspytkirtlen. Ved hjælp af en insulinsprøjte og en mindre nålestørrelse (31G) reduceres potentielle skader på bugspytkirtlen kanalen og lækage af galde i galdeblæren eller maven, som sandsynligvis ville forårsage musen død inden for de første mange dage efter operationen. Fastspænding i begge ender af galdegangen kan forhindre TNBS i at lække til galdeblæren og tarmen, hvilket kan forårsage dødelighed. Hæmo klip begrænse TNBS i den injicerede bugspytkirtel, forbedre effekten samtidig reducere skader på andre væv. Derudover er TNBS ikke stabil ved temperaturer over 0 °C. Derfor opnåede CP-induktion stabile resultater ved hjælp af frisklavet TNBS.
Denne protokol effektivt inducerer CP i mandlige C57BL/6J mus på 8-12 uger og genererer en model, der efterligner store symptomer på kronisk bugspytsibilitet, herunder kropsvægt tab, bugspytkirtel atrofi, fibrose, og sandsynligvis mavesmerter. Sammenlignet med andre CP-musemodeller bruges TNBS-modellen i vid udstrækning til at evaluere smertestillende virkninger ud over betændelse10,15,16. Den anden fordel ved TNBS-modellen er, at lægemidlet injiceres direkte i bugspytkirtlen, hvilket reducerer skader på andre organer, der kan forstyrre undersøgelsen17. Denne TNBS CP mus model kan bruges til at studere patogenese samt behandlingsmuligheder sammen med andre kroniske pancreatitis modeller.
En begrænsning af denne undersøgelse er, at kun mus mellem 8-10 uger blev brugt. Da mus i forskellige aldre kan have forskel bugspytkirtel størrelser, som derfor påvirker TNBS-CP udvikling. Det er derfor nødvendigt at teste, om mus i forskellige aldre/størrelser skal have en anden dosis TNBS. Ikke desto mindre, denne undersøgelse viser procedurerne for at kunne udføre bugspytkirtel kanal infusion, der kan hjælpe med undersøgelser fokuseret på bugspytkirtel sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536), og National Institute of Health giver # 1R01DK105183, DK120394 og DK118529 til HW. Vi takker Dr. Hongju Wu for at dele teknisk erfaring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
