Summary

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

Published: May 22, 2021
doi:

Summary

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

Abstract

ההתפתחות התקינה של מוח היונקים מסתמכת על איזון עדין של התפשטות תאי גזע עצביים ובידול לסוגי תאים עצביים שונים. איזון זה נשלט היטב על ידי ביטוי גנים כי הוא מכוון היטב ברמות מרובות, כולל שעתוק, לאחר שעתוק ותרגום. בהקשר זה, גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש תפקיד קריטי של רגולציה תרגום בתיאום החלטות גורל תאי גזע עצביים. שבר פוליזום הוא כלי רב עוצמה להערכת מצב תרגום mRNA הן ברמה הגלובלית והן ברמת הגנים האינדיבידואלית. כאן, אנו מציגים צינור פרופיל פוליזום בתוך הבית כדי להעריך יעילות תרגום בתאים מקליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו מתארים את הפרוטוקולים להכנת שיפוע סוכרוז, תמוגה לרקמות, ultracentrifugation וניתוח מבוסס שבר של מצב תרגום mRNA.

Introduction

במהלך התפתחות המוח יונקים, תאי גזע עצביים להתרבות ולהבדיל כדי ליצור נוירונים גליה1,2 . ההפרעה של תהליך זה יכולה להוביל לשינויים במבנה המוח ובתפקוד, כפי שניתן לראות בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות3,4. ההתנהגות הנכונה של תאי גזע עצביים דורשת ביטוי מתוזמר של גנים ספציפיים5. בעוד שהשליטה האפיגנטית והתעתיקית של גנים אלה נחקרה באופן אינטנסיבי, הממצאים האחרונים מצביעים על כך שוויסות גנים ברמות אחרות תורם גם לתיאום התפשטות תאי גזע עצביים ובידול6,7,8,9,10. לפיכך, התייחסות לתוכניות הבקרה התרגומיות תקדם מאוד את הבנתנו את המנגנונים שבבסיס החלטת גורל תאי הגזע העצביים והתפתחות המוח.

שלוש טכניקות עיקריות עם עוצמות שונות יושמו באופן נרחב כדי להעריך את המצב התרגומי של mRNA, כולל פרופיל ריבוזום, תרגום טיהור זיקה ריבוזום (TRAP) ופרופיל פוליזום. פרופיל ריבוזום משתמש ברצף RNA כדי לקבוע שברי mRNA המוגנים על ידי ריבוזום, ומאפשר ניתוח גלובלי של מספר ומיקום של תרגום ריבוזומים על כל תעתיק כדי להסיק בעקיפין את שיעור התרגום על ידי השוואתו לשפעתעתיק 11. TRAP מנצלת חלבונים ריבוזומליים מתויגים באפיטופ כדי ללכוד mRNAs12הקשורים לריבוזום . בהתחשב בכך שהחלבונים הריבוזומליים המתויגים יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ספציפיים באמצעות גישות גנטיות, TRAP מאפשרת ניתוח של תרגום באופן ספציפי לסוג התא. לשם השוואה, פרופיל פוליזום, המשתמש בשבר שיפוע בצפיפות סוכרוז כדי להפריד חלק חופשי ותורגם בצורה גרועה (מונוזומים קלים יותר) מאלה המתורגמים באופן פעיל על ידי ריבוזומים (פוליזומים כבדים יותר), מספק מדידה ישירה של צפיפות הריבוזום ב- mRNA13. יתרון אחד טכניקה זו מציעה היא צדדיות שלה ללמוד את התרגום של mRNA ספציפי של עניין, כמו גם ניתוח תרגום רחב הגנום14.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של פרופיל פוליזום כדי לנתח את קליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו משתמשים במערכת ביתית כדי להכין מעברי צבע של צפיפות סוכרוז ולאסוף שברים עבור יישומים במורד הזרם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי לנתח סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים.

Protocol

כל השימוש בבעלי חיים היה בפיקוח הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי. עכברי CD1 ששימשו לניסוי נרכשו מספק מסחרי. 1. הכנת פתרונות הערה כדי למנוע השפלה RNA, לרסס שולחן עבודה וכל הציוד עם פתרון טיהור RNase. טיפים ללא RNase משמשים לניסוי. כל הפתרונות מוכנים במים נטולי R…

Representative Results

כהדגמה, ליסט קליפת המוח המכיל 75 מיקרוגרם RNA (מאוגד מ 8 עוברים) הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל 12 שברים. פסגות ספיגת UV ב-254 ננומטר זיהו שברים המכילים את יחידת המשנה 40S, יחידת משנה של 60S, מונוזום 80S ופוליזומים(איור 4A). ניתוח שברים לפי כתם מערבי עבור יחידת המשנה ריבוזומה גדולה, Rpl10 הראה את…

Discussion

פרופיל פוליזום הוא טכניקה נפוצה ורבת עוצמה להערכת מצב התרגום הן בגן יחיד והן ברמות הגנום הרחבות14 . בדו”ח זה, אנו מציגים פרוטוקול של פרופיל פוליזום באמצעות פלטפורמה ביתית והיישום שלה כדי לנתח את קליפת העכבר המתפתחת. פלטפורמה חסכונית זו קלה להרכבה ולייצור שיפוע סוכרוז חזק וניתן…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN/04246-2018 ל- G.Y.). G.Y. הוא קתדרת מחקר בקנדה. S.K. מומן על ידי מלגת בוגרי Mitacs Globalink ומלגת סטודנטים לתארים מתקדמים של ACHRI.

Materials

1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

References

  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
  3. Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
  4. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
  5. Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
  6. Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
  7. Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
  8. Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
  9. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
  10. Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
  11. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  12. Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
  13. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
  14. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
  15. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
  16. Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
  17. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

View Video