Summary

Анализ перевода в развивающемся мозге мыши с использованием полисомного профилирования

Published: May 22, 2021
doi:

Summary

Развитие мозга млекопитающих требует надлежащего контроля экспрессии генов на уровне перевода. Здесь мы описываем систему поликомного профилирования с помощью простой в сборке градиентной градиентной и фракционной платформы для оценки трансляционного состояния мРНК в развивающемся мозге.

Abstract

Правильное развитие мозга млекопитающих опирается на тонкий баланс пролиферации нервных стволовых клеток и дифференциации на различные типы нервных клеток. Этот баланс жестко контролируется экспрессией генов, которая достроена на нескольких уровнях, включая транскрипцию, посткриптацию и перевод. В этой связи растущее количество фактических данных подчеркивает важную роль трансляционной регуляции в координации решений о судьбе нервных стволовых клеток. Полисомная фракционирование является мощным инструментом для оценки трансвеститного статуса мРНК как на глобальном, так и на индивидуальном уровне генов. Здесь мы представляем внутриутверенные полисомные профилирования трубопровода для оценки трансляционной эффективности в клетках из развивающейся коры головного мозга мыши. Мы описываем протоколы для подготовки градиента сахарозы, лиза тканей, ультрацентрифугации и дробного анализа переводного статуса мРНК.

Introduction

Во время развития мозга млекопитающих, нервные стволовые клетки размножаются и дифференцируются для генерации нейронов иглии 1,2. Возмущение этого процесса может привести к изменениям в структуре и функции мозга, как видно из многих расстройств нейроразвития3,4. Правильное поведение нервных стволовых клеток требует организованного выражения конкретных генов5. В то время как эпигенетический и транскрипционные контроль этих генов был интенсивно изучен, последние результаты показывают, что регуляции генов на других уровнях также способствует координации пролиферациинервных стволовых клеток и дифференциации6, 7,8,9,10. Таким образом, решение программ трансляционного контроля значительно повысит наше понимание механизмов, лежащих в основе решения судьбы нервных стволовых клеток и развития мозга.

Три основных метода с различными сильными сторонами были широко применены для оценки трансляционного статуса мРНК, включая рибосомное профилирование, перевод очистки рибосомной сродства (TRAP) и профилирование поликомы. Рибосомное профилирование использует секвенирование РНК для определения защищенных рибосомой фрагментов мРНК, что позволяет глобальному анализу количества и местонахождения перевода рибосом на каждой стенограмме косвенно сделать вывод о скорости перевода, сравнив его с изобилиемстенограммы 11. TRAP использует рибосомальные белки с эпитопом, помеченными эпитопом, для захвата рибосомно-связанных мРНК12. Учитывая, что помеченные рибосомные белки могут быть выражены в конкретных типах клеток с использованием генетических подходов, TRAP позволяет анализ перевода в клеточном типе конкретных образом. Для сравнения, поликомное профилирование, которое использует градиентную фракциацию плотности сахарозы для отделить свободную и плохо переведенную часть (легкие моносомы) от тех, которые активно переводятся рибосомами (более тяжелыми полисомами), обеспечивает прямое измерение плотности рибосомы на мРНК13. Одним из преимуществ этого метода является его универсальность для изучения перевода конкретных мРНК, представляющих интерес, а также генома всей перевод анализа14.

В этой статье мы описываем подробный протокол полисомного профилирования для анализа развивающейся коры головного мозга мыши. Мы используем домоборную систему для подготовки градиентов плотности сахарозы и сбора фракций для нисходящих приложений. Представленный здесь протокол можно легко адаптировать для анализа других типов тканей и организмов.

Protocol

Все виды использования животных контролировались Комитетом по уходу за животными в Университете Калгари. Мыши CD1, используемые для эксперимента, были приобретены у коммерческого поставщика. 1. Подготовка решений ПРИМЕЧАНИЕ Для предотвращения деградации Р?…

Representative Results

В качестве демонстрации корковой лизат, содержащий РНК 75 мкг (с объединением из 8 эмбрионов), был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций. Пики поглощения УФ-излучения на 254 нм определили фракции, содержащие 40S подразделение, 60S подразделение, 80S моносомы и полисомы(рисунок 4A</…

Discussion

Поликом-профилирование является широко используемым и мощным методом оценки трансляционного статуса как на одном гене, так и на уровнегенома 14. В этом отчете мы представляем протокол полисомного профилирования с помощью домашней платформы и ее применения для анализа раз?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась грантом NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018). Г.Я. является канадским научным кафедрой. S.K. финансировалась стипендией Mitacs Globalink Graduate Fellowship и стипендией аспиранта ACHRI.

Materials

1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

References

  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
  3. Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
  4. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
  5. Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
  6. Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
  7. Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
  8. Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
  9. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
  10. Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
  11. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  12. Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
  13. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
  14. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
  15. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
  16. Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
  17. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

View Video