Summary

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

Published: May 22, 2021
doi:

Summary

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell’espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Abstract

Il corretto sviluppo del cervello dei mammiferi si basa su un buon equilibrio tra proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali in diversi tipi di cellule neurali. Questo equilibrio è strettamente controllato dall’espressione genica che viene messa a punto a più livelli, tra cui trascrizione, post-trascrizione e traduzione. A questo proposito, un crescente corpus di prove evidenzia un ruolo critico della regolamentazione traslizionale nel coordinamento delle decisioni sul destino delle cellule staminali neurali. Il frazionamento polisoma è un potente strumento per la valutazione dello stato traslazione dell’mRNA a livello genico globale e individuale. Qui presentiamo una pipeline di profilazione polisomaria internamente per valutare l’efficienza traslibrazionale nelle cellule dalla corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Descriviamo i protocolli per la preparazione del gradiente di saccarosio, la lisi tissutale, l’ultracentrifugazione e l’analisi basata sul frazionamento dello stato traslazione dell’mRNA.

Introduction

Durante lo sviluppo del cervello dei mammiferi, le cellule staminali neurali proliferano e si differenziano per generare neuroni e glia1,2 . La perturbazione di questo processo può portare ad alterazioni della struttura e della funzione cerebrale, come si vede in molti disturbi del neurosviluppo3,4. Il corretto comportamento delle cellule staminali neurali richiede l’espressione orchestrata di genispecifici 5. Mentre il controllo epigenetico e trascrizionale di questi geni è stato intensamente studiato, recenti scoperte suggeriscono che la regolazione genica ad altri livelli contribuisce anche alla coordinazione della proliferazione e differenziazione delle cellule staminalineurali 6,7,8,9,10. Pertanto, affrontare i programmi di controllo traslizionale farà avanzare notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi alla base della decisione del destino delle cellule staminali neurali e dello sviluppo cerebrale.

Tre tecniche principali con diversi punti di forza sono state ampiamente applicate per valutare lo stato traslazionale dell’mRNA, tra cui la profilazione ribosoma, la traduzione della purificazione dell’affinità ribosoma (TRAP) e la profilazione polisome. La profilazione ribosoma utilizza il sequenziamento dell’RNA per determinare frammenti di mRNA protetti da ribosomi, permettendo all’analisi globale del numero e della posizione della traduzione dei ribosomi su ogni trascrizione di dedurre indirettamente il tasso di traslazione confrontandolo con l’abbondanza ditrascrizione 11. TRAP sfrutta le proteine ribosomiche taggate all’epitopo per catturare mRNA legati al ribosoma12. Dato che le proteine ribosomiche taggate possono essere espresse in specifici tipi di cellule utilizzando approcci genetici, TRAP consente l’analisi della traduzione in modo specifico del tipo cellulare. In confronto, la profilazione polisomeria, che utilizza il frazionamento del gradiente di densità del saccarosio per separare la porzione libera e scarsamente tradotta (monosomi più leggeri) da quelli tradotti attivamente dai ribosomi (polisomi più pesanti), fornisce una misurazione diretta della densità ribosoma su mRNA13. Un vantaggio che questa tecnica offre è la sua versatilità per studiare la traduzione di mRNA specifici di interesse e l’analisi del trasoma a livello genomico14.

In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato di profilazione polisoma per analizzare la corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Utilizziamo un sistema assemblato in casa per preparare gradienti di densità di saccarosio e raccogliere frazioni per applicazioni a valle. Il protocollo qui presentato può essere adattato facilmente per analizzare altri tipi di tessuti e organismi.

Protocol

Tutto l’uso degli animali è stato supervisionato dal Comitato per la cura degli animali dell’Università di Calgary. I mouse CD1 utilizzati per l’esperimento sono stati acquistati da un fornitore commerciale. 1. Preparazione di soluzioni NOTA Per prevenire la degradazione dell’RNA, spruzzare il workbench e tutte le apparecchiature con soluzione di decontaminazione RNasi. Per l’esperimento vengono utilizzate punte senza RNasi. Tutte le soluzioni sono preparate in acqu…

Representative Results

Come dimostrazione, il lisato corticale contenente 75 μg di RNA (raggruppato da 8 embrioni) è stato separato dal gradiente di saccarosio in 12 frazioni. Picchi di assorbanza UV a 254 nm hanno identificato frazioni contenenti la subunità 40S, la subunità 60S, il monosome 80S e i polisomi(Figura 4A). Analisi delle frazioni per macchia occidentale per la grande subunità ribosomiale, Rpl10 ha mostrato la sua presenza nella subunità 60S (frazione 3), monosome (frazione 4) e polisomei (frazi…

Discussion

La profilazione polisoma è una tecnica comunemente usata e potente per valutare lo stato traslazione sia a livello di singolo gene che di genoma14 . In questo report, presentiamo un protocollo di profilazione polisoma utilizzando una piattaforma assemblata in casa e la sua applicazione per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Questa piattaforma economica è facile da assemblare e generare gradienti di saccarosio robusti e riproducibili e profilazione polisoma con elevata sensibil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da un NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. è una presidente di ricerca canadese. S.K. è stato finanziato dalla Mitacs Globalink Graduate Fellowship e dalla Borsa di studio per studenti laureati ACHRI.

Materials

1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

References

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Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

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