Summary

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Published: May 22, 2021
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Summary

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Abstract

Le bon développement du cerveau mammifère repose sur un équilibre fin de la prolifération et de la différenciation des cellules souches neurales en différents types de cellules neurales. Cet équilibre est étroitement contrôlé par l’expression des gènes qui est peaufinée à plusieurs niveaux, y compris la transcription, la post-transcription et la traduction. À cet égard, un nombre croissant de preuves mettent en évidence un rôle essentiel de la régulation translationnelle dans la coordination des décisions relatives au sort des cellules souches neurales. La fractionnement polysome est un outil puissant pour l’évaluation du statut translationnel de l’ARNm aux niveaux génétique global et individuel. Ici, nous présentons un pipeline interne de profilage polysome pour évaluer l’efficacité translationnelle dans les cellules du cortex cérébral de souris en développement. Nous décrivons les protocoles pour la préparation de gradient de saccharose, la lyse de tissu, l’ultracentrifugation et l’analyse fractionnée-basée de l’état translationnel d’ARNm.

Introduction

Pendant le développement du cerveau des mammifères, les cellules souches neurales prolifèrent et se différencient pour générer des neurones et desgliales 1,2 . La perturbation de ce processus peut mener aux changements dans la structure et la fonction de cerveau, comme vu dans beaucoup de désordres neurodevelopmental3,4. Le bon comportement des cellules souches neurales nécessite l’expression orchestrée de gènes spécifiques5. Tandis que le contrôle épigénétique et transcriptionnel de ces gènes a été intensivement étudié, les résultats récents suggèrent que la régulation de gène à d’autres niveaux contribue également à la coordination de la prolifération et de la différenciation neuralesde cellules souches 6,7,8,9,10. Ainsi, la résolution des programmes de contrôle translationnel fera grandement progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la décision sur le sort des cellules souches neurales et au développement du cerveau.

Trois techniques principales avec des forces différentes ont été largement appliquées pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, y compris le profilage ribosome, la traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) et le profilage polysome. Le profilage ribosome utilise le séquençage de l’ARN pour déterminer les fragments d’ARNm protégés par le ribosome, ce qui permet à l’analyse globale du nombre et de l’emplacement des ribosomes de traduction sur chaque transcription d’inférer indirectement le taux de traduction en le comparant à l’abondance detranscription 11. TRAP tire parti des protéines ribosomiques marquées d’épitope pour capturer les ARNM ribosome-liés12. Étant donné que les protéines ribosomiques étiquetées peuvent être exprimées dans des types de cellules spécifiques à l’aide d’approches génétiques, TRAP permet l’analyse de la traduction d’une manière spécifique au type de cellule. En comparaison, le profilage polysome, qui utilise la fractionnement du gradient de densité saccharose pour séparer la partie libre et mal traduite (monosomes plus légers) de ceux qui sont activement traduits par des ribosomes (polysomes plus lourds), fournit une mesure directe de la densité ribosome surl’ARNm 13. Un avantage de cette technique est sa polyvalence pour étudier la traduction de l’ARNm spécifique d’intérêt ainsi que l’analyse du traduislatome à l’échelledu génome 14.

Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé de profilage polysome pour analyser le cortex cérébral de souris en développement. Nous utilisons un système assemblé à domicile pour préparer les gradients de densité du saccharose et recueillir des fractions pour les applications en aval. Le protocole présenté ici peut être facilement adapté pour analyser d’autres types de tissus et d’organismes.

Protocol

Toute l’utilisation des animaux a été supervisée par le Comité de protection des animaux de l’Université de Calgary. Les souris CD1 utilisées pour l’expérience ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial. 1. Préparation de solutions REMARQUE Pour prévenir la dégradation de l’ARN, vaporisez l’établi et tout l’équipement avec la solution de décontamination RNase. Les conseils sans RNase sont utilisés pour l’expérience. Toutes l…

Representative Results

À titre de démonstration, le lysate cortical contenant 75 ARN μg (mis en commun à partir de 8 embryons) a été séparé par le gradient de saccharose en 12 fractions. Pics d’absorption UV à 254 nm fractions identifiées contenant le sous-unité 40S, sous-unité 60S, monosome 80S et polysomes (Figure 4A). Analyse des fractions par tache occidentale pour la grande sous-unité ribosomique, Rpl10 a montré sa présence dans la sous-unité 60S (fraction 3), monosome (fraction 4) et polyso…

Discussion

Le profilage polysome est une technique couramment utilisée et puissante pour évaluer l’état translationnel à la fois au niveau d’un seul gène et à l’échelle dugénome 14 . Dans ce rapport, nous présentons un protocole de profilage polysome à l’aide d’une plate-forme assemblée à domicile et son application pour analyser le cortex de souris en développement. Cette plate-forme rentable est facile à assembler et à générer des gradients de saccharose robustes et reproductible…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par une subvention découverte du CSERN (RGPIN/04246-2018 à G.Y.). G.Y. est chaire de recherche du Canada. S.K. a été financé par mitacs Globalink Graduate Fellowship et ACHRI Graduate Student Scholarship.

Materials

1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

References

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Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

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