Summary

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Published: May 22, 2021
doi:

Summary

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Abstract

El desarrollo adecuado del cerebro de los mamíferos se basa en un fino equilibrio de proliferación de células madre neurales y diferenciación en diferentes tipos de células neuronales. Este equilibrio está estrictamente controlado por la expresión génica que está afinada en múltiples niveles, incluyendo transcripción, post-transcripción y traducción. En este sentido, un creciente cuerpo de evidencia destaca un papel crítico de la regulación traslacional en la coordinación de las decisiones sobre el destino de las células madre neurales. El fraccionamiento de polisomas es una poderosa herramienta para la evaluación del estado traslacional del ARNM tanto a nivel global como individual. Aquí, presentamos una tubería interna de perfiles de polisoma para evaluar la eficiencia traslacional en las células de la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Describimos los protocolos para la preparación del gradiente de sacarosa, lisis tisular, ultracentrifugación y análisis basado en fraccionamientos del estado traslacional del ARNm.

Introduction

Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, las células madre neurales proliferan y se diferencian para generar neuronas y glia1,2. La perturbación de este proceso puede conducir a alteraciones en la estructura y función cerebral, como se ve en muchos trastornos del neurodesarrollo3,4. El comportamiento adecuado de las células madre neurales requiere la expresión orquestada de genes específicos5. Si bien el control epigenético y transcripcional de estos genes ha sido estudiado intensamente, hallazgos recientes sugieren que la regulación genética a otros niveles también contribuye a la coordinación de la proliferación y diferenciación de células madre neuronales6,7,8,9,10. Por lo tanto, abordar los programas de control traslacional avanzará en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la decisión del destino de las células madre neuronales y el desarrollo del cerebro.

Se han aplicado ampliamente tres técnicas principales con diferentes fortalezas para evaluar el estado traslacional del ARNM, incluyendo la elaboración de perfiles ribosomas, la purificación de afinidad ribosoma traducible (TRAP) y el perfilado de polisomas. La elaboración de perfiles ribosomas utiliza secuenciación de ARN para determinar fragmentos de ARNM protegidos por ribosomas, lo que permite el análisis global del número y la ubicación de los ribosomas traduciendo en cada transcripción para inferir indirectamente la tasa de traducción comparándola con la abundancia de transcripción11. TRAP aprovecha las proteínas ribosomales etiquetadas con epitopos para capturar los mRNAs ribosomas unidos al ribosoma12. Dado que las proteínas ribosomales etiquetadas se pueden expresar en tipos celulares específicos utilizando enfoques genéticos, TRAP permite el análisis de la traducción de una manera específica del tipo celular. En comparación, la elaboración de perfiles de polisomas, que utiliza el fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa para separar la porción libre y mal traducida (monosomas más ligeros) de aquellos que se traducen activamente por ribosomas (polisomas más pesados), proporciona una medición directa de la densidad ribosoma en el ARNm13. Una ventaja que ofrece esta técnica es su versatilidad para estudiar la traducción de mRNA específica de interés, así como el análisis de translatome en todo el genoma14.

En este artículo, describimos un protocolo detallado de perfilado de polisoma para analizar la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Utilizamos un sistema ensamblado en casa para preparar gradientes de densidad de sacarosa y recoger fracciones para aplicaciones posteriores. El protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente para analizar otros tipos de tejidos y organismos.

Protocol

Todo el uso de animales fue supervisado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Calgary. Los ratones CD1 utilizados para el experimento fueron comprados al proveedor comercial. 1. Preparación de soluciones NOTA Para evitar la degradación del ARN, rocíe la mesa de trabajo y todos los equipos con solución de descontaminación RNase. Los consejos sin RNase se utilizan para el experimento. Todas las soluciones se preparan en agua sin RNase. P…

Representative Results

Como demostración, el lisato cortical que contenía 75 μg de ARN (agrupado de 8 embriones) fue separado por el gradiente de sacarosa en 12 fracciones. Picos de absorbancia UV a 254 nm identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S, subunidad 60S, monosoma 80S y polisomas (Figura 4A). Análisis de fracciones por mancha occidental para la gran subunidad ribosomal, Rpl10 mostró su presencia en la subunidad 60S (fracción 3), monosoma (fracción 4) y polisomas (fracciones 5-12) (<str…

Discussion

El perfilado de polisomas es una técnica comúnmente utilizada y potente para evaluar el estado traslacional en niveles únicos de genes y de todo el genoma14. En este informe, presentamos un protocolo de perfilado de polisoma utilizando una plataforma montada en casa y su aplicación para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Esta plataforma rentable es fácil de montar y generar gradientes de sacarosa robustos y reproducibles y perfiles de polisoma con alta sensibilidad.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. es una Cátedra de Investigación de Canadá. S.K. fue financiado por Mitacs Globalink Graduate Fellowship y ACHRI Graduate Student Scholarship.

Materials

1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

References

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Cite This Article
Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

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