Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62104
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Universidad Nacional de Colombia

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.

Abstract

תאי שיער באוזן הפנימית מזהים תזוזות המושרות בצליל ומעבירים גירויים אלה לאותות חשמליים בחבילת שיער המורכבת מסטריאוציליה המסודרת בשורות של גובה הולך וגדל. כאשר סטריאוטיפיליה מסויטה, הם מושכים על קצה חוץ-תאי זעיר (~ 5 ננומטר) קישורי סטריאוציליה מחוברים, אשר מעבירים כוחות לערוצי transduction mechanosensitive. למרות mechanotransduction נחקר בתאי שיער חיים במשך עשרות שנים, הפרטים האולטרה-מבניים החשובים מבחינה תפקודית של מכונות mechanotransduction בקצה סטריאוטיפיליה (כגון דינמיקה קישור קצה או שיפוץ סטריוציליה תלויות טרנסדוקציה) עדיין ניתן ללמוד רק בתאים מתים עם מיקרוסקופיה אלקטרונית. תיאורטית, לטכניקות סריקה של בדיקה, כגון מיקרוסקופיית כוח אטומי, יש מספיק רזולוציה כדי לדמיין את פני השטח של סטריאוטיפיליה. עם זאת, ללא תלות במצב הדמיה, אפילו המגע הקל ביותר של גשושית מיקרוסקופיה כוח אטומי עם חבילת סטריאוטיפיליה בדרך כלל פוגע בצרור. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופיית מוליכת יונים בדיקה מקפץ (HPICM) הדמיה של תאי שיער שמיעתי מכרסמים חיים. טכניקת בדיקה זו ללא מגע סריקה מאפשרת הדמיה של זמן לשגות של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת, כמו תאי שיער, עם רזולוציה של ננומטר יחיד ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. HPICM משתמש בזרם חשמלי העובר דרך ננו-צינור הזכוכית כדי לזהות את פני התא בקרבתו לפיפטה, בעוד שמערכת פיזואלקטרית הממוקמת בתלת-ממד סורקת את פני השטח ומייצרת את תמונתו. עם HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוטיפיליה ואת הקישורים המחברים סטריוציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים במשך מספר שעות ללא נזק מורגש. אנו צופים כי השימוש ב- HPICM יאפשר חקירה ישירה של שינויים אולטרה-מבניים בסטריאוטיפיליה של תאי שיער חיים להבנה טובה יותר של תפקודם.

Introduction

למרות העובדה כי חבילות סטריאוסיליה בתאי השיער השמיעתיים גדולות מספיק כדי להיות דמיינו על ידי מיקרוסקופיה אופטית ולהסיט בתאים חיים בניסוי מהדק תיקון, המרכיבים המבניים החיוניים של מכונות transduction כגון קישורי קצה ניתן לדמיין רק עם מיקרוסקופיית אלקטרונים בתאים מתים. בתאי השיער השמיעתי של היונקים, מכונות התמרה ממוקמות בקצוות התחתונים של קישורי הקצה, כלומר, בקצות סטריאציליה שורה קצרהיותר 1 ומוסדרת באופן מקומי באמצעות האיתות בקצות סטרירוצ'ליה2,3. עם זאת, הדמיה ללא תוויות של מבני פני השטח במיקום זה בתאי שיער חיים אינה אפשרית בשל הגדלים הקטנים של סטריאוטיפיליה.

ללולאה היונקים יש שני סוגים של תאים חושיים שמיעתיים: תאי שיער פנימיים וחיצניים. בתאי השיער הפנימיים, סטריוציליה ארוכה ועבה יותר בהשוואה לאלו בתאי השיער החיצוניים4. השורה הראשונה והשנייה של סטריאוטיפיליה יש קוטר של 300-500 ננומטר בתאי שיער פנימיים עכבר או חולדה. בשל עקיפה של אור, הרזולוציה המרבית בר השגה עם מיקרוסקופיה אופטית ללא תווית היא כ 200 ננומטר. לפיכך, הדמיה של סטריאוטיפיליה בודדת בתוך השורות הראשונה והשנייה של חבילת תא השיער הפנימית קלה יחסית עם מיקרוסקופיה אופטית. לעומת זאת, סטריאוטיפיליה שורה קצרה יותר בתאי השיער הפנימיים וכל הסטריאוטיליה של תאי השיער החיצוניים יש קוטרים סביב 100-200 ננומטר ולא ניתן לדמיין עם מיקרוסקופיה אופטית5. למרות ההתקדמות האחרונה בהדמיה ברזולוציית-על, מגבלה בסיסית זו נמשכת בכל הדמיה אופטית ללא תוויות. כל הטכניקות הנוכחיות הזמינות מסחרית סופר רזולוציה דורשות סוג כלשהו של מולקולות פלואורסצנטיות6, אשר מגביל את היישומים שלהם. בנוסף למגבלות בשל הצורך במולקולות ספציפיות מתויגות פלואורסצנטיות, הוכח כי חשיפה להקרנת אור אינטנסיבית גורמת לנזק תאי ועשויה להשפיע על תהליכים תאיים, המהווה חיסרון גדול בחקר תאים חיים7.

הידע הנוכחי שלנו על הפרטים האולטרה-מבניים של חבילות סטריאציליה של תאי שיער הושג בעיקר בטכניקות מיקרוסקופיה אלקטרוניות (EM) שונות, כגון סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), שבר בהקפאה EM, ולאחרונה עם טכניקות תלת-ממד כגון חתך סדרתי עם קרן יונים ממוקדת או טומוגרפיה קריו-EM8,9,10,11,12,13, 14,15,16. למרבה הצער, כל טכניקות EM אלה דורשות כימי או cryofixation של המדגם. בהתאם לסולם הזמן של התופעות, דרישה זו הופכת את המחקר של התהליכים הדינמיים בקצות סטריאוטיפיליה לבלתי אפשרי או מאוד אינטנסיבי בעבודה.

נעשו מאמצים מוגבלים לדמיין חבילות שיער של תאי שיער חיים עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM)17,18. מכיוון ש-AFM פועלת בפתרונות פיזיולוגיים, היא יכולה, בתיאוריה, לדמיין שינויים דינמיים בחבילות הסטריאוטיליה של תאי שיער חיים לאורך זמן. הבעיה נעוצה בעקרונות של AFM ברזולוציה גבוהה, המרמזת על מגע פיזי מסוים בין הבדיקה AFM לבין המדגם, אפילו במצב "הקשה" הכי פחות מזיק19. כאשר הגשושית AFM נתקלת בסטריאוטיניום, היא בדרך כלל מתרסקת עליו, ופוגעת במבנה של חבילת השיער. כתוצאה מכך, טכניקה זו אינה מתאימה לדמיין חיים, או אפילו קבוע, תאי שיער חבילות17,18. הבעיה עשויה להיות הקלה חלקית באמצעות בדיקה AFM בצורת כדור גדול המטיל רק כוחות הידרודינמיים על פני השטח של המדגם20. עם זאת, למרות בדיקה כזו מתאימה באופן אידיאלי כדי לבדוק תכונות מכניות של המדגם21, הוא מספק רק רזולוציה תת מיקרומטר בעת הדמיה האיבר של Corti22 ועדיין חל על המדגם כוח שעשוי להיות משמעותי עבור חבילות סטריאוטיפיליה רגיש מאוד.

סריקת מיקרוסקופיית מוליכת יונים (SICM) היא גרסה של מיקרוסקופיית בדיקה סריקה המשתמשת בגשושית פיפטה מזכוכית מלאה בתמיסה מוליכת23. SICM מזהה את פני השטח כאשר הפיפטה מתקרבת לתא והזרם החשמלי דרך הפיפטה פוחת. מאז זה קורה הרבה לפני נגיעה בתא, SICM מתאים באופן אידיאלי עבור הדמיה ללא מגע של תאים חיים בפתרון פיזיולוגי24. הרזולוציה הטובה ביותר של SICM היא בסדר של ננומטר יחיד, המאפשר פתרון מתחמי חלבון בודדים בקרום הפלזמה של תא חי25. עם זאת, בדומה לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, SICM מסוגל לדמיין רק משטחים שטוחים יחסית. התגברנו על מגבלה זו על ידי המצאת מיקרוסקופ מוליכת יון בדיקה מקפץ (HPICM)26, שבו הננו-צינור מתקרב לדגימה בכל נקודת הדמיה(איור 1A). באמצעות HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוסיליה בתאי שיער שמיעתיים חיים ברזולוציה ננומטרית27.

יתרון בסיסי נוסף של טכניקה זו הוא כי HPICM הוא לא רק כלי הדמיה. בניגוד לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, הבדיקה HPICM / SICM היא אלקטרודה הנמצאת בשימוש נרחב בפיזיולוגיה של תאים להקלטות חשמליות ואספקה מקומית של גירויים שונים. פעילות ערוץ יון אינה מפריעה בדרך כלל להדמיית HPICM, מכיוון שהזרם הכולל באמצעות הבדיקה HPICM הוא מספר סדרי גודל גדולים יותר מהזרם החוץ-תאי שנוצר על-ידי ערוצי היון הגדולים ביותר25. עם זאת, HPICM מאפשר מיקום מדויק של nanopipette מעל מבנה של עניין והקלטת מהדק תיקון בערוץ יחיד לאחר מכן ממבנה זה28. כך השגנו את ההקלטות הראשוניות הראשונות של פעילות ערוץ יחיד בקצות סטריוציליה של תא השיער החיצוני29. ראוי להזכיר כי אפילו זרם גדול דרך nanopipette לא יכול לייצר שינויים משמעותיים של הפוטנציאל על פני קרום הפלזמה בשל דלף חשמלי עצום של המדיום החוץ תאי. עם זאת, ערוצי יונים בודדים יכולים להיות מופעלים באופן מכני על ידי זרימת נוזל דרך nanopipette30 או כימית על ידי יישום מקומי של אגוניסט31.

ב-HPICM, התמונה נוצרת כאשר ננו-אפיפט ניגש ברצף לדגימה בשלב מסוים, נסוג ואז נע בכיוון רוחבי כדי לחזור על הגישה (איור 1A). מגבר מהדק תיקון מחיל כל הזמן מתח על חוט AgCl בפיפטה (איור 1B) כדי ליצור זרם של ~ 1 nA בתמיסת האמבטיה. הערך של זרם זה כאשר הפיפטה רחוקה מפני השטח של התא נקבע כזרם ייחוס(אניחוזר, איור 1C). לאחר מכן, הפיפטה נעה בציר Z כדי להתקרב לדגימה עד שהזרם יופחת בסכום שהוגדר מראש על-ידי המשתמש (setpoint), בדרך כלל 0.2%-1% מהנציג של I (איור 1C, מעקב עליון). לאחר מכן המערכת שומרת ערך Z ברגע זה כגובה המדגם, יחד עם קואורדינטות X ו- Y של נקודת הדמיה זו. לאחר מכן, הפיפטה נסוגה מפני השטח(איור 1C,מעקב תחתון) במהירות שהוגדרה על ידי המשתמש, בדרך כלל 700-900 ננומטר/ms. לאחר הנסיגה, הפיפטה (או, במקרה שלנו, המדגם - ראה איור 1B) מועבר לרוחב לנקודת ההדמיה הבאה, מתקבל ערך זרם ייחוס חדש, והפפטה שוב מתקרבת לדגימה, חוזרת על התהליך. תנועת X-Y של הפיפטה עדיפה במערך מיקרוסקופ זקוף המשמש בדרך כלל להקלטות של זרמי המכנוטרנסדוקציה של תאי השיער. בהגדרה זו, הבדיקה HPICM מתקרבת לחבילות תאי השיער לא מלמעלה אלא בזווית32. עם זאת, הרזולוציה הטובה ביותר של הדמיית HPICM מושגת במערך מיקרוסקופ הפוך (איור 1A,B),שבו התנועה של המדגם בכיווני X-Y היא דה-מצמיד מ Z-תנועה של nanopipette, ובכך ביטול חפצים מכניים פוטנציאליים.

באמצעות HPICM, השגנו תמונות טופוגרפיות של חבילות סטריאוטיפיליה פנימיות וחתריות של עכבר וחולדה, ואפילו דמיינו את הקשרים בין הסטריאוטיפיליה בקוטר של כ -5 ננומטר26,27. ההצלחה של הדמיית חבילת תאי שיער בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. ראשית, הרעש (השונות) של זרם הננו-צינור צריך להיות קטן ככל האפשר כדי לאפשר את נקודת הקבע הנמוכה ביותר האפשרית עבור הדמיית HPICM. נקודת קבע נמוכה מאפשרת לגשושית HPICM "לחוש" משטח סטריוציליה במרחק גדול יותר ובכל זווית לגישת הגשושית, ובאופן מפתיע, משפרת את רזולוציית X-Y של הדמיית HPICM (ראה דיון). שנית, יש להקטין את התנודות והסחף במערכת לפחות מ -10 ננומטר, שכן הם תורמים ישירות לחפצי ההדמיה. לבסוף, למרות שגשושית HPICM ושלב הדגימה מועברות בצירי Z ו- X-Y על ידי מפעילי פיזו מכוילים הנשלטים על ידי משוב שיש להם דיוק של ננומטר יחיד או טוב יותר, הקוטר של קצה הננופיט קובע את התפשטות הזרם (נפח חישה) ומכאן הרזולוציה (איור 1A). לכן, לפני הדמיית תאי שיער חיים, חשוב למשוך את פיפטות נאותה, להגיע לרזולוציה הרצויה עם דגימות כיול, ולהשיג רעש נמוך במערכת ההקלטה.

במשך כמה עשורים לפחות, טכניקת SICM לא הייתה זמינה מסחרית והיא מתפתחת על ידי מעבדות מעטות בלבד בעולם עם המעבדה המובילה של פרופ 'קורצ'ב במכללה הקיסרית (בריטניה). לאחרונה, מספר מערכות SICM הפכו לזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים), כולן מבוססות על עקרונות HPICM המקוריים. עם זאת, חבילות סטריאציליה הדמיה בתאי השיער דורשת מספר שינויים מותאמים אישית כי הם מאתגרים מבחינה טכנית (או אפילו בלתי אפשרי) במערכות סגורות "מוכן ללכת". לכן, יש צורך בשילוב רכיבים מסוימים. מכיוון שהגדרת HPICM מייצגת אסדת מהדק תיקון עם דרישות רטט וסחף מחמירות יותר ותנועה מונעת פיזו של גשושית HPICM והמדגם (איור 1D), שילוב זה קל יחסית לכל חוקר, הבקיא בהידוק תיקונים. עם זאת, מדען ללא רקע מתאים בהחלט צריך קצת הכשרה אלקטרופיזיולוגיה ראשונה. למרות האתגרים שנותרו כגון הגדלת מהירות ההדמיה (ראה דיון), הצלחנו לדמיין חבילות סטריאציליה בתאי שיער חיים ברזולוציה ננומטרית מבלי לפגוע בהם.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה מוצלחת של HPICM של חבילות תאי שיער שמיעתיים חיים בחולדה צעירה לאחר הולדות או בגולשי שבלול עכברים צעירים באמצעות המערכת המותאמת אישית שלנו. הרכיבים המשולבים מפורטים בטבלת החומרים. המאמר מתאר גם בעיות נפוצות שניתן להיתקל בהן וכיצד לפתור אותן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר נערך בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת קנטאקי (פרוטוקול 00903M2005).

1. ייצור ובדיקה של הננו-פיפטים

  1. צור תוכנית ב puller micropipette כדי להשיג pipettes עם התנגדות בין 200 ל 400 MΩ, אשר מתאים קטרי קצה פנימי של כ 50-70 ננומטר. הפרמטרים יהיו תלויים במשיכת המיקרופיפט. כדי להשיג פיפטות קצרות עם טיפים עדינים לא גמישים, בדוק את המדריך התפעולי של הממשוך.
  2. השתמש נימי זכוכית borosilicate עם קוטר חיצוני / פנימי של 1/0.58 מ"מ חוט פנימי כדי להקל על מילוי. אורך הפיפטה הוא קריטי מכיוון שהוא קובע את תדירות התהודה המכנית לרוחב של הפיפטה. ככל שהאיפפטה ארוכה יותר, כך התדירות התהודה נמוכה יותר וקשה יותר להימנע מהתהודה הזו.
    הערה: המשתמש צריך לנסות לייצר את הפיפטה הקצרה ביותר שהמחזיק יכול לקבל. אורך הננו-פיפטים בניסוי זה הוא בדרך כלל 15-25 מ"מ (איור 2A).
  3. מלאו את הננו-פייט עד לנקודת האמצע שלו(איור 2A)בתמיסת אמבט, L-15 של ליבוביץ' או בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) בתוספת 20 מ"מ של גלוקוז D (להתאמת אוסמולאריות). כדי להימנע מחפצים פוטנציאליים, השתמש באותו פתרון שישמש באמבטיה להקלטות.
  4. באמצעות מיקרוסקופ אופטי עם הגדלה של פי 10, בדוק אם יש בועות בקצה הפיפטה(איור 2B). הבועות ימנעו את הזרימה הנוכחית. קשה יותר להסיר בועות בפיפטות שנמשכו מספר שעות לפני הניסוי. לכן, מומלץ למשוך פיפטות חדשות עם כל ניסוי.
  5. לאחר שהפיפטה נקייה מבועות, הרכיבו אותה במחזיק הפיפטה HPICM(איור 2C).
  6. הנח את המדגם (תקן רקמה או כיול) על התא שנבנה בהתאמה אישית והוסף 4 מ"ל של פתרון האמבטיה הנ"ל.
  7. הנח את התא שנבנה בהתאמה אישית על במת HPICM והכנס את האלקטרודה הקרקעית בפתרון.
  8. ודא כי המתח המוחל על pipette על ידי מגבר מהדק תיקון הוא אפס.
  9. מעבירים את הפיפטה ב-Z עד שהיא נוגעת בנוזל.
  10. הגדר את היסט המגבר לאפס ולאחר מכן הוסף +100 mV כדי לבדוק את זרם ה- pipette.
  11. חשב את ההתנגדות ואת הקוטר של הפיפטה, בהתבסס על החוק של Ohm:
    R = V/I
    כאשר R הוא ההתנגדות (MOhm), V הוא המתח המוחל על הננופיט (mV) ואני הזרם הזורם דרך הננופיט (nA).
    1. חשב את הקוטר הפנימי של הפיפטה כמתואר במקום אחר על פי הנוסחה הבאה12:
      טיפ מזהה = 1000/ √R
      הערה: ערך ההתנגדות האידיאלי הוא בין 200 ל 400 MΩ. פיפטות עם התנגדות גבוהה מ-400 MΩ עלולות להוביל לזרם לא יציב בשל גודלן הקטן (< 50 ננומטר בקוטר פנימי). להיפך, פיפטות עם התנגדויות קטנות מ-200 MΩ גדולות מדי (> בקוטר פנימי של 70 ננומטר) ולא יפתרו תכונות קטנות. מומלץ להתחיל הדמיה עם פיפטות של 200 MΩ התנגדות, כפי שהם קלים יותר לייצור נוטים לספק פחות רעש חשמלי.

2. מזעור הסחף והתנודות לדוגמה

הערה: כדי להקטין את הרעש המכני במערכת במהלך ההדמיה, הר את הדגימות על התאים שנבנו בהתאמה אישית המשתמשים בשקופיות זכוכית עבות (~ 1.2 מ"מ):

  1. הסר את חלק הזכוכית את צלחת 50 מ"מ זכוכית תחתונה, משאיר את קירות הפלסטיק שלמים.
  2. הדבק את חלק הפלסטיק של צלחת תרבית התא על גבי שקופית זכוכית עבה עם דבק סיליקון.
  3. הר את דגימת הכיול באמצע התא (על גבי מגלשת הזכוכית) באמצעות דבק סיליקון או סרט דו-צדדי דק.
  4. אבטחו היטב את התא על במת HPICM באמצעות סרט דו-צדדי.
  5. במהלך ההדמיה, סגור את כלוב פאראדיי וכסה אותו בשמיכה כדי למזער הפרעות חשמליות וסחף תרמי, בהתאמה.

3.בדיקת הרזולוציה באמצעות תקני כיול AFM

הערה: מומלץ מאוד לדמיין תקני AFM (ראה טבלת חומרים) לפני הדמיית תאים חיים כדי לפתור בעיות במערכת ולבדוק את הרזולוציה שלה בצירי X-Z-Y. תקני הכיול כוללים עמודי צורן דו-חמצני וחורים בצורות שונות, אך גבהים/עומקים קבועים (כלומר, 20 או 100 ננומטר) על שבב סיליקון 5 x 5 מ"מ. החל בתקן הכיול של 100 ננומטר מומלץ, כדי להבטיח כי רזולוציית Z היא מתחת ל- 100 ננומטר. לאחר השגת תמונה מוצלחת ברזולוציה גבוהה של העמודים או החורים במדגם כיול זה (איור 3A),עבור לתקן של 20 ננומטר. אם ההדמיה של התקן האחרון מוצלחת (איור 3B), הרזולוציה בציר Z מובטחת להיות מתחת ל-20 ננומטר ומתאימה להדמיה של חבילות סטריוציליה של תאי השיער12. השלבים הבאים משמשים לתמונה של שני תקני הכיול.

  1. חבר את תקן הכיול לתא עם דבק סיליקון.
  2. הוסף 4 מ"ל של HBSS לתא כדי לכסות את דגימת הכיול. לאחר מכן, אבטח את התא לשלב XY של הגדרת HPICM באמצעות סרט דו-צדדי.
  3. מהדקים את המחזיק המגנטי של האלקטרודה הקרקעית לשלב הסמוך לתא ושקועים באלקטרודה בתמיסת האמבטיה(איור 1B).
  4. הר את nanopipette לתוך המחזיק, לטבול אותו לתוך פתרון האמבטיה, ולהגדיר את הזרם שלה ~ 1 nA בעקבות השלבים המתוארים בסעיף 1.
  5. מקם את הננו-צינור בערך מעל מרכז תקן הכיול באמצעות מניפולטור מהדק מסלול. בדיקה חזותית היא בדרך כלל מספיקה עבור מיקום זה, שכן האזור מכוסה מבנים צורן דו חמצני הוא גדול יחסית (1 x 1 מ"מ). בניגוד לאיבר של Corti explants (ראה להלן), תקן הכיול אינו שקוף, ולכן, מיקום מדויק יותר מונחה על ידי הדמיה אופטית אינו אפשרי עבור מדגם זה.
  6. הגדל את נקודת התפאורה בעת ניטור האות מהחיישן של מפעיל Z piezo על אוסצילוסקופ בזמן אמת. לאחר יצירת מחזור גישת Z יציב שניתן לחזור עליו (כמו באיור 1C, למטה), הקטן את נקודת הערך לערך שנמצא מעט מעל נקודת חוסר היציבות. הליך זה יבטיח את נקודת הקבע האופטימלית עבור ננו-צינור מסוים זה.
  7. הזז את הפיפטה למטה במהירות של ~ 5 מיקרומטר / s עם מיקרומניפולטור מהדק תיקון עד שהוא מגיע לדגימה. ברגע זה, הרמה התחתונה של אות מיקום Z בזמן אמת (איור 1C) תגדל, מה שמצביע על כך שהננופיט נסוג עקב "חישה" של משטח המדגם. כל תנועה נוספת של הננו-צינור תגרום לשינוי חיובי נוסף של אות מיקום Z.
    הערה: היזהר לא לחרוג מהגבול העליון של תנועת מפעיל Z piezo.
  8. התחל הדמיה ברזולוציה נמוכה (ראה טבלה 1). בשל הרכבה לא אחידה של תקן AFM, הנקודה הגבוהה ביותר של תחום העניין עשויה להיות לא ידועה. לכן, להגדיר את המשרעת של נסיגה פיפטה (משרעת הופ) לפחות 200-500 ננומטר.
    1. לאחר שזוהתה הנקודה הגבוהה ביותר של המדגם באזור ההדמיה, הפחיתו את משרעת הדילוג. משרעת קפיצה קטנה יותר מאפשרת סריקה מהירה יותר, המועדפת על הדמיה ברזולוציה גבוהה בשל השפעות מופחתות של הסחף וירידה ברטט.
  9. לפני העברת הפיפטה למיקום X-Y חדש, חזרו בהם כ-200 מיקרומטר בציר Z כדי למנוע התנגשויות לא רצויות עם המדגם.
    הערה: במקרים שבהם הננו-צינור אינו מיושר עם מרכז תקן הכיול, ייתכן שהסריקה מתחילה ממש מחוץ לאזור תכונות פני השטח.
  10. לאחר שנמצא תחום העניין, התחל הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר (ראה טבלה 1).

4. הכנת תאים שנבנו בהתאמה אישית לאבטחת מסלקי שבלול

הערה: הר את מסלקי השבלול בתאים עם מערכות הידוק שנבנו בהתאמה אישית המשתמשות בפיפטות זכוכית גמישות (שלב 4.1) (איור 4A) או בחוט דנטלי (שלב 4.2) (איור 4B). תא פיפטת הזכוכית יכול להיות מעוקר ולהשתמש באיברים התרבותיים של קורטי, בעוד תא חוט דנטלי מספק אחיזה בטוחה יותר של המדגם ושליטה על אוריינטציה חבילת סטריאציליה במהלך הרכבה. חדרים מותאמים אישית אלה צריכים להיות מוכנים מראש, אך ניתן לנקות אותם ולהשתמש בהם מחדש במספר מפגשי הדמיה.

  1. הפוך תא באמצעות pipettes זכוכית גמישה
    1. משכו שני סיבי זכוכית דקים וגמישים מנימי זכוכית באמצעות פולר פיפטה. סיבי הזכוכית המושכים שלנו מודדים בדרך כלל באורך של 1 עד 2 ס"מ והם גמישים למדי.
    2. מניחים טיפה קטנה של אלסטומר הסיליקון על גבי כיסוי זכוכית. השתמש כיסויים בקוטר 2 ס"מ.
    3. מניחים את הקצוות של שני סיבי זכוכית על טיפת הסיליקון ומסדרים את הסיבים כך שתהיה מידה קטנה של הפרדה ביניהם (איור 4A).
    4. מניחים את כיסוי על צלחת חמה כדי לרפא במהירות את elastomer (1 עד 3 דקות).
    5. הדבק את כיסוי על תחתית הזכוכית של התא המתואר בסעיף 2 באמצעות כמות קטנה (1-3 μL) של אלסטומר סיליקון ומאפשר לו לרפא בן לילה.
  2. הכנת תא באמצעות חוט דנטלי:
    1. הסר את חלק הזכוכית של צלחת 50 מ"מ זכוכית תחתון, משאיר את קירות הפלסטיק שלמים. לאחר מכן הדבק את חלק הפלסטיק של צלחת תרבית התא על גבי שקופית זכוכית בעובי 1.2 מ"מ עם דבק סיליקון.
    2. הר מכסה פלסטיק אחד (6.5 x 6.5 מ"מ) עם אותו דבק למרכז התא. לאחר מכן חזור על התהליך עם כיסוי אחר על גבי הקודם.
    3. הר שני חוטי טונגסטן קטנים או מצופים זהב (12 מ"מ אורך וקוטר ~ 0.5 מ"מ) עם דבק סיליקון, כל אחד בצדדים הפכים של שקופיות הכיסוי. הדבק אותם מספיק רחוק (> 10-15 מ"מ) מהשקופיות הכריכה(איור 4B).
    4. להפריד שני גדילי חוט דנטלי ולהניח אותם על גבי שקופיות הכיסוי ולאבטח אותם החוטים על ידי יצירת קשר. השאירו פער קטן בין שני הגדילים(איור 4B,חצים קצרים).
  3. נקו את התאים לאחר כל שימוש
    1. מוציאים בעדינות את הרקמה מהתא בעזרת פינצטה עדינה ומגרדים קלות את שאריות הרקמות שנותרו מאחור.
    2. לשטוף את התא תחילה עם 70% אתנול ולאחר מכן עם מים מזוקקים.
    3. יש לחזור על מחזור השטיפה במידת הצורך.
    4. מניחים את התא הפוך על נייר סינון כדי לתת לו להתייבש עד הניסוי הבא. החדרים אינם צריכים להיות מעוקרים, אלא אם כן פולחן של האיבר של קורטי מתוכנן לאחר ההדמיה.

5. לנתח את איבר המכרסם של קורטי

  1. בצע ניתוח של גולות שבלול לאחר הלידה הצעירים כמתואר בפירוט במקום אחר13.
  2. עבור הדמיית HPICM, ניתחו את האיבר של קורטי מעכברים בין ימים לאחר הלידה 3 ו -6 (P3-6), ומעכברושים בין ימים לאחר הלידה 3 ו -8 (P3-8).
    הערה: תאי שיער ישנים רגישים יותר לנזק במהלך הניתוח, ולכן לא ניתן להשתמש בהם במשך שעות ארוכות בהדמיית HPICM.
  3. אל תשכח להסיר את הממברנה הטקטורית לפני הדמיית HPICM.
  4. מיד לאחר הניתוח, אבטחו את הרקמה באחד התאים המתוארים בסעיף 4, והניחו אותה מתחת לפיפטות הזכוכית הגמישות או מתחת לשני גדילי החוט הדנטלי(איור 4). מלאו מראש את התאים האלה עם 4 מ"ל של פתרון האמבטיה בטמפרטורת החדר (כדי למזער היווצרות בועה).

6. הדמיה של תאי השיער השמיעתיים

  1. הקימו את התא עם איבר קורטי מבודד טרי על במת פיזו X-Y באמצעות סרט דו-צדדי וודאו שהוא מאובטח היטב כדי למזער את הסחף התאי בצירי X ו- Y(איור 1B).
  2. בצע את השלבים בסעיף 1 כדי למקם ננו-צינור חדש ולבדוק אם יש את התנגדות הפיפטה הנכונה.
  3. באמצעות מיקרומניפולטור מהדק תיקון, למקם nanopipette מעל אזור תא השיער, תוך התבוננות האיבר של קורטי explant במיקרוסקופ הפוך.
  4. בדקו אם המערכת יציבה עם נקודת קבועה של 0.5% ומטה על ידי רישום אות המיקום בזמן אמת של הזרם בזמן אמת ו-Z באוסקילוסקופ (כמו באיור 1C). אם אות Z אינו יציב, נסה להקטין את תדירות הניתוק של מסנן המעבר הנמוך של מגבר מהדק התיקון. עם זאת, זה לא יכול להיות נמוך יותר מזמן התגובה של מפעיל Z piezo (כדי למנוע התנגשות pipette עם המדגם עקב קריאות נוכחיות מאוחרות).
    הערה: בפועל, הגדרת 5 kHz של מסנן זה נמצאה אופטימלית. עדיף להחליף את הננו-צינור, אם אות Z עדיין לא יציב.
  5. לאחר השגת הקלטה יציבה, קבע את נקודת הקבע האופטימלית וגש לדגימה באמצעות PIPETTE HPICM כמתואר בשלבים 3.6-3.7 לעיל.
  6. ראשית, בצע הדמיה ברזולוציה נמוכה (ראה טבלה 1), באמצעות משרעת הופ של לפחות 6 עד 8 מיקרומטר. כדי לדמיין מבנים גבוהים כגון חבילות סטריוציליה של תאי השיער, ודא כי משרעת הופ מספיקה כדי למנוע התנגשות עם מבנים אלה.
    הערה: אם משרעת הופ אינה מספיקה, הפיפטה לא תוכל לקפוץ מעל סטריאוסיליום ותתקל התנגשות קרובה. ההתנגשות של הגשושית HPICM עם סטריאוסיליום עלולה לפגוע בחבילת השיער. לכן, במקרים שבהם הגובה של חבילת סטרי stereocilia אינו בטוח, להשתמש משרעת הופ גדולה יותר.
  7. הכירו את הטופוגרפיה של איבר קורטי על ידי ביצוע ו/או לימוד תמונות שהושגו באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים(איור 5).
    הערה: אם תמונת HPICM אחידה עם גבהים הקטנים מ- 1 מיקרומטר בכל נקודת הדמיה, סביר להניח שהפפטה סורקת את קרקעית הזכוכית ולא את הרקמה. לחלופין, הפיפטה עשויה "לנחות" על אזור אחר של explant שבלול, הרחק מתאי השיער.
  8. אם יש להעביר את הפיפטה למיקום X-Y חדש, בטלו אותו כ-500 ננומטר כדי למנוע התנגשויות עם מאפיינים גבוהים בתוך הרקמה. חזור על הדמיית HPICM ברזולוציה נמוכה עד שיימצא אזור העניין בתאי השיער.
  9. לאחר שנמצא אזור העניין, התחל הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר (ראה טבלה 1). נסה לבלות פחות מ 15 דקות בעת הדמיה חבילת שיער שלמה.
    הערה: חבילות תאי השיער ברקמה החיה אינן דוממות אך עשויות לשנות את הכיוון שלהן, למשל, עקב שינויי צורה בתאים התומכים הבסיסיים. לכן, התמונות עשויות להציג חפצי תנועה אם רכישת התמונה איטית מדי.
  10. שוב, קבעו את התכונות הגבוהות ביותר בתמונות ברזולוציה נמוכה לפני הפחתת משרעת הדילוג להדמיה ברזולוציה גבוהה. עבור אזור של עניין המכסה את כל חבילת תא השיער, להפחית את משרעת הופ ל 4-5 מיקרומטר, בעוד עבור אזור קטן יחסית "שטוח" בתוך החבילה (למשל, 2 x 2 מיקרומטר) להפחית את משרעת הופ עוד יותר, עד פחות מ 1 מיקרומטר, ובכך להגדיל את המהירות והרזולוציה של הדמיה.

7. עיבוד תמונה

הערה: חפצי הדמיה נפוצים בהדמיית HPICM. חלקם ניתן לתקן על ידי פרמטרים רכישת תמונה, בעוד אחרים דורשים לאחר עיבוד או עם מציג SICM מיוחד או עם תוכניות עיבוד נתונים כלליות יותר כמו ImageJ או MatLab. כאן אנו מתארים את החפצים הנפוצים ביותר וכיצד אנו מתקנים אותם עם צופה SICM.

  1. ביצוע תיקון שיפוע
    הערה: זה לא ברור למתחילים, אבל העין האנושית לא יכולה לפתור תכונות בגודל תת-מיקרומטר על פני השטח של תא, אם אזור ההדמיה יש שיפוע כולל של גודל שווה או גדול יותר (איור 3A,B,שמאל). לכן, יש צורך לקבוע את השיפוע הממוצע של אזור בתמונה (על-ידי התאמת נתוני תמונה תלת-ממדית של HPICM למישור יחיד) ולהחסיר אותו מתמונת HPICM(איור 3A,B, אמצע).
    1. לחץ על פתח כדי לפתוח תמונה עם מציג SICM.
    2. בחר בכרטיסיה תיקון תמונה.
    3. בחר בכרטיסיה 'שיפוע נכון'.
    4. לחץ על לחצן 'שיפוע נכון' לתיקון שיפוע אוטומטי.
  2. ביצוע יישור קו
    הערה: כאמור, סחף מכני ו/או תרמי, כמו גם חפצי תנועה של תאים, מהווים בעיה משמעותית בהדמיית HPICM. סחיפה קטנה עם מהירות של פחות ממיקרומטר לדקה בדרך כלל אינה מורגשת בהתקנת מהדק תיקון רגילה. עם זאת, הוא יכול לייצר חפצים של כמה עשרות ננומטרים בהדמיית HPICM, שהוא גדול משמעותית מההחלטה של HPICM. לכן, אין זה נדיר להיתקל בקפיצות פתאומיות בציר Z בין שני קווי סריקה סמוכים של HPICM במהלך ההדמיה. ניתן לתקן זאת על-ידי ניתוח הבדלים בין ערכי Z מתחילים (ו/או מסתיימים) בשורות סריקה שכנות אלה.
    1. לחץ על פתח כדי לפתוח תמונה עם מציג SICM.
    2. בחר בכרטיסיה תיקון תמונה.
    3. בחר בכרטיסיה 'שיפוע נכון'.
    4. בחר את רוחב הקווים שיש ליישר. לחץ על הלחצן ButtonDestripeLineFit לתיקון אוטומטי של יישור קו.
  3. ביצוע הפחתת רעש
    הערה: בעת קבלת תמונות עם HPICM, תנודות קטנות בזרם nanopipette יכול להוביל nanopipette לעצור רחוק מפני השטח של המדגם, במיוחד עם נקודות קבועות נמוכות. התוצאה היא הופעת נקודות לבנות קטנות בתמונה. על מנת לתקן את החפץ הדמיה זה, יש צורך לזהות את נקודות ההדמיה עם ערך Z גדול משמעותית מזה של השכנים ולהחליף ערך זה בממוצע של השכנים. פעולה זו מתבצעת על-ידי מסנן חציוני מתכוונן.
    1. לחץ על פתח כדי לפתוח תמונה עם מציג SICM.
    2. בחר בכרטיסיה עיבוד תמונה.
    3. בחר בכרטיסיה הפחתת רעש.
    4. הגדר את מסנן הסף (μm) להסרת הפיקסלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המוצג במאמר זה יכול לשמש כדי לדמיין כל תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת. בעקבות צעדים אלה, אנו משיגים באופן שגרתי תמונות של חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות(איור 6B,D). למרות רזולוציית X-Y נמוכה יותר בהשוואה לתמונות SEM, תמונות HPICM שלנו יכולות לפתור בהצלחה את השורות השונות של סטריאוטיפיליה, את צורת קצות הסטריאוטיליה ואפילו את הקישורים הקטנים (בקוטר של כ- 5 ננומטר) המחברים סטריאוטיפיליה סמוכה (איור 6F). בנוסף, תמונות HPICM כוללות מידע בתלת-ממד שחסר בתמונות SEM. בהתחשב באופי ללא מגע של סוג זה של טכניקת הדמיה, הצלחנו גם לבצע הדמיה רציפה של HPICM בזמן מעידה של אותה חבילת תאי שיער במשך מספר שעות (כלומר, 5-6 שעות באופן קבוע) מבלי לפגוע בלכידות החבילה(איור 7). לכן, HPICM מציג פוטנציאל גדול לחקר שינויים מבניים דינמיים של חבילות תאי השיער לאורך זמן.

למרות שאנו מספקים מספר טווחים עבור גודל pipette, נקודת קבועה נוכחית, פרמטרים ברזולוציה נמוכה וגבוהה, ומשרעת דילוג, ייתכן שכל משתמש יצטרך למטב מעט את ההגדרות שלו כדי להשיג תמונות HPICM מוצלחות של חבילות תאי שיער חיים. נקודות קבועות קטנות יותר מפיקות תמונות באיכות טובה יותר. עם זאת, עם נקודת קבועה נמוכה מאוד, המערכת עשויה לפרש תנודות קטנות בזרם כמפגש עם משטח התא וזה יוביל לרעש "הנקודה הלבנה" בתמונה (איור 8A). באופן דומה, משרעת קפיצה גדולה עשויה להגביר את התהודה לרוחב של הפיפטה וגם לייצר פיקסלים רועשים(איור 8B). לעומת זאת, אם משרעת הדילוג קטנה מדי או שנקודת הסט גבוהה מדי, הננו-יפאט עלול להתנגש עם המדגם ולהוביל לחפצי הדמיה או אפילו לפגוע בחבילת השיער(איור 8C,D). אנו ממליצים לבצע את ההדמיה ברזולוציה נמוכה יותר תוך כדי לכוונן את כל הפרמטרים האלה כדי למזער נזק לדגימה או לננו-צינור.

Figure 1
איור 1: עקרונות המיקרוסקופיה של מוליכת יונים של בדיקה מקפיצה (HPICM). (A)זרם חשמלי העובר דרך הננופיט מייצר "נפח חישה" בקצה הפיפטה. כדי לדמיין מבנים מורכבים כמו חבילות סטריוציליה של תאי השיער, הפיפטה מתקרבת לכיוון פני התא מלמעלה ונסוגה לאחר זיהוי פני השטח. לאחר מהלך רוחבי בכל שלב, הפיפטה ממשיכה "לקפוץ" מעל המדגם היוצר את התמונה של התא. שימו לב כי משרעת הופ חייב להיות מספיק עבור pipette "לטפס" לסטריאוציליום. משרעת הופ מאוירת תעבוד לסריקה משמאל לימין (מהקטן ביותר לסטריוסיליום הגבוה ביותר, המצוין על ידי חץ). עם זאת, הוא קטן מדי לסריקה מימין לשמאל כאשר הפיפטה פוגשת תחילה את הסטריאוטי-סיליום הגבוה ביותר. (B)התקנה ניסיונית. תא מותאם אישית עם האיבר של Corti explant מותקן על שלב ננופוזיציה XY עם צמצם לתצפית מיקרוסקופית אופטית. הננו-פיפט מועבר על ידי מפעיל נפרד אולטרה-מהיר של זי פיזו. כדי למקם את nanopipette מעל אזור העניין, מפעיל Z מותקן על מיקרו-מניפולטור קונבנציונאלי (לא מוצג) יחד עם מגברמהדק התיקון . אלקטרודה טחון מותקנת על מחזיק מגנטי ומוכנסת לאמבטיה. (C)הקלטות מייצגות של זרם הפיפטה (מעקבעליון) ומיקום Z של הפיפטה (עקבות התחתונים) במהלך ההדמיה. כאשר הפיפטה רחוקה מפני השטח של התא, ערך הייחוס של הזרם העובר דרך הפיפטה נקבע (אנימעריך). לאחר מכן, הפיפטה מועברת לכיוון המדגם (גישה). כאשר "נפח חישה" פוגש את פני התא, זרם הפיפטה מתחיל לרדת. הפקודה עבור משיכה מונפקת כאשר הירידה הנוכחית מגיעה לנקודת קבע, שהיא בדרך כלל 0.2% - 1% ממני שופט. (D)שרטוטים של הציוד שיש להוסיף להתקנת מהדק תיקון קונבנציונאלי עבור הדמיית HPICM. מגבר מהדק תיקון ייעודי מתעד את זרם הננו-צינור (I) המשמש את בקר SICM במצב HPICM כדי ליצור אותות פקודה לצירים X, Y ו- Z. מגבר מכשור מספק סינון היסט, קנה מידה ומסננת מעבר נמוכה לאותות אלה, במידת הצורך. למרבה הצער, לא ניתן להחיל אותות X/Y/Z מהבקר ישירות על מפעילי הפיזו עקב שגיאות גדולות הנגרמות על ידי היסטריה וזחילה הטבועות בקרמיקה פיזו. לכן, לכל מפעיל piezo (שלב התרגום)יש חיישן תנועה מובנה השולח אות משוב לבקר הפרופורציונלי-אינטגרלי-נגזרת (PID) שמעצב מראש את אות הפקודה לתיקון עבור שגיאות אלה. שים לב שצירים איטיים יחסית של X ו- Y יכולים להשתמש בבקרי PID הבנויים במגבר piezo, בעוד שציר Z מהיר יותר דורש בקר PIDמהיר ייעודי . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצור ומילוי ננו-אפיפט. (A)ננופיט באורך של כ-2 ס"מ מלא בתמיסת התוך-פיפט (HBSS). (B)תמונה של הבועה (חץ) שנוצרת בדרך כלל לאחר מילוי הפיפטה. הבועה בדרך כלל מתרחקת תוך דקות ספורות של תאורת מיקרוסקופ (מיקרוסקופ דיגיטלי LCD ב 10x). (C)ננו-צינור מותקן לתוך ראש ה- SICM. החץ מצביע על אלקטרודה AgCl בתוך pipette. שימו לב כי מחזיק הפיפטה צבוע כסוף ומקורק כדי למזער איסוף חשמלי מקריני ממפעיל Z piezo. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה של תקני כיול AFM כדי לקבוע יציבות נאותה, בידוד רטט ורעש חשמלי במערכת. (A)תמונות גולמיות (משמאל), לאחר עיבוד (אמצע) ותלת-ממד (מימין) של תקן הכיול HS-100MG. פרופיל פני השטח של התקן מוצג באופן סכמטי בחלק העליון. מכיוון שהתקן לעולם אינו מיושר באופן מושלם בניצב לננופיט, יש צורך בתיקון שיפוע לאחר העיבוד כדי לחשוף תכונות אנכיות קטנות של המדגם. (B)תמונות גולמיות דומות (משמאל), לאחר עיבוד (אמצע) ותלת-ממד (מימין) של תקן הכיול HS-20MG בעל חריצים קטנים יותר בעומק 20 ננומטר. שים לב שצווני אפור של פיקסל בתמונת HPICM מציינים את גובה המדגם בשלב זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הרכבה של איבר קורטי. (א)המהולל מוחזק על ידי שני פיפטות זכוכית המודבקות לצלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית. (B)המהוצר מאובטח על ידי שני גדילי חוט דנטלי (חצים קצרים) בתא הדמיה בהזמנה אישית. Inset מציג תמונה מוגדלת של האיבר של Corti. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניווט של הגשושית HPICM לאזור תאי השיער. (A)תמונת SEM של explant השבלול המציג שורות של תאי שיער פנימיים (IHCs) וחיתוכיים (OHCs) וסוגים שונים של תאים תומכים. (B)תמונת HPICM מייצגת של התאים באיבר של קוליקר. (C)תמונת HPICM של תאי ההנסן. שים לב כי שני סוגים אלה של תאים תומכים יש צורות שונות מאוד, אשר מסייע לקבוע אם הבדיקה HPICM נחת לאזור כי הוא רדיאלי או היקפי לתאי השיער. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: השוואה בין סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) לבין מיקרוסקופיית מוליכת יונים של בדיקה מקפיצה (HPICM) הדמיה של חבילות סטריאוטיליה בתאי שיער פנימיים של מכרסמים צעירים לאחר ההולכה. (A,C) תמונות SEM מספקות רזולוציה תת-ננומטרית של פרטי פני השטח אך בתאים הקבועים והמכווצים עקב ייבוש נקודות קריטי. בנוסף, תמונות SEM אינן מאפשרות ניתוח תלת-ממדי. (B,D) לתמונות HPICM (משמאל) יש רזולוציה גרועה יותר (~5-10 ננומטר) אך הן מתקבלות בתאים חיים, מאפשרות הדמיה של זמן לשגות, ונושאות מידע על גבהים מדויקים, המאפשר שחזור ומדידות תלת-ממדיות (מימין). (E,F) קשרים חוץ-תאיים בין סטריאוטיפיליה ניכרים הן בתמונות SEM (E) והן בתמונות HPICM(F) (חצים). גילאי תא: A, עכבר יום לאחר הניישן 5 (P5); B, עכברוש P6; ג, עכבר P8; D, P5 חולדה; עכבר P7; ו-פ', עכברוש פי-5. בכל תמונות HPICM, גווני אפור של פיקסל מציינים את גובה הדגימה בשלב זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: זמן רציף לשגות HPICM הדמיה של חבילת סטריאוטיליה. (A)סקירה של חבילת תאי שיער פנימית מחולדת P5 המציגה סטריאוטיליה קצרה יותר. (ב)הדמיית זמן מעידה של אזור העניין המצוין ב - (A) לאורך שש שעות. שים לב שבניגוד לניסוי טיפוסי במחנה תיקון, תאי השיער אינם מראים סימנים להידרדרות במשך מספר שעות במבחנה. זאת בשל ניתוח זהיר והיעדר הפרעות מכניות לתא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: חפצים נפוצים בעת הדמיה עם HPICM. (א)השפעה של נקודת קבועה נמוכה מדי. תמונות HPICM ברזולוציה נמוכה של אותן חבילות תאי שיער פנימיים חיים בעכברים P3 שנרכשו עם נקודת setpoint 0.05% (משמאל) ו- 0.07% (מימין). שים לב לרעש נקודה לבנה שנעלם עם נקודת קבע גבוהה יותר. (B)השפעה של משרעת קפיצה גבוהה מדי. רעש נקודה לבנה מופיע גם בתמונת HPICM של חבילת תאי שיער פנימיים של חולדת P7 המתקבלת עם משרעת הופ גדולה של 5.8 מיקרומטר (משמאל). רעש זה נעלם כאשר אותה חבילה מוצגת עם משרעת הופ של 3.4 מיקרומטר (מימין) בשל ירידה של תנודות במערכת. (C)משרעת קפיצה נמוכה מדי גורמת להתנגשות של הגשושית HPICM לסטריאוטיליה וגרירתם (חצים בלוח השמאלי). הגדלת משרעת הופ רק מספיק כדי "לטפס מעל" סטריוציליה מבטלת את החפץ הזה (מימין) אבל עשוי גם להגדיל את זמן ההדמיה, וכתוצאה מכך נסחף מורגש (קווים אנכיים בלוח הימני). חבילת סטריאוסיליה של תא שיער חי מעכברוש P7. (D) נקודת קבע גבוהה מדי גורמת לצורה בריבוע של קצות סטריאציליה (חצים) בתמונת HPICM (משמאל), שוב עקב התנגשות של הננו-צינור לסטריאוטיפיליה. הפחתת נקודת הקבע (עם ירידה סימולטני של משרעת התקווה כדי למנוע רעש לבן) משפר את ההדמיה (מימין). חבילת סטריאוסיליה של תא שיער פנימי חי מעכברוש P6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רזולוציה אזור תמונה (מיקרומטר) רזולוציה לרוחב (nm) שעה לתמונה (דקות)
נמוך 20×20 ≥300 ≤20
נמוך 10×10 ≥156 ≤15
נמוך 5×5 ≥75 ≤4
גבוה 20×20 ≤200 ≤20
גבוה 10×10 ≤110 ≤15
גבוה 5×5 ≤55 ≤4

טבלה 1: זמנים אופייניים של הדמיית HPICM בהתאם לגודל אזור ההדמיה ורזולוציית הסריקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשיג תמונות HPICM מוצלחות, המשתמשים צריכים להקים מערכת רעש נמוכה ורטט נמוך ולייצר צינורות מתאימים. אנו ממליצים בחום להשתמש בתקני כיול AFM כדי לבדוק את יציבות המערכת לפני ניסיון לבצע הדמיה של תאים חיים. לאחר הרזולוציה של המערכת נבדקת, משתמשים יכולים לשקול הדמיה איבר קבוע של דגימות Corti כדי להכיר את הגדרות ההדמיה לפני ניסיון כל הדמיה תא חי.

נקודת התפאורה האופטימלית להדמיה משתנה בין פיפטות שונות, בהתאם לצורה האינדיבידואלית של הטיפים שלהם (שאינה ידועה עד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים) ועל כמות הלכלוך המחוברת לקצה, שהיא גם בלתי צפויה. Nanopipettes עם נקודת קבועה אופטימלית גבוהה מ 0.7% יש להשליך.

במהלך הדמיה של תאים חיים, כמות האבק והפסולת בתמיסה החוץ תאית גדלה עם הזמן. כל החלקיקים האלה יכולים בסופו של דבר בקצה הפיפטה, גרימת ירידה בזרם ולא מאפשר להמשיך לסרוק את הרקמה - התמונה תהפוך ללבן לחלוטין שכן המשוב "יחשוב" כי nanopipette הוא תמיד בקרבת המדגם. אם זה קורה, מומלץ לחזור בו מהפיפטה בציר Z מאזור זה של הרקמה. נסיגה זו יכולה לנקות את "הלכלוך". אם הפיפטה עדיין מלוכלכת, יש צורך לשנות את הפיפטה ולעבור לאזור אחר של המדגם. לאחר מכן, המשתמש יכול להמשיך לסרוק את הרקמה.

נכון להיום, המגבלה החיונית ביותר של HPICM היא משך הזמן הנדרש כדי לצלם תמונה ברזולוציה גבוהה תוך עבודה עם דוגמאות עם טופוגרפיה מורכבת. בהתאם לרזולוציה הרצויה, התמונות יכולות להימשך עד חצי שעה או יותר. בתמונות שנרכשו במשך יותר מרבע שעה, הסחף עשוי להתברר ומבנים ספציפיים עשויים להיות מוזזים וקשה יותר להבחין. זה קורה כי התאים החיים נעים כל הזמן או משנים את צורתם לאורך זמן. כדי לדמיין אירועים מולקולריים ושינויים במבני התאים לאורך זמן, יש צורך בפיתוחים נוספים כדי למטב את הרזולוציה הזמנית של HPICM11.

הרעש של זרם nanopipette מייצג מגבלה נוספת מכיוון שהוא קובע את נקודת הקבע המינימלית הניתנת להשגה. הזרם שנוצר על ידי nanopipette בתמיסה מחלל במהירות (יחסית הפוכה למרחק מעוקב מקצה הפיפטה), ובכך יוצר "נפח חישה", שמעבר לו הננו-צינור לא יכול "לחוש" את פני השטח. פיתחנו בעבר מודל של תופעה זו והראינו כי הרזולוציה לרוחב של גשושית SICM נקבעת על ידי חתך רוחב זה של "נפח חישה" זה עם פני השטח של התא, אשר יכול להיות קטן מאוד בנקודות נמוכות25. זה חשוב במיוחד עבור הדמיית קישורי קצה תא שיער שיש להם קוטר של ~ 5 ננומטר12,33. במבט ראשון, הפיפטות בקוטר פנימי קטן יותר יביאו לרזולוציה טובה יותר של הדמיית HPICM. זה אכן נכון לגבי פיפטות גדולות יחסית (>50 ננומטר). עם זאת, הפחתת הקוטר הפנימי של nanopipette מתחת ~ 50 ננומטר גורמת לעלייה גדולה באופן לא פרופורציונלי של רעש פיפטה, ומכאן, אובדן הרזולוציה בנקודות נמוכות החיוניות להדמיית חבילות סטריאצ'יליה. נכון להיום, אנחנו לא יודעים איך לפתור את הבעיה ואנחנו עובדים על מציאת הפתרון הנכון.

לסיכום, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של חבילות סטריאוסיליה בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים עם HPICM. היתרונות הגדולים ביותר של HPICM הם: i) היכולת שלו לדמיין מבנים ננומטריים ללא תווית על פני השטח של תאים חיים מבלי לגעת בהם; ו- ii) כדי לחקור את הפונקציה של מבנים אלה עם הקלטות מהדק תיקון ו /או משלוח ננומטרי מקומי של גירויים מכניים או כימיים. למיטב ידיעתנו, יתרונות אלה ייחודיים ל-HPICM. כמובן, יש כמה חסרונות. ראשית, בשל מגבלות על גובה המבנים שיש לדמיין, HPICM עשוי שלא להתאים להדמיה של מבנים גבוהים במיוחד, כגון חבילות סטריאוטיליה של תאי השיער המנוונים באמפולה היונקים. שנית, HPICM עדיין מתפתחת ויש צורך בשיפורים נוספים במהירות וברזולוציה של ההדמיה. עם זאת, העקרונות הפיזיים של HPICM והניסיון שלנו מצביעים על כך שזה אפשרי. אנו מאמינים כי HPICM יספק נתונים ייחודיים על הפונקציה של מתחמי חלבון בודדים על פני השטח סטריאוטיליה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לפרופ' יורי קורצ'וב (אימפריאל קולג', בריטניה) על התמיכה והייעוץ ארוכי הטווח לאורך כל שלבי הפרויקט. אנו מודים גם לד"ר פאבל נובאק ואנדרו שבצ'וק (אימפריאל קולג', בריטניה) וכן לאולג בלוב (מרכז המחקר הלאומי לאודיולוגיה, רוסיה) על עזרתם בפיתוח תוכנה. המחקר נתמך על ידי NIDCD/NIH (R01 DC008861 ו- R01 DC014658 ל- G.I.F.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog oscilloscope B&K Precision 2160C Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards TED PELLA Inc HS-100MG; HS-20MG These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator AMETEK/TMC Everstill K-400 Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments (WPI) 1B100F-4 Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer National Instruments Corporation PCI-6221 Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement Standford Research Systems SIM900, SIM960, SIM980 Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage AMETEK/TMC Type II Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish World Precision Instruments (WPI) FD5040-100 Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 14025092 Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier Brownlee Precision Model 440 Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller Sutter Instrument P-2000/G Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red Gibco, Thermo Fisher Scientific 21083027 Extracellular (bath) solution
Micromanipulator Scientifica PatchStar Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope Nikon Eclipse TS100 Inverted optical microscope
Patch amplifier Molecular Devices Axopatch 200B The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes) Physik Instrumente (PI) E-500.00, E-505.00, E-509.C2A Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis) Piezosystem jena ENT 400 & 800 Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips TED PELLA Inc 26028 Used in the fabrication of the chambers for the tissue 
SICM controller & software* Ionscope, UK (ionscope.com) N/A Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard) World Precision Instruments (WPI) SYLG184 Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue The Dow Chemical Company 734 Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod A-M Systems 717500 Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner Physik Instrumente (PI) P-733.2DD XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner Piezosystem jena RA 12/24 SG Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM, 
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original 
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically 
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one 
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  2. Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
  3. Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
  4. Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  8. Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
  9. Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
  10. Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
  11. Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
  12. Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
  13. Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
  14. Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
  15. Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
  16. Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
  17. Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
  18. Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
  19. Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
  20. Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
  21. Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
  22. Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
  23. Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
  24. Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
  25. Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
  26. Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
  27. Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
  28. Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
  29. Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
  30. Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
  31. Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
  32. Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
  33. Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).

Tags

מדעי המוח גיליון 167 סריקת מיקרוסקופיית מוליכת יונים רזולוציית-על הדמיה של תאים חיים תאי שיער סכיליים סטריאוציליה מכניוטרנסדוקציה
הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galeano-Naranjo, C.,… More

Galeano-Naranjo, C., Veléz-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells. J. Vis. Exp. (167), e62104, doi:10.3791/62104 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter