Summary
Sebrafisk embryoer/larver utvikler seg eksternt og er optisk gjennomsiktige. Bioakkumulering av mikroplast hos fisk i tidlige livsstadier vurderes lett med fluorescerende merkede mikrober.
Abstract
Som en ny type miljøgift har mikroplast blitt mye funnet i vannmiljøet og utgjør en høy trussel mot vannlevende organismer. Bioakkumulering av mikroplast spiller en nøkkelrolle i deres toksiske effekter; Men som et partikkel er deres bioakkumulering forskjellig fra mange andre miljøgifter. Beskrevet her er en mulig metode for å visuelt bestemme akkumulering og distribusjon av mikroplast i sebrafisk embryoer eller larver ved hjelp av fluorescerende mikroplast. Embryoer er utsatt for forskjellige konsentrasjoner (0,1, 1 og 10 mg / l) fluorescerende mikroplast med en diameter på 500 nm i 120 timer. Det er vist i resultatene at mikroplast kan bioakkumulere i sebrafiskembryoer/larver på en konsentrasjonsavhengig måte. Før klekking finnes sterk fluorescens rundt den embryonale korionen; mens i sebrafisk larver, eggeplomme sac, perikardium og mage-tarmkanalen er de viktigste akkumulerte stedene for mikroplast. Resultatene viser opptak og internalisering av mikroplast i sebrafisk i tidlige livsstadier, noe som vil gi grunnlag for bedre forståelse av effekten av mikroplast på akvatiske dyr.
Introduction
Siden første syntetisert på 1900-tallet, er plast mye brukt på ulike felt, noe som resulterer i rask vekst av global produksjon1. I 2018 ble det produsert ca. 360 millioner tonn plast over hele verden2. Plasten i det naturlige miljøet vil forringes til fine partikler på grunn av kjemiske, fysiske eller biologiske prosesser3. Vanligvis er fine plastpartikler <5 mm i størrelse definert som mikroplast4. Mikroplast er også utviklet for spesifikke bruksområder, for eksempel mikrober fra kosmetiske produkter5. Som nesten permanente forurensninger akkumuleres mikroplast i miljøet, og har tiltrukket seg økende oppmerksomhet fra forskere, beslutningstakere og publikum1,6. Tidligere studier dokumenterte at mikroplast kan forårsake bivirkninger hos fisk, for eksempel gastrointestinal skade7, nevrotoksisitet8, endokrineforstyrrelser 9, oksidativt stress10 og DNA-skade11. Imidlertid har toksisiteten til mikroplast ikke blitt fullstendig avslørt så langt12,13.
Sebrafiskembryoer gir mange eksperimentelle fordeler, inkludert liten størrelse, ekstern befruktning, optisk gjennomsiktighet og store clutcher, og regnes som en ideell modellorganisme for in vivo som studerer effekten av miljøgifter på fisk i tidlige livsstadier. I tillegg er det bare nødvendig med begrensede mengder teststoffer for evaluering av biologiske responser. Her er sebrafiskembryoer utsatt for forskjellige konsentrasjoner av mikroplast (0,1, 1, 10 mg / L) i 5 dager, og bioakkumulering og distribusjon av mikroplast i sebrafiskembryoer / larver evalueres. Dette resultatet vil fremme vår forståelse av toksisiteten av mikroplast til fisk, og metoden beskrevet her kan potensielt generaliseres for å bestemme akkumulering og distribusjon av andre typer fluorescerende materialer i de tidlige livsstadiene av sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksen sebrafisk stammer fra China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Kina). Forsøkene ble utført i samsvar med den nasjonale veilederen "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018).
1. Embryo samling
- Vedlikehold fisk i 20 L glasstanker med resirkulering av kullfiltrert vann fra springen (pH 7,0 ± 0,2) ved konstant temperatur (28 ± 0,5 °C) på en fotoperiod på 14:10 t lys: mørkt.
- Fôr fisk to ganger daglig med Artemia nauplii. Det anbefales at maten gis maksimalt 3% fiskevekt per dag og bør spises innen 5 min hver gang14.
- Overfør velutviklet voksen sebrafisk (med kroppslengde på 3-4 cm) inn i gytetanken i forholdet en mann til to kvinner natten før avl.
MERK: Neste morgen begynner fisken å gyte etter lyssyklusens begynnelse. - Samle egg ved hjelp av en Pasteur pipette. Skyll med 10% Hanks løsning flere ganger, og kontroller deretter for befruktning ved hjelp av et mikroskop. Befruktede egg gjennomgår spaltingsperioden etter ca. 2 timer etter befruktning (hpf) og kan tydelig identifiseres15.
- Inkuber de befruktede embryoene i et 500 ml beger som inneholder 200 ml 10% Hanks løsning med 1% metylenblå for desinfeksjon ved 28 °C. Ikke overskrid en lastehastighet på 1 embryo/2 ml oppløsning.
MERK: 10% Hanks løsning består av 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 og 4,2 mM NaHCO3.
2. Fremstilling av mikroplast suspensjoner
- Soniker lagerløsningen av grønne fluorescerende merkede polystyrenperler (10 mg/ml) med nominell diameter på 500 nm (eksitasjon/utslipp: 460/500 nm) i 10 minutter.
- Fortynn lagerløsningen med 10 % Hanks løsning for å produsere de ønskede eksponeringsløsningene (0,1, 1 og 10 mg/l).
- Klargjør alltid eksponeringsløsningene for mikroplast før eksponering.
MERK: Det bør utvises forsiktighet ved vurdering av toksiske effekter av mikroplast, fordi tilstedeværelsen av konserveringsmidler, som natriumazid, i de kommersielle partikkelformuleringene, kan være giftig for forskjellige organismer 16. Derfor bør disse tilsetningsstoffene fjernes eller redegjøres for i kontrollene før de utfører toksisitetseksperiment.
3. Mikroplastisk eksponering
- Velg tilfeldig 6 nybefruktede embryoer (4 hkf), og overfør deretter til hver brønn på 6-brønnsplate som inneholder 5 ml mikroplastløsninger med forskjellige konsentrasjoner. Inkluder kontrollgruppene som inneholder 10 % Hanks løsning.
- Bruk triplikatbrønner (med totalt 18 embryoer) for hver behandling.
- Inkuber embryoene under samme lys: mørk syklus og temperatur som voksne (se 1.2) og observere hver 12. Fjern de døde umiddelbart.
- Forny de mikroplastiske løsningene 90% hver 24. I eksponeringsperioden blir fisken ikke matet.
MERK: Generelt begynner klekkingen av embryo ved 48 hkf og fullføres på ca. 72 hkf.
4. Vurdering av mikroplastfordeling
- Ved 24, 48, 72, 96 og 120 h post befruktning, velg tilfeldig embryoer / larver (en fra hver av de tre replikerer) og skyll med 10% Hanks løsning.
- Overfør larvene til en Petri-tallerken og eksponer til 0,016% trikain for anestesi.
- Forbered lagerløsningen av trikain: 4 mg trikainpulver oppløses i 100 ml dobbelt destillert vann, og juster pH til 7,0 med Tris-HCl (pH 9,0). Oppbevar lagerløsningen i fryseren.
- Forbered arbeidsløsningen. Fortynn lagerløsningen til ønsket konsentrasjon (0,016%) med 10% Hanks løsning ved romtemperatur14.
- Ordne embryoer/larver og forbered deg på observasjon.
- Vær oppmerksom på fisken med et fluorescensmikroskop og bilde med bildebehandlingsprogramvare.
- Kvantifisere fluorescensintensiteten i fisk med ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordelingen og akkumuleringen av fluorescerende mikroplast er vist i figur 1 og tabell 1. Ingen synlig fluorescens observeres i den ueksponerte gruppen (kontroll). Imidlertid er det funnet en opphopning av fluorescens rundt koret etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av mikroplast (24 hkf). Grønn fluorescens oppdages også i larver, og fluorescensnivåene ser ut til å øke på en konsentrasjons- og tidsavhengig måte. Eggeplommesekken, perikardiumet og mage-tarmkanalen er de viktigste akkumulerte stedene for mikroplast (figur 2).
Figur 1: Distribusjon av fluorescerende polystyrenmikroplast i embryoer/larver av sebrafisk (40×). Fisken er samplet fra kontrollgruppen, eller gruppene utsatt for 500 nm mikroplast ved 0,1, 1 og 10 mg/l. Skala bar 100 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lokalitetene for mikroplastakkumulering i sebrafisk larver (40×). Denne larven er samplet fra gruppen utsatt for 500 nm mikroplast ved 10 mg / l i 120 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| konsentrasjon | embryo | larve | ||||
| (mg/L) | 24 hk | 48 hk a | 48 hk b | 72 hk | 96 hk | 120 hkf |
| Cont. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: bare to embryoer ble vurdert; b: Bare en larve ble vurdert. | ||||||
Tabell 1: Endring av fluorescensnivå i sebrafisk etter eksponering for fluorescerende mikroplast (n=3). På grunn av påvirkning av kor på absorpsjon av fluorescerende mikroplast, er dataene delt inn i to deler, embryoenes (før klekking) og larver (etter klekking).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I henhold til retningslinjene for beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål, for eksempel EU-direktiv 2010/63/EU, er dyreetisk tillatelse ikke obligatorisk for et eksperiment med tidlige livsstadier av sebrafisk til scenen for å kunne selvstendig fôre (5 dager etter befruktning)17. Beste velferdspraksis er imidlertid viktig for å optimalisere bruken av sebrafisk, og for eksempel bør humane metoder for anestesi og eutanasi være av bekymring. Etyl 3-aminobenzoat metansulfat (MS-222, eller trikain), det rutinemessig brukte middelet i de fleste laboratorier, er ansatt her for anestesi og eutanasi.
Før observasjon under mikroskopet, bør embryoer og larver skylles siden mikroplast adsorbert på den ytre overflaten kan forstyrre resultatene. I tillegg kan autofluorescensen i embryoer/larver, spesielt rundt eggeplommesekken, som har blitt rapportert av og til, være problematisk. Tilstedeværelsen av mange biomacromolecules, som flavins, nikotinamid-adenin dinucleotide (NAD), aromatiske aminosyrer, lipofusciner, avanserte glykasjonsendeprodukter og collage, vil avgi lys når de er begeistret ved riktig bølgelengde.
Det er viktig å merke seg at, som svevestøvforurensende middel, anses størrelsen på mikroplast som en av de avgjørende faktorene for biotilgjengelighet og toksisitet18. Den nominelle diameteren på mikroplast som brukes her er 500 nm, som er sammenlignet med porestørrelsen på embryokorionen (innenfor området 300 nm til 1 μm)19. Derfor forventes det ikke at disse mikroplastene lett passerer gjennom sebrafiskkorionen. Konsekvent er det lite fluorescens synlig i embryoene før klekking (Figur 1). Siden koreksjonen vil fungere som en effektiv barriere mot partiklene med stor størrelse, kan dechorionation prosessen før eksponering være nødvendig. Chorion kan fjernes enkelt ved hjelp av tang, men enzymatisk dechorionation med pronase foretrekkes når embryoene håndteres i bulk. Men selv om dechorionation vil øke biotilgjengeligheten og lette høygjennomstrømningsscreeningen for toksisitet av stoffer, anbefales embryoet med chorion intakt å vurdere miljøtoksisiteten til miljøgifter når man vurderer eksponeringsbetingelsen i den "virkelige" verden.
Selv om det er gjort en betydelig innsats for å undersøke de negative effektene av mikroplast på fisk, forblir den nåværende kunnskapen, inkludert bioakkumulering, begrenset eller til og med motstridende. Disse inkonsekvensene på tvers av studier tilskrives hovedsakelig forskjellene i partiklers egenskaper, inkludert størrelse, tetthet og overflateegenskaper (for eksempel overflateladning). Oppførselen til mikroplast i løsningen er også kritisk for biotilgjengeligheten. De fysisk-kjemiske egenskapene til mikroplast bør spores over eksponeringsvarigheten, og aggregasjonsfenomenet som kan oppstå, bør registreres. Faktisk, for eksponeringene som krever at mikroplasten skal suspenderes i en lengre periode, anbefales sonikering eller omrøring med en magnetisk stang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170), og Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L.
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R.
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
