यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान एच2ओ2की शारीरिक सिग्नलिंग भूमिकाओं का आकलन करने के लिए सुसंस्कृत जेब्राफिश न्यूरॉन्स और लार्वा में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के उपयोग का वर्णन करता है। इसे विभिन्न सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है और सामान्य विकास में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक उपचारों के साथ संशोधित किया जा सकता है।
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) अच्छी तरह से स्थापित सिग्नलिंग अणु हैं, जो सामान्य विकास, हो्योस्टेसिस और फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न आरओएस में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)सेलुलर सिग्नलिंग में भूमिकाओं के संबंध में सबसे अच्छी विशेषता है। एच2ओ 2 को कई प्रजातियों में विकास केदौरान फंसाया गया है। उदाहरण के लिए, निषेचन के बाद पहले दिनों केदौरानजेब्राफिश भ्रूण में एच 2 O2 में क्षणिक वृद्धि का पता चला है । इसकेअलावा, एक महत्वपूर्ण सेलुलर एच 2 ओ2 स्रोत, एनएडीपीएच ऑक्सीडेस (एनओएक्स) घटता है, जो विवो और इन विट्रोदोनों में रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) के मार्गदर्शन जैसे तंत्रिका तंत्र के विकास को ख़राब करता है। यहां, हम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एच 2 ओ2– विशिष्ट बायोसेंसर, roGFP2-Orp1 का उपयोग करके विकास के दौरान सुसंस्कृत जेब्राफिश न्यूरॉन्स और पूरे लार्वा में इमेजिंग इंट्रासेलुलर एच2ओ 2स्तरों के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह जांच ज़ेब्राफिश लार्वा में क्षणिक रूप से या स्थिर रूप से व्यक्त की जा सकती है। इसके अलावा, अनुपातमेट्रिक रीडआउट अंतर जीन अभिव्यक्ति या मात्रा प्रभाव के कारण कलाकृतियों का पता लगाने की संभावना कम हो जाती है। सबसे पहले, हम प्रदर्शित करते हैं कि ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से प्राप्त आरजीसी को कैसे अलग और संस्कृति से प्राप्त किया जाए जो क्षणिक रूप से roGFP2-Orp1 व्यक्त करते हैं। फिर, हम ऊतक स्तर पर एच 2O 2के स्तर की निगरानी के लिए पूरे लार्वा का उपयोग करते हैं। सेंसर को एच2ओ2के अलावा मान्य किया गया है । इसकेअतिरिक्त, इस पद्धति का उपयोग ऊतक-विशिष्ट बायोसेंसर अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करके विशिष्ट कोशिका प्रकारों और ऊतकों में एच 2 ओ2 के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है। चूंकि जेब्राफिश आनुवंशिक और विकासात्मक जोड़तोड़ की सुविधा प्रदान करता है, इसलिए यहां प्रदर्शित दृष्टिकोण कशेरुकी में न्यूरोनल और सामान्य भ्रूणीय विकास के दौरान एच2ओ2 की भूमिका का परीक्षण करने के लिए एक पाइपलाइन के रूप में काम कर सकता है।
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) सिग्नलिंग तंत्रिका तंत्र के विकास और कार्यप्रणाली को नियंत्रित करती है1। एक महत्वपूर्ण सेलुलर आरओएस स्रोत एनएडीपीएच ऑक्सीडेस (एनओएक्स) हैं, जो ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन हैं जो सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)2)उत्पन्न करते हैं। एनओएक्स एंजाइम पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में पाए जाते हैं, और एनओएक्स-व्युत्पन्न आरओ न्यूरोनलविकास3,4,5, 6में योगदानदेतेहैं। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव और भेदभाव, न्यूरोनल ध्रुवता की स्थापना, न्यूराइट आउटग्रोथ, और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी कोआरओ7, 8, 9,10, 11के पर्याप्त स्तर की आवश्यकता होती दिखाई गईहै। दूसरी ओर, एनओएक्स द्वारा आरओएस का अनियंत्रित उत्पादन अल्जाइमर रोग, मल्टीपल स्क्लेरोसिस और दर्दनाक मस्तिष्क चोट12, 13, 14सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान देता है। इसलिए, शारीरिक रूप से प्रासंगिक ROS का उत्पादन स्वस्थ परिस्थितियों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के विकास ने सेलुलर आरओएस का पता लगाने में बहुत मदद की। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर का एक महत्वपूर्ण लाभ आरओएस सिग्नल का बढ़ा हुआ लौकिक और स्थानिक समाधान है, क्योंकि इन सेंसरों को विशेष रूप से अलग स्थानों पर लक्षित किया जा सकता है। रेडॉक्स-सेंसिटिव जीएफपी (roGFP) इस तरह के आरओएस बायोसेंसर का एक प्रकार है। roGFP2-Orp1 संस्करण विशेष रूप से अपने Orp1 डोमेन के माध्यम से एच2O2 का पता लगाता है, जो खमीर15,16से एक ग्लूटाथिएक पेरोक्सीरॉक्सिन परिवार प्रोटीन है । Orp1 प्रोटीन का ऑक्सीकरण roGFP2 को हस्तांतरित किया जाता है ताकि इसकी संरचना(चित्रा 1A)को बदल दिया जा सके। जांच में 405 एनएम और 480 एनएम के पास दो उत्तेजन चोटियों और 515 एनएम पर एक उत्सर्जन शिखर प्रदर्शित किया गया है। ऑक्सीकरण पर, उत्तेजन चोटियों के आसपास फ्लोरेसेंस तीव्रता बदलती है: जबकि 405 एनएम उत्तेजन बढ़ जाती है, 480 एनएम उत्तेजन कम हो जाती है। इस प्रकार, roGFP2-Orp1 एक अनुपातमेट्रिक बायोसेंसर है, और एच2ओ2-स्तरदो अलग-अलग तरंगदैर्ध्य(चित्रा 1 बी)पर उत्साहित फ्लोरेसेंस तीव्रता के अनुपात से पता लगाया जाता है। कुल मिलाकर, roGFP2-Orp1 रोस इमेजिंग के लिए एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग वीवो मेंकुशलतापूर्वक किया जा सकता है।
चित्र 1:रोगएफपी2-ऑर्प 1 का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और उत्तेजन स्पेक्ट्रा। (ए)ऑक्सीडेंट ट्रांसफर एच 2 ओ2 केजवाब में ऑर्प 1 और roGFP2 के बीच होता है, जिससे roGFP2 में अनुरूप परिवर्तन होते हैं। (ख)रोगएफपी2-ऑर्प1 का एक्सट्रक्टेशन स्पेक्ट्रा 405 एनएम पर दो एक्सटिटेशन चोटियों और 515 एनएम पर 480 एनएम और सिंगल एमिशन पीक को प्रदर्शित करता है। एच 2ओ2द्वारा ऑक्सीकरण पर, 405 एनएम उत्तेजन बढ़ जाता है जबकि 480 एनएम उत्तेजन कम हो जाता है। इसके परिणामस्वरूप एच 2ओ 2उपस्थिति के लिए एक अनुपातमेट्रिक रीडआउट होता है। यह आंकड़ा बिलन और बेलोसोव (२०१७)16 और मॉर्गन एट अल (२०११)25से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
दानियो रेरियो (जेब्राफिश) मॉडल सिस्टम में जेनेटिकली इनकोडेड बायोसेंसर लगाने के कई फायदे हैं। भ्रूण और लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता वीवो इमेजिंग में गैर-आक्रामक सक्षम बनाती है। उच्च संकल्प और गहरी पैठ17को प्राप्त करने के लिए नए इमेजिंग उपकरण विकसित किए जा रहे हैं । इसके अलावा, आनुवंशिक हेरफेर (एक्टोपिक एमआरएनए अभिव्यक्ति, टोल 2 ट्रांसजेनेसिस, आदि) और जीनोम संपादन (टैलेन्स, CRISPR/Cas9, आदि) के लिए स्थापित उपकरण हैं, जो ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी को बढ़ावा देता है18। के रूप में जेब्राफिश भ्रूण मां के बाहर विकसित, इस प्रणाली को आगे आसान पहुंच और भ्रूण के हेरफेर की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक सेल चरण इंजेक्शन और दवा उपचार आसानी से किया जा सकता है।
यहां, हमने जेब्राफ़िश का उपयोग वीइट्रो-लिखित एमआरएनए में इंजेक्शन देकर एच2ओ-विशिष्टबायोसेंसर roGFP2-Orp1 को स्थानांतरित करने के लिए किया। इन भ्रूणों का उपयोग सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के विट्रो इमेजिंग और वीवो इमेजिंग(चित्रा 2)दोनों के लिए किया जा सकता है। हम जेब्राफिश भ्रूण से रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) को विच्छेदन और चढ़ाना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसके बाद सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में एच2ओ2-स्तरोंका आकलन किया जाता है। फिर, हम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके roGFP2-Orp1-व्यक्त भ्रूण और लार्वा के वीवो इमेजिंग में एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण न केवल शारीरिक एच2 ओ-2-स्तरोंको निर्धारित करने की अनुमति देता है बल्कि विभिन्न विकासात्मक चरणों या स्थितियों में होने वाले संभावित परिवर्तनों को भी इंगित करता है। कुल मिलाकर, यह प्रणाली विकास, स्वास्थ्य और रोग में एच2ओ2 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए जीवित कोशिकाओं और जानवरों में एच2ओ2 का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करती है।
चित्रा 2। प्रायोगिक दृष्टिकोण की रूपरेखा। संक्षेप में, भ्रूण संग्रह के बाद, roGFP2-Orp1 mRNA एक सेल चरण जेब्राफिश भ्रूण की जर्दी में इंजेक्शन है । विकसित भ्रूण दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(ए) इन विट्रो और(बी) वीवो इमेजिंग में । (A)जीएफपी पॉजिटिव भ्रूण का उपयोग 34 एचपीएफ पर आरजीसी संग्रह के लिए रेटिना को विच्छेदन करने के लिए किया जाता है। ZFCM (+) मीडिया में पीडीएल/लैमिनिन-लेपित कवरस्लिप पर अलग-अलग आरजीसी चढ़ाया जाता है। विकास शंकु इमेजिंग आयोजित किया जा सकता है के रूप में RGCs चढ़ाना के 6-24 घंटे के बाद अपने अक्षों का विस्तार । कोशिकाओं को एच2O 2-स्तरों में संभावित परिवर्तनों को मापने के लिए विभिन्नउपचारोंके अधीन किया जा सकता है। यहां, हमने आरजीसी (लाल) के विकास शंकु मेंएच2 ओ2-स्तरों को मापा। (ख)जीएफपी पॉजिटिव भ्रूण का उपयोग वीवो इमेजिंग में किया जाता है। वांछित उम्र में, भ्रूण को एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजनों पर रखा जा सकता है। यहां, भ्रूण रेटिना इमेजिंग के लिए वेंट्रेली मुहिम शुरू की जाती है। योजनाबद्ध जेब्राफिश में रेटिना विकास दिखाता है। आरजीसी गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) बनाते हैं, जो रेटिना में अंतरतम परत है। आरजीसी एक्सन्स ऑप्टिक चियाम बनाते हुए मिडलाइन को पार करने के लिए ऑप्टिक नर्व में विकसित होते हैं। फिर, आरजीसी एक्सॉन मिडब्रेन में ऑप्टिक टेक्टम में सिनेप्स बनाने के लिए पृष्ठीय रूप से बढ़ते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। हमारा मानना है कि इन बिंदुओं पर विचार करने से प्रायोगिक प्रवाह में सुधार होगा । प्राथमिक आरजीसी संस्कृति के लिए, ZFCM (-) की बंध्याकर…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ (ग्रांट R01NS117701), नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट ११४६९४४-आईओएस), इंडियाना ट्रॉमेटिक स्पाइनल कॉर्ड एंड ब्रेन इंजरी रिसर्च फंड (ग्रांट 20000289), पर्ड्यू रिसर्च फाउंडेशन (ग्रांट 209911) और पर्ड्यू यूनिवर्सिटी (ग्रांट 210362) में रिसर्च एंड पार्टनरशिप के लिए एग्जीक्यूटिव वाइस प्रेसिडेंट का ऑफिस ने सपोर्ट किया । हम जेब्राफिश आरजीसी कल्चर प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए डॉ कोरी जे वीवर और हेली रोडर को धन्यवाद देते हैं । हम चित्रा 4 का डेटा उपलब्ध कराने के लिए इसके अतिरिक्त हेली रोडर को धन्यवाद देते हैं । हम आरजीसी संस्कृति के साथ मदद के लिए लिआ बायसी और केनी गुयेन को धन्यवाद देते हैं। हम पाठ संपादन के लिए गेंट्री ली का शुक्रिया अदा करते हैं । हम रोगFP2-Orp1 और डॉ किंग देंग को pCS2+ वेक्टर के लिए roGFP2-Orp1 प्रदान करने के लिए डॉ टोबीस डिक को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 2 Biorender.com के साथ बनाया गया है।
35-mm culture dish | Sarstedt | 83-3900 | |
35-mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
Cover glass | Corning | 2850-22 | |
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
Glucose | Sigma Aldich | G7528 | |
HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
Injection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Inverted Microscope | Nikon | TE2000 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | 710 | |
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
Low melting agarose | Promega | V2111 | |
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
NotI | New England Biolabs | R0189S | |
PBS | Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | |
Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Phenol Red | Sigma Aldich | P0290 | |
Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
QiaQUICK PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Recombinant mouse slit2 | R&D Systems | 5444-SL-050 | |
Sodium Pyruvate | Sigma Aldich | P5280 | |
Steritop 0.22 µm filter | Millipore | S2GPT05RE | |
TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
Tricaine Methanesulfonate | Sigma Aldich | E10521 | |
Vertical Pipette Puller | David Kopf Instruments | 700C |