ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind gut etablierte Signalmoleküle, die für die normale Entwicklung, Homöostase und Physiologie wichtig sind. Unter den verschiedenen ROS istWasserstoffperoxid (H2O2) am besten in Bezug auf die Rolle in der zellulären Signalübertragung charakterisiert. H2O2 wurde während der Entwicklung an mehreren Arten beteiligt. Beispielsweise wurde in denersten Tagen nach der Befruchtung ein vorübergehender Anstieg vonH2O2 in Zebrafischembryonen nachgewiesen. Darüber hinaus beeinträchtigt die Erschöpfung einer wichtigen zellulärenH2O2-Quelle,der NADPH-Oxidase (NOX), die Entwicklung des Nervensystems wie die Differenzierung, das axonale Wachstum und die Führung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) sowohl in vivo als auch in vitro. Hier beschreiben wir eine Methode zurAbbildung intrazellulärer H2O2-Spiegel in kultivierten Zebrafischneuronen und ganzen Larven während der Entwicklung unter Verwendung des genetisch kodiertenH2O2-spezifischenBiosensors roGFP2-Orp1. Diese Sonde kann vorübergehend oder stabil in Zebrafischlarven exprimiert werden. Darüber hinaus verringert die ratiometrische Auslesung die Wahrscheinlichkeit, Artefakte aufgrund differentieller Genexpression oder Volumeneffekte zu erkennen. Zunächst zeigen wir, wie man RGCs aus Zebrafischembryonen isoliert und kultiviert, die vorübergehend roGFP2-Orp1 exprimieren. Dann verwenden wir ganze Larven, um H2O2-Spiegelauf Gewebeebene zu überwachen. Der Sensor wurde durch Zugabe vonH2O2validiert. Darüber hinaus könnte diese Methodik verwendet werden, umH2O2-Spiegelin bestimmten Zelltypen und Geweben zu messen, indem transgene Tiere mit gewebespezifischer Biosensorexpression erzeugt werden. Da Zebrafische genetische und entwicklungswirkende Manipulationen erleichtern, könnte der hier demonstrierte Ansatz als Pipeline dienen, um die Rolle vonH2O2 während der neuronalen und allgemeinen Embryonalentwicklung bei Wirbeltieren zu testen.
Introduction
Die Signalisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) reguliert die Entwicklung und Funktion des Nervensystems1. Eine wichtige zelluläre ROS-Quelle sind NADPH-Oxidasen (NOX), bei denen es sich um Transmembranproteine handelt, die Superoxid und Wasserstoffperoxid(H2O2)2erzeugen. NOX-Enzyme finden sich im gesamten zentralen Nervensystem (ZNS), und NOX-abgeleitetes ROS trägt zur neuronalen Entwicklung bei3,4,5,6. Es wurde gezeigt, dass die Erhaltung und Differenzierung neuronaler Stammzellen, die Etablierung neuronaler Polarität, Neuritenauswuchs und synaptischer Plastizität ausreichende Mengen an ROS7,8,9,10,11erfordern . Auf der anderen Seite trägt die unkontrollierte Produktion von ROS durch NOXen zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Multipler Sklerose und traumatischen Hirnverletzungen bei12,13,14. Daher ist die Produktion von physiologisch relevantem ROS entscheidend für die Aufrechterhaltung gesunder Bedingungen.
Die Entwicklung genetisch kodierter Biosensoren erleichterte den Nachweis von zellulärem ROS erheblich. Ein wichtiger Vorteil genetisch kodierter Biosensoren ist die erhöhte zeitliche und räumliche Auflösung des ROS-Signals, da diese Sensoren gezielt auf unterschiedliche Orte ausgerichtet werden können. Redox-sensitive GFP (roGFP) ist eine Art solcher ROS-Biosensoren. Die roGFP2-Orp1-Variante detektiert spezifischH2O2durch seine Orp1-Domäne, die ein Glutathion-Peroxiredoxin-Familienprotein aus Hefe15,16ist. Die Oxidation des Orp1-Proteins wird auf roGFP2 übertragen, um seine Konformation zu verändern (Abbildung 1A). Die Sonde weist zwei Anregungsspitzen nahe 405 nm und 480 nm sowie einen einzigen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei der Oxidation ändert sich die Fluoreszenzintensität um Anregungsspitzen: Während die Anregung um 405 nm zunimmt, nimmt die Anregung um 480 nm ab. Somit ist roGFP2-Orp1 ein ratiometrischer Biosensor, undH2O2-Spiegelwerden durch das Verhältnis der Fluoreszenzdicken detektiert, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden ( Abbildung1B). Insgesamt ist roGFP2-Orp1 ein vielseitiges Werkzeug für die ROS-Bildgebung, das in vivoeffizient eingesetzt werden kann.
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Anregungsspektren von roGFP2-Orp1. (A) Oxidationsmitteltransfer findet zwischen Orp1 und roGFP2 als Reaktion aufH2O2statt, was zu Konformationsänderungen in roGFP2 führt. (B) Die Anregungsspektren des roGFP2-Orp1 weisen zwei Anregungspeaks bei 405 nm und 480 nm und einen einzelnen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei Oxidation durchH2O2nimmt die 405 nm Anregung zu, während die 480 nm Anregung abnimmt. Daraus ergibt sich eine ratiometrische Auslesung für H2O2-Anwesenheit. Die Figur wurde von Bilan und Belousov (2017)16 und Morgan et al. (2011)25modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Modellsystem Danio rerio (Zebrafisch) hat mehrere Vorteile für die Anwendung genetisch kodierter Biosensoren. Die optische Transparenz der Embryonen und Larven ermöglicht eine nicht-invasive In-vivo-Bildgebung. Neue Bildgebungswerkzeuge werden entwickelt, um eine höhere Auflösung und eine tiefere Durchdringung zu erreichen17. Darüber hinaus gibt es etablierte Werkzeuge zur genetischen Manipulation (ektopische mRNA-Expression, Tol2-Transgenese usw.) und Genom-Editing (TALENs, CRISPR/Cas9 usw.), die die Erzeugung transgener Tiere fördern18. Da sich die Zebrafischembryonen außerhalb der Mutter entwickeln, ermöglicht dieses System einen leichteren Zugang und eine einfachere Manipulation der Embryonen. Zum Beispiel können Injektionen und medikamentöse Behandlungen im Einzelzellstadium leicht durchgeführt werden.
Hier verwendeten wir Zebrafische, um denH2O2-spezifischenBiosensor roGFP2-Orp1 transient zu exprimieren, indem wir in vitro-transkribierte mRNA injizierten. Diese Embryonen können sowohl für die In-vitro-Bildgebung von kultivierten Neuronen als auch für die In-vivo-Bildgebung verwendet werden (Abbildung 2). Wir beschreiben ein Protokoll zur Sezierung und Beschichtung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) aus Zebrafischembryonen, gefolgt von der Beurteilung derH2O2-Spiegelin kultivierten Neuronen. Anschließend stellen wir eine Methode zur In-vivo-Bildgebung von roGFP2-Orp1-exprimierenden Embryonen und Larven mittels konfokaler Mikroskopie vor. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur dieBestimmung physiologischerH2O2-Spiegel,sondern auch potenzielle Veränderungen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien oder -bedingungen auftreten. Insgesamt bietet dieses System eine zuverlässige Methode zum Nachweis vonH2O2inlebenden Zellen und Tieren, um die Rolle vonH2O2in Entwicklung, Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.
Abbildung 2. Überblick über den experimentellen Ansatz. Kurz gesagt, nach der Embryoentnahme wird roGFP2-Orp1 mRNA in das Eigelb von einzelligen Zebrafischembryonen injiziert. Sich entwickelnde Embryonen können sowohl für (A) in vitro als auch (B) in vivo Bildgebung verwendet werden. (A) GFP-positive Embryonen werden verwendet, um Netzhäute für die RGC-Sammlung bei 34 HPF zu sezieren. Dissoziierte RGCs werden auf PDL/Laminin-beschichteten Deckschichten in ZFCM(+)-Medien plattiert. Wachstumskegelbildgebung kann durchgeführt werden, wenn RGCs ihre Axone nach 6-24 Stunden Beschichtung erweitern. Zellen können verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, um die möglichen Veränderungen derH2O2-Spiegelzu messen. Hier haben wirH2O2-Spiegelin den Wachstumskegeln von RGCs (rot) gemessen. (B) GFP-positive Embryonen werden für die In-vivo-Bildgebung verwendet. Im gewünschten Alter können Embryonen betäubt und auf 35 mm Glasbodenschalen für die konfokale Bildgebung montiert werden. Hier werden Embryonen ventral für die netzhautale Bildgebung montiert. Schematisch zeigt die Netzhautentwicklung bei Zebrafischen. RGCs bilden die Ganglienzellschicht (GCL), die die innerste Schicht in der Netzhaut ist. RGC-Axone entwickeln sich zu Sehnerven, um die Mittellinie zu überqueren und optisches Chiasmus zu bilden. Dann wachsen RGC-Axone dorsal, um Synapsen im optischen Tectum im Mittelhirn zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere kritische Schritte, die in diesem Protokoll beachtet werden müssen. Wir glauben, dass die Berücksichtigung dieser Punkte den experimentellen Fluss verbessern wird. Für die primäre RGC-Kultur ist die Sterilität des ZFCM(-) sehr wichtig, da dieses Nährmedium keine Antibiotika enthält und vor oder während der Bildgebung eine Kontamination auftreten kann. Um dies zu vermeiden, empfehlen wir, ZFCM(-) nur in einer Biosicherheitswerkbank vorzubereiten und zu verwenden und regelmäßig frische ZFCM(-)-Med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grant R01NS117701), der National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), dem Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), der Purdue Research Foundation (Grant 209911) und dem Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships an der Purdue University (Grant 210362) unterstützt. Wir danken Dr. Cory J. Weaver und Haley Roeder für die Etablierung des Zebrafisch-RGC-Kulturprotokolls. Wir danken Haley Roeder zusätzlich für die Bereitstellung der Daten von Abbildung 4. Wir danken Leah Biasi und Kenny Nguyen für die Hilfe bei der RGC-Kultur. Wir danken Gentry Lee für die Bearbeitung des Textes. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von roGFP2-Orp1 und Dr. Qing Deng für pCS2+ Vektoren, die roGFP2-Orp1 enthalten. Abbildung 2 wird mit Biorender.com erstellt.
Materials
| 35-mm culture dish | Sarstedt | 83-3900 | |
| 35-mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cover glass | Corning | 2850-22 | |
| Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
| Glucose | Sigma Aldich | G7528 | |
| HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
| Injection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Inverted Microscope | Nikon | TE2000 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | 710 | |
| Leibovitz's L-15 Medium with phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
| Leibovitz's L-15 Medium without phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
| Low melting agarose | Promega | V2111 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| PBS | Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Phenol Red | Sigma Aldich | P0290 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
| QiaQUICK PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Recombinant mouse slit2 | R&D Systems | 5444-SL-050 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldich | P5280 | |
| Steritop 0.22 µm filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma Aldich | E10521 | |
| Vertical Pipette Puller | David Kopf Instruments | 700C |
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