Denne protokollen beskriver bruken av en genetisk kodet hydrogenperoksid (H2 O2)-biosensori kultiverte sebrafisk-nevroner og larver for å vurdere de fysiologiske signalrollene til H2O2 under nervesystemutvikling. Det kan brukes på forskjellige celletyper og modifisert med eksperimentelle behandlinger for å studere reaktive oksygenarter (ROS) i generell utvikling.
Reaktive oksygenarter (ROS) er veletablerte signalmolekyler, som er viktige i normal utvikling, homeostase og fysiologi. Blant de forskjellige ROS er hydrogenperoksid(H2O2) best karakterisert med hensyn til roller i cellulær signalering. H2O2 har vært involvert under utviklingen i flere arter. For eksempel har det blitt påvist en forbigående økning i H2O2 i sebrafiskembryoer i løpet av de første dagene etter befruktning. Videre, uttømming av en viktig cellulær H2O2-kilde, NADPH oxidase (NOX), svekker utviklingen av nervesystemet som differensiering, axonal vekst og veiledning av retinal ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode for avbildning av intracellulære H2O2-nivåer i dyrkede sebrafisk-nevroner og hele larver under utvikling ved hjelp av den genetisk kodede H2O2-spesifikke biosensoren, roGFP2-Orp1. Denne sonden kan være forbigående eller stabilt uttrykt i sebrafisk larver. Videre reduserer den ratiometriske avlesningen sannsynligheten for å oppdage artefakter på grunn av differensialgenuttrykk eller volumeffekter. For det første demonstrerer vi hvordan man isolerer og kultur RGCer avledet fra sebrafisk embryoer som midlertidig uttrykker roGFP2-Orp1. Deretter bruker vi hele larver for å overvåke H2O2 nivåer på vevsnivå. Sensoren er validert ved å legge til H2O2. I tillegg kan denne metoden brukes til å måle H2O2-nivåer i bestemte celletyper og vev ved å generere transgene dyr med vevsspesifikk biosensoruttrykk. Ettersom sebrafisk letter genetiske og utviklingsmessige manipulasjoner, kan tilnærmingen som er demonstrert her tjene som en rørledning for å teste rollen som H2O2 under nevronal og generell embryonal utvikling i vertebrater.
Reaktive oksygenarter (ROS) som signaliserer regulerer utvikling og funksjon av nervesystemet1. En viktig cellulær ROS-kilde er NADPH oksidase (NOX), som er transmembrane proteiner som genererer superoksid og hydrogenperoksid(H2O2)2. NOX enzymer finnes i hele sentralnervesystemet (CNS), og NOX-avledet ROS bidrar til nevronutvikling3,4,5,6. Vedlikehold og differensiering av nevrale stamceller, etablering av nevronal polaritet, nevrittutvekst og synaptisk plastisitet har vist seg å kreve tilstrekkelige nivåer av ROS7,8,9,10,11. På den annen side bidrar ukontrollert produksjon av ROS av NOXer til nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom, multippel sklerose og traumatisk hjerneskade12,13,14. Derfor er produksjon av fysiologisk relevant ROS avgjørende for å opprettholde sunne forhold.
Utvikling av genetisk kodede biosensorer forenklet påvisning av cellulær ROS sterkt. En viktig fordel med genetisk kodede biosensorer er den økte tidsmessige og romlige oppløsningen til ROS-signalet, da disse sensorene kan målrettes spesifikt mot forskjellige steder. Redoksensitiv GFP (roGFP) er en type slike ROS biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten oppdager spesielt H2O2 gjennom Orp1-domenet, som er et glutathione peroxiredoxin-familieprotein fra gjær15,16. Oksidasjonen av Orp1-proteinet overføres til roGFP2 for å endre konformasjonen (figur 1A). Sonden viser to eksitasjonstopper nær 405 nm og 480 nm, og en enkelt utslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon endres fluorescensintensiteten rundt eksitasjonstopper: mens 405 nm eksitasjon øker, reduseres 480 nm eksitasjon. Dermed er roGFP2-Orp1 en ratiometrisk biosensor, og H2O2-nivåer oppdages av forholdet mellom fluorescensintensiteter begeistret ved to forskjellige bølgelengder (Figur 1B). Totalt sett er roGFP2-Orp1 et allsidig verktøy for ROS-avbildning som kan brukes effektivt in vivo.
Figur 1: Skjematisk representasjon og eksitasjonsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oksidantoverføring skjer mellom Orp1 og roGFP2 som svar på H2O2, noe som fører til konformasjonsendringer i roGFP2. (B) Eksitasjonsspektraet til roGFP2-Orp1 viser to eksitasjonstopper på 405 nm og 480 nm og enkeltutslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon med H2O2øker eksitasjonen på 405 nm mens eksitasjonen på 480 nm minker. Dette resulterer i en ratiometric avlesning for H2O2 tilstedeværelse. Figuren er modifisert fra Bilan og Belousov (2017)16 og Morgan et al. (2011)25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Danio rerio (sebrafish) modellsystemet har flere fordeler for å bruke genetisk kodede biosensorer. Den optiske gjennomsiktigheten til embryoer og larver muliggjør ikke-invasiv in vivo-avbildning. Nye bildeverktøy utvikles for å oppnå høyere oppløsning og dypere penetrasjon17. Videre er det etablerte verktøy for genetisk manipulasjon (ektopisk mRNA-uttrykk, Tol2 transgenese, etc.) og genomredigering (TALENer, CRISPR / Cas9, etc.), som fremmer generering av transgene dyr18. Etter hvert som sebrafiskembryoene utvikler seg utenfor moren, gir dette systemet ytterligere enklere tilgang og manipulering av embryoene. For eksempel kan encellede injeksjoner og narkotikabehandlinger enkelt gjøres.
Her brukte vi sebrafisk for å midlertidig uttrykke H2O2-spesifikk biosensor roGFP2-Orp1 ved å injisere in vitro-transkribert mRNA. Disse embryoene kan brukes til både in vitro-avbildning av dyrkede nevroner og in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver en protokoll for dissekering og plating retinal ganglion celler (RGCs) fra sebrafisk embryoer etterfulgt av å vurdereH2O2-nivåer i dyrkede nevroner. Deretter presenterer vi en metode for in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttrykkende embryoer og larver ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne tilnærmingen tillater ikke bare å bestemme fysiologiske H2O2-nivåer,men også potensielle endringer som skjer i forskjellige utviklingsstadier eller forhold. Totalt sett gir dette systemet en pålitelig metode for å oppdage H2O2 i levende celler og dyr for å studere rollen som H2O2 i utvikling, helse og sykdom.
Figur 2. Omriss av den eksperimentelle tilnærmingen. Kort sagt, etter embryosamling injiseres roGFP2-Orp1 mRNA i eggeplommen av encellede sebrafiskembryoer. Utvikling av embryoer kan brukes til både (A) in vitro og (B) in vivo avbildning. (A) GFP-positive embryoer brukes til å dissekere netthinner for RGC-oppsamling ved 34 hkf. Dissosierte RGCer er belagt på PDL/lamininbelagte deksler i ZFCM (+)-medier. Vekstkjegleavbildning kan utføres ettersom RGCer utvider axonene sine etter 6-24 timers plating. Celler kan utsettes for ulike behandlinger for å måle de potensielle endringene i H2O2-nivåer. Her målte viH2O2-nivåer i vekstkjeglene til RGCer (rød). (B) GFP positive embryoer brukes til in vivo-avbildning. I ønsket alder kan embryoer bedøves og monteres på 35 mm glassbunnsretter for konfikal avbildning. Her er embryoer montert ventrally for retinal avbildning. Skjematisk viser retinal utvikling i sebrafisk. RGCer danner ganglion cellelag (GCL), som er det innerste laget i netthinnen. RGC-axoner utvikler seg til optisk nerve for å krysse midtlinjen, og danner optisk chiasm. Deretter vokser RGC-axoner dorsalt for å lage synapser i det optiske tectum i midbrain. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det er flere kritiske trinn som trenger oppmerksomhet gjennom hele denne protokollen. Vi tror at å vurdere disse punktene vil forbedre den eksperimentelle strømmen. For primær RGC-kultur er steriliteten til ZFCM(-) svært viktig, siden dette kulturmediet ikke inneholder antibiotika og forurensning kan oppstå før eller under avbildning. For å unngå det, anbefaler vi å forberede og bruke ZFCM (-) bare inne i et biosikkerhetsskap og lage ferske ZFCM (-) medier regelmessig (trinn 1.5). I tillegg bør lamininlagrene h…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) og Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships ved Purdue University (Grant 210362). Vi takker Dr. Cory J. Weaver og Haley Roeder for å etablere sebrafisk RGC kulturprotokoll. Vi takker Haley Roeder i tillegg for å ha gitt dataene til figur 4. Vi takker Leah Biasi og Kenny Nguyen for hjelpen med RGC-kulturen. Vi takker Gentry Lee for at han redigerte teksten. Vi takker Dr. Tobias Dick for å ha levert roGFP2-Orp1 og Dr. Qing Deng for pCS2+ vektor som inneholder roGFP2-Orp1. Figur 2 opprettes med Biorender.com.
35-mm culture dish | Sarstedt | 83-3900 | |
35-mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
Cover glass | Corning | 2850-22 | |
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
Glucose | Sigma Aldich | G7528 | |
HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
Injection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Inverted Microscope | Nikon | TE2000 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | 710 | |
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
Low melting agarose | Promega | V2111 | |
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
NotI | New England Biolabs | R0189S | |
PBS | Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | |
Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Phenol Red | Sigma Aldich | P0290 | |
Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
QiaQUICK PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Recombinant mouse slit2 | R&D Systems | 5444-SL-050 | |
Sodium Pyruvate | Sigma Aldich | P5280 | |
Steritop 0.22 µm filter | Millipore | S2GPT05RE | |
TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
Tricaine Methanesulfonate | Sigma Aldich | E10521 | |
Vertical Pipette Puller | David Kopf Instruments | 700C |