Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ROS Live Cell Imaging under nevronutvikling

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av en genetisk kodet hydrogenperoksid (H2 O2)-biosensori kultiverte sebrafisk-nevroner og larver for å vurdere de fysiologiske signalrollene til H2O2 under nervesystemutvikling. Det kan brukes på forskjellige celletyper og modifisert med eksperimentelle behandlinger for å studere reaktive oksygenarter (ROS) i generell utvikling.

Abstract

Reaktive oksygenarter (ROS) er veletablerte signalmolekyler, som er viktige i normal utvikling, homeostase og fysiologi. Blant de forskjellige ROS er hydrogenperoksid(H2O2) best karakterisert med hensyn til roller i cellulær signalering. H2O2 har vært involvert under utviklingen i flere arter. For eksempel har det blitt påvist en forbigående økning i H2O2 i sebrafiskembryoer i løpet av de første dagene etter befruktning. Videre, uttømming av en viktig cellulær H2O2-kilde, NADPH oxidase (NOX), svekker utviklingen av nervesystemet som differensiering, axonal vekst og veiledning av retinal ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode for avbildning av intracellulære H2O2-nivåer i dyrkede sebrafisk-nevroner og hele larver under utvikling ved hjelp av den genetisk kodede H2O2-spesifikke biosensoren, roGFP2-Orp1. Denne sonden kan være forbigående eller stabilt uttrykt i sebrafisk larver. Videre reduserer den ratiometriske avlesningen sannsynligheten for å oppdage artefakter på grunn av differensialgenuttrykk eller volumeffekter. For det første demonstrerer vi hvordan man isolerer og kultur RGCer avledet fra sebrafisk embryoer som midlertidig uttrykker roGFP2-Orp1. Deretter bruker vi hele larver for å overvåke H2O2 nivåer på vevsnivå. Sensoren er validert ved å legge til H2O2. I tillegg kan denne metoden brukes til å måle H2O2-nivåer i bestemte celletyper og vev ved å generere transgene dyr med vevsspesifikk biosensoruttrykk. Ettersom sebrafisk letter genetiske og utviklingsmessige manipulasjoner, kan tilnærmingen som er demonstrert her tjene som en rørledning for å teste rollen som H2O2 under nevronal og generell embryonal utvikling i vertebrater.

Introduction

Reaktive oksygenarter (ROS) som signaliserer regulerer utvikling og funksjon av nervesystemet1. En viktig cellulær ROS-kilde er NADPH oksidase (NOX), som er transmembrane proteiner som genererer superoksid og hydrogenperoksid(H2O2)2. NOX enzymer finnes i hele sentralnervesystemet (CNS), og NOX-avledet ROS bidrar til nevronutvikling3,4,5,6. Vedlikehold og differensiering av nevrale stamceller, etablering av nevronal polaritet, nevrittutvekst og synaptisk plastisitet har vist seg å kreve tilstrekkelige nivåer av ROS7,8,9,10,11. På den annen side bidrar ukontrollert produksjon av ROS av NOXer til nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom, multippel sklerose og traumatisk hjerneskade12,13,14. Derfor er produksjon av fysiologisk relevant ROS avgjørende for å opprettholde sunne forhold.

Utvikling av genetisk kodede biosensorer forenklet påvisning av cellulær ROS sterkt. En viktig fordel med genetisk kodede biosensorer er den økte tidsmessige og romlige oppløsningen til ROS-signalet, da disse sensorene kan målrettes spesifikt mot forskjellige steder. Redoksensitiv GFP (roGFP) er en type slike ROS biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten oppdager spesielt H2O2 gjennom Orp1-domenet, som er et glutathione peroxiredoxin-familieprotein fra gjær15,16. Oksidasjonen av Orp1-proteinet overføres til roGFP2 for å endre konformasjonen (figur 1A). Sonden viser to eksitasjonstopper nær 405 nm og 480 nm, og en enkelt utslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon endres fluorescensintensiteten rundt eksitasjonstopper: mens 405 nm eksitasjon øker, reduseres 480 nm eksitasjon. Dermed er roGFP2-Orp1 en ratiometrisk biosensor, og H2O2-nivåer oppdages av forholdet mellom fluorescensintensiteter begeistret ved to forskjellige bølgelengder (Figur 1B). Totalt sett er roGFP2-Orp1 et allsidig verktøy for ROS-avbildning som kan brukes effektivt in vivo.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon og eksitasjonsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oksidantoverføring skjer mellom Orp1 og roGFP2 som svar på H2O2, noe som fører til konformasjonsendringer i roGFP2. (B) Eksitasjonsspektraet til roGFP2-Orp1 viser to eksitasjonstopper på 405 nm og 480 nm og enkeltutslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon med H2O2øker eksitasjonen på 405 nm mens eksitasjonen på 480 nm minker. Dette resulterer i en ratiometric avlesning for H2O2 tilstedeværelse. Figuren er modifisert fra Bilan og Belousov (2017)16 og Morgan et al. (2011)25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Danio rerio (sebrafish) modellsystemet har flere fordeler for å bruke genetisk kodede biosensorer. Den optiske gjennomsiktigheten til embryoer og larver muliggjør ikke-invasiv in vivo-avbildning. Nye bildeverktøy utvikles for å oppnå høyere oppløsning og dypere penetrasjon17. Videre er det etablerte verktøy for genetisk manipulasjon (ektopisk mRNA-uttrykk, Tol2 transgenese, etc.) og genomredigering (TALENer, CRISPR / Cas9, etc.), som fremmer generering av transgene dyr18. Etter hvert som sebrafiskembryoene utvikler seg utenfor moren, gir dette systemet ytterligere enklere tilgang og manipulering av embryoene. For eksempel kan encellede injeksjoner og narkotikabehandlinger enkelt gjøres.

Her brukte vi sebrafisk for å midlertidig uttrykke H2O2-spesifikk biosensor roGFP2-Orp1 ved å injisere in vitro-transkribert mRNA. Disse embryoene kan brukes til både in vitro-avbildning av dyrkede nevroner og in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver en protokoll for dissekering og plating retinal ganglion celler (RGCs) fra sebrafisk embryoer etterfulgt av å vurdereH2O2-nivåer i dyrkede nevroner. Deretter presenterer vi en metode for in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttrykkende embryoer og larver ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne tilnærmingen tillater ikke bare å bestemme fysiologiske H2O2-nivåer,men også potensielle endringer som skjer i forskjellige utviklingsstadier eller forhold. Totalt sett gir dette systemet en pålitelig metode for å oppdage H2O2 i levende celler og dyr for å studere rollen som H2O2 i utvikling, helse og sykdom.

Figure 2
Figur 2. Omriss av den eksperimentelle tilnærmingen. Kort sagt, etter embryosamling injiseres roGFP2-Orp1 mRNA i eggeplommen av encellede sebrafiskembryoer. Utvikling av embryoer kan brukes til både (A) in vitro og (B) in vivo avbildning. (A) GFP-positive embryoer brukes til å dissekere netthinner for RGC-oppsamling ved 34 hkf. Dissosierte RGCer er belagt på PDL/lamininbelagte deksler i ZFCM (+)-medier. Vekstkjegleavbildning kan utføres ettersom RGCer utvider axonene sine etter 6-24 timers plating. Celler kan utsettes for ulike behandlinger for å måle de potensielle endringene i H2O2-nivåer. Her målte viH2O2-nivåer i vekstkjeglene til RGCer (rød). (B) GFP positive embryoer brukes til in vivo-avbildning. I ønsket alder kan embryoer bedøves og monteres på 35 mm glassbunnsretter for konfikal avbildning. Her er embryoer montert ventrally for retinal avbildning. Skjematisk viser retinal utvikling i sebrafisk. RGCer danner ganglion cellelag (GCL), som er det innerste laget i netthinnen. RGC-axoner utvikler seg til optisk nerve for å krysse midtlinjen, og danner optisk chiasm. Deretter vokser RGC-axoner dorsalt for å lage synapser i det optiske tectum i midbrain. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble etisk gjennomgått og godkjent av Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), etter NIH-retningslinjer med protokollen 2006002050 godkjent 24.07.2020.

1. Utarbeidelse av løsninger

  1. E2-medier (1x)
    1. Forbered 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 ml) og 500x E2C (100 ml) ved å kombinere alle komponentene som vises i tabell 1. Autoklaver E2A-, E2B- og E2C-løsninger. Oppbevars ved 4 °C.
    2. For 1x E2-medier: Kombiner 5 ml 100x E2A, 1 ml 500x E2B og 1 ml 500x E2C. Ta volumet til 500 ml med sterilt vann. Juster pH til 7,0-7,5.
    3. Forbered 50 ml aliquots av 1x E2 mediebutikk ved -20 °C for langtidslagring. Nedbør kan imidlertid oppstå ved opptining. Pass på at nedbøren er helt oppløst før du bruker lagerløsningen.
løsning komponent beløp konsentrasjon
100X E2A (500ml)
NaCl 43,8 g 1500 mM
KCl 1,88 g 50 mM
MgSO4 6 g 100 mM
KH2PO4 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 ml)
CaCl2 5,5 g 500 mM
500X E2C (100 ml)
NaHCO3 3 g 350 mM
1X E2 (500 ml)
100X E2A 5 ml 1X
500X E2B 1 ml 1X
500X E2C 1 ml 1X

Tabell 1: Komponenter i 1x E2-medier for sebrafiskcellekultur.

  1. E3-medier (1x)
    1. Løs opp komponentene i 1 L sterilt vann som vist i tabell 2 for å lage 100x lager. Fortynn lageret i sterilt vann for å lage 1x E3-medier.
    2. Tilsett 0,2% metylenblå. For 20 ml 1x E3-medier, tilsett 40 μL metylenblå.
    3. Lag en annen batch uten metylenblå for fluorescerende avbildning.
komponent Beløp (g) Konsentrasjon i 100X lager (mM)
NaCl 29.22 500
KCl 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tabell 2: Komponenter av 100x E3-medier for vedlikehold av sebrafiskembryoer.

  1. 80x saltløsning
    1. Kombiner alle komponentene som vises i Tabell 3. Tilsett vann for å lage 100 ml løsning. Bland til alle komponentene er oppløst. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
komponent Beløp (g) Konsentrasjon på lager (mM)
glukose 1.44 80
Natrium Pyruvat 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES 6.1 256

Tabell 3: Komponenter av 80x saltløsning for sebrafiskcellekulturmedier.

  1. Zebrafish cellekultur medium (ZFCM+)
    1. Kombiner alle komponentene som vises i tabell 4 for å lage 250 ml medier. Juster pH til 7,5. Filtrer medier med 0,22 μm filter og oppbevar ved 4 °C.
komponent Mengde (ml) Volum %
L-15 medium (med fenolrød) 212.75 85.1
Fetal Bovine serum (FBS) 5 2
Penicillin/Streptomycin 1 0.4
80X saltløsning 3.125 1.25
Vann 28.125 11.25

Tabell 4: Komponenter av sebrafiskcellekulturmedium med serum og antibiotika.

  1. Zebrafish cellekultur medium for avbildning (ZFCM-)
    1. Kombiner alle komponentene som vises i tabell 5 for å lage 250 ml medier. Juster pH til 7,5. Filtrer medier ved hjelp av 0,22 μm filter.
    2. Lag engangs aliquots (50 ml partier) for å forhindre forurensning. Oppbevars ved 4 °C.
komponent Mengde (ml) Volum %
L-15 medium (ingen fenol rød) 212.75 85.1
80X saltløsning 3.125 1.25
Vann 34.125 13.65

Tabell 5: Komponenter av sebrafiskcellekulturmedium uten serum og antibiotika for in vitro-avbildning.

  1. Injeksjonsformer
    1. Løs opp 1,5 % agarose i E3-medier. Hell ~ 25 ml agarose i en 100 x 15 mm Petri tallerken.
    2. Legg ned formen på toppen av agarose med en 45 ° vinkel med hensyn til overflaten, og la den flyte på agarose med langsom bevegelse. Dette vil bidra til å unngå bobler. La agarose avkjøles og størkne på benken.
    3. Når den er fullstendig størknet, fjern formen sakte for å forhindre brudd på agarose. Tilsett ferske E3-medier, tilsett parafinfilm rundt retten for å unngå søl, og oppbevar ved 4 °C ( figur 3).

Figure 3
Figur 3: Sprøyteformbilder. (A) Plastformen som brukes til å lage injeksjonsplater. Formen har seks ramper, en 90° og en 45° skrå side for å holde embryoer på plass. (B) Injeksjonsplaten etter at agarose størknet og mugg er fjernet. Skalastenger = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Tilberedning og injeksjon av roGFP2-Orp1 mRNA

MERK: RoGFP2-Orp1-konstruksjonen ble hentet fra Dr. Tobias Dick, DKFZ, Tyskland. Det ble sub-klonet inn i pCS2 + vektoren i Dr. Qing Deng's Lab, Purdue University. For å forhindre forringelse av RNase, må det tas flere forholdsregler. RNasefrie reagenser og rør må brukes til enhver tid, hansker må brukes til alle trinn, og alternativt kan materialer og overflater tørkes med et rengjøringsmiddel for fjerning av RNase.

  1. Lineariser 3-10 μg pCS2+/roGFP2-Orp1 vektor med NotI.
  2. Rens den lineariserte plasmiden med et PCR-oppryddingssett.
  3. In vitro transkriberer roGFP2-Orp1 mRNA med et in vitro transkripsjonssett i henhold til instruksjonene fra produsenten.
    1. Avkortet transkripsjonsreaksjonsenhet
      1. Plasser RNA-polymerase og linearisert/renset DNA på is. Vortex 10x reaksjonsbuffer og 2x NTP/CAP til de er helt i løsning. Oppbevar NTP/CAP på is, men hold bufferen ved romtemperatur (RT) mens du monterer reaksjonen. Trykk på alle reagenser før du åpner rør for å forhindre forurensning.
      2. Sett opp RNA-syntesereaksjon i den rekkefølgen som er angitt nedenfor ved RT i et RNase-fritt sentrifugerør på 0,5 ml. Siste volum av reaksjonen er 20 μL. Reaksjonsoppsett er vist i tabell 6.
      3. Tilsett 10 μL ribonukleotidblanding, 2x NTP/CAP og nukleasefritt vann, om nødvendig til røret. Tilsett 2 μL 10X reaksjonsbuffer. Tilsett 1-1,5 μg lineært DNA (opptil 6 μL). Tilsett om nødvendig nukleasefritt vann for å utgjøre 20 μL reaksjonsvolum.
      4. Lukk røret, virvelen kort og touch-spin mikrofuge. Tilsett 2 μL 10x SP6 enzymblanding. Lukk med et fingerklikk og berøringsspinn i en mikrofunksjon.
      5. Plasser i 37 °C i 2-2,5 timer (kan gå opp til 18 timer).
        MERK: I det presenterte eksperimentet over natten ble det utført 16-18 h inkubasjon ved 37 °C for best resultat.
      6. Tilsett 1 μL DNase for å fjerne DNA-mal, fingerklikk, berøringsspinn og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
Reagent Volum (μL) Mengde i reaksjon
2X NTP/CAP 10 1X
10X reaksjonsbuffer 2 1X
Mal DNA Opptil 6 1-1,5 μg
Nukleasefritt vann Legg til for å lage 20 μL
10X SP6 enzymblanding 2 1X

Tabell 6: Reaksjonsoppsett for roGFP2-Orp1 mRNA in vitro transkripsjon.

  1. RNA-gjenoppretting
    1. Tilsett 25 μL litiumklorid (LiCl) som følger med i in vitro-transkripsjonssettet. Plasser ved -20 °C i en fryser uten frost i minst 30 minutter.
    2. Spinn i 25 min ved maksimal hastighet i en bordplate sentrifuge ved 4 °C. Fjern og kast supernatant forsiktig, for ikke å forstyrre pellets. Tilsett 25 μL kaldt 75% etanol og spinn i 5 min ved 4 °C.
    3. Fjern forsiktig og kast supernatanten. La pelletsluften tørke i minst 5 min ved RT. Ikke la det tørke. Tilsett 12 μL nukleasefri Tris-EDTA (TE)-buffer (pH 7.0) og hold prøven på is.
    4. Mål RNA-konsentrasjonen med et spektrofotometer. 0,5-1 μg/μL oppnås vanligvis.
    5. Forbered 100 ng/μL mRNA i fenolrød oppløsning (0,5% fenolrød i Dulbeccos fosfatbufrede saltvann -DPBS) og aliquot til engangsbruk (3-5 μL). Oppbevar mRNA-aliquots ved - 80 °C.
  1. Mikroinjeksjon av mRNA
    1. På injeksjonsdagen, bruk en av mRNA-aliquots og følg sebrafisk embryoinjeksjonsprotokollen for å injisere 1 nL av mRNA i encellede embryoer gjennom eggeplommen19. En kort beskrivelse er gitt nedenfor.
    2. Ras voksen fisk og samle embryoer som tidligere beskrevet20.
    3. Trekk mikroinjeksjonsnåler med pipettetrekker. Klipp spissen av nålene med tang for å lage en 10 μm spissåpning.
    4. Juster embryoer i en injeksjonsform som ble beskrevet i trinn 1.6.
    5. Injiser 1 nL av mRNA i fenolrødt med en glassmikroinjeksjonspipette.
    6. Samle embryoer og oppbevar dem i E3-medier.
    7. Oppbevar embryoer i 27 °C inkubatoren i E3-medier til ønsket utviklingsstadium er oppnådd. Injiserte embryoer kan brukes til både in vitro (avsnitt 3 og avsnitt 4) og in vivo-avbildning (avsnitt 5). Embryoer som uttrykker roGFP2-Orp1 kan forhåndsvalges før eksperimenter med et vanlig disseksjonsmikroskop utstyrt med fluorescerende lys og et blått / grønt filtersett.

3. Primær retinal ganglion cellekultur avledet fra sebrafisk embryoer

MERK: Denne protokollen er tilpasset fra en tidligere publisert metode 21. Utfør trinn 3.1 og 3.2 i en laminær strømningshette.

  1. Forberedelse av dekslerlips
    1. Forbered 4-6 kulturplater i hvert eksperiment. Bruk syrerensede deksler (22 x 22 mm kvadrat; 0,16-0,19 mm tykkelse) som lagres i 100% etanol.
    2. Fjern ett deksle fra oppbevaringsbeholderen ved å bruke tang og flamme det for å fjerne gjenværende etanol.
    3. Lufttørk dekslene helt ved å plassere den i en vinkel inne i en 35 mm kulturfat.
    4. Forbered poly-D-Lysine (PDL) arbeidsløsning (1x) ved å fortynne 10x lager (5 mg / ml) i sterilt vann.
    5. Påfør 100 μL 0,5 mg/ml PDL i midten av hver dekslelip og unngå spredning av oppløsningen til kantene.
    6. Inkuber PDL på deksler i 20-30 min ved romtemperatur (RT). Pass på at PDL ikke tørker ut.
    7. Vask PDL med 0,5 ml sterilt vann tre ganger. La platene tørke helt.
    8. Forbered laminin arbeidsløsning (1x) ved å fortynne 50x lager (1 mg / ml) i 1x PBS.
    9. Påfør 100 μL 20 μg/ml laminin i PBS i midten av hver dekslelip og unngå spredning av løsning til kantene.
    10. Inkuber platene ved 37 °C i en fuktet inkubator i 2-6 timer. Unngå tørking av lamininoppløsningen.
  2. Embryo disseksjon og plating RGCs
    1. Forbered og merk fire 35 mm vevskulturretter og fyll med 4 ml: 70% etanol, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" på disseksjonsdagen. Oppbevar oppvasken i kjøleskapet til disseksjoner.
    2. Når sebrafiskembryoer er 34 timer etter befruktning (hpf), ta kulturrettene belagt med laminin ut av inkubatoren og vask dekslene tre ganger med 0,5 ml 1x PBS.
    3. Etter den endelige vasken, tilsett 4 ml ZFCM(+) medier til hver kulturrett og unngå å tørke platen.
    4. Hent de tilberedte kulturrettene fra trinn 3.2.1. La dem likevekte til RT.
    5. Fyll 4-6 PCR-rør med 15 μL ZFCM(+)-medier. Ett rør er nødvendig for å forberede RGCer fra 4 øyne som skal belagt på ett deksle.
    6. Hent sebrafiskembryoer fra inkubatoren og senk embryoer i 35 mm vevskulturfat som inneholder 70% etanol i 5-10 s for å sterilisere.
    7. Bruk en overføringspipette og overfør embryoer til E2 Media 1-tallerken som inneholder sterile E2-medier for å vaske overflødig etanol.
    8. Overfør embryoer til E2 Media 2 parabolen og fjern sine chorions med skarpe tang.
    9. Overfør embryoer til endelig E2 Media 3-tallerken for å utføre disseksjoner.
    10. Bruk et par fine tang, disseker ut netthinnene som tidligere beskrevet 22.
    11. Plasser og hold embryoer fremre til eggeplommen med en av tangene og fjern haleplakaten til eggeplommesekken med de andre tangene.
    12. Ta tak i nakken med tang og ta av hodet for å eksponere hjerne og øyne for E2-mediene. Unngå å kutte eggeplommesekken.
    13. Med spissen av fine tang ruller du forsiktig øynene av fra hodet, mens du holder kranialvevet nede med de andre tangene. Hold øynene isolert fra tilstøtende vevsrester.
    14. Overfør fire øyne til et av de tidligere forberedte rørene som inneholder ZFCM (+).
    15. Titre forsiktig opp og ned med P20 pipetten og en gul spiss ca 45 ganger for å fjerne celler. Unngå luftbobler.
    16. Overfør ZFCM(+) med dissosierte celler til midten av dekslet. Gjenta trinn 10-12 for ekstra deksler.
    17. Oppretthold kulturer på benken ved 22 °C på et polystyrenskumstativ for å absorbere vibrasjoner.
    18. Utfør bildebehandling 6-24 timer etter plating.
      MERK: Bruk overføringspipetten til å omfordele embryoer til forskjellige kulturretter. Bytt pipetten for hver løsning for å unngå å bære over etanol (trinn 6-8).

4. In vitro ROS-avbildning av kultiverte RGC-nevroner

  1. På dagen for avbildning (vanligvis 6-24 timer etter cellebelegg), kontroller celler under mikroskop for å validere vekst av RGC-axoner.
  2. For levende cellebilder, overfør coverlips fra kulturrett til et levende celleavbildningskammer. I dette tilfellet ble et skreddersydd åpent kammer, som tidligere er beskrevet, brukt23.
  3. Sett opp mikroskop for avbildning. Bruk et invertert mikroskop utstyrt med en differensial interferenskontrastmål (DIC), OG590 langpassert rødt filter og et EM-CCD-kamera.
  4. Før du ser på bildet, må du erstatte ZFCM(+)-mediet med ZFCM(-).
  5. Når cellene er plassert med 10x mål, skaffe bilder ved 60x forstørrelse ved hjelp av en høy NA olje nedsenking mål. Bruk en ekstra forstørrelse på 1,5x.
  6. Først må du skaffe DIC-bilder. Deretter bruker bilde roGFP2-Orp1 et passende filtersett. Excite roGFP2-Orp1 med 405/20 og 480/30 nm eksitasjonsfiltre sekvensielt og skaffe bilder med 535/30 nm utslippsfilter etter at utslippslyset har passert det dikroiske speilet 505DCXR.
  7. Etter å ha tatt det første settet med bilder, utveksle medier med medier som inneholder forskjellige behandlingsløsninger. Media bør endres hvert 30.

5. In vivo ROS-avbildning av utviklende embryoer

  1. For in vivo-avbildning, hold embryoer i E3-medier som inneholder 0,003% Fenylthiourea (PTU) uten metylenblå fra 22-24 hkf. Utveksle medier og fjerne døde embryoer på daglig basis.
  2. I ønsket alder bedøver du embryoer i 0,016% trikain. Monter bedøvede embryoer i 1% lavsmeltende agarose på 35 mm glassbunnskulturretter. Embryoer kan orienteres dorsalt, ventrally eller lateralt, avhengig av interesseområdet for avbildning.
  3. Etter agarose størkner, fyll oppvasken med E3-medier uten metylenblå/0,016% trikain.
  4. Sett opp mikroskopet for avbildning. Bruk et omvendt laserskanningskroskop. Alternativt kan du bruke et oppreist konfokalt mikroskop utstyrt med en vanninnlevelseslinse for å bilde embryoer montert på toppen av en agarose dråpe.
  5. Excite roGFP2-Orp1 med 405 nm og 488 nm eksitasjonsfiltre sekvensielt og skaffe tilsvarende bilder med utslippsfiltre i området 515-535 nm.
  6. Skaff z-stabler med 5 μm seksjonstykkelse gjennom ønsket del av embryoene. Embryoer kan holdes for avbildning på senere stadier av utviklingen.
  7. Etter avbildning, fjern embryoer fra agarose med fine tang og hold i inkubatoren til ønsket alder i metylenblåfrie medier med PTU.

6. Bildeanalyse og prosessering

  1. Måling av H2O2-nivåer basert på 405/480-forholdsverdier
    1. Bruk en passende programvare for bildeanalyse. ImageJ programvare ble brukt her for bildeanalyse og behandling.
    2. Åpne DIC-, 405/535- og 480/535-bilder i ImageJ-programvare ved å dra filene eller klikke fil | Åpne. Hvis det ikke allerede er gjort, konverterer du bilder til 32-biters ved å klikke Bilde | Skriv inn | 32-biters.
    3. Definer interesseområde (ROI) med gratis håndverktøy fra kontrollinjen (cellekropp, vekstkjegle, netthinne, etc.). Åpne avkastningen ved å klikke Analyser | Verktøy | ROI Manager. Klikk Legg til i kategorien ROI-behandling for å legge til den definerte avkastningen.
    4. Tegn et område nær avkastning og legg til som bakgrunns-AVKASTNING. Mål gjennomsnittlige bakgrunnsverdier ved å velge avkastningen og klikke på Mål fra roi manager-fanen.
    5. Legg merke til gjennomsnittsintensitetsverdiene fra målingen. Trekk verdien av gjennomsnittlig bakgrunn fra de fluorescerende bildene ved å klikke på Behandle | Matte | Trekk fra. Utfør dette trinnet for både 405/535- og 480/535-bilder.
    6. Legg til verdien "1" til 480/535 fluorescerende bilde for å eliminere "0"-verdier ved å klikke behandle | Matte | Legg til funksjon før beregning av forhold.
    7. Klikk Behandle | Bildekalkulator | Del funksjon i ImageJ for å dele 405/535-bilde med 480/535 bildepiksel for piksel. Velg 405/535-bilde som skal deles på 480/535-bilde. Velg et 32-biters utdatabilde.
    8. Bruk avkastning på forholdsbilde ved først å klikke på forholdsbildet og deretter avkastningen i kategorien ROI-behandling.
    9. Mål gjennomsnittsverdier for 405/535-bilde til 480/535-bilde ved å klikke Mål i kategorien AVKASTNINGSbehandling.
    10. Utfør trinn 6.1.2-6.1.9 for så mange utvalg som mulig for å utføre riktig statistisk analyse.
  2. Bilde av visningsforhold
    MERK: Denne prosedyren er å trekke fra bakgrunnen utenfor prøven og bruke en fargeoppmerkelsestabell på bildet.
    1. Når forholdsbildet er opprettet i ImageJ i trinn 6.1.7., oppretter du et 32-biters svart bilde ved å klikke Fil | Nytt | Bilde.
    2. Bruk avkastningen du vil vise H 2 O2-nivåenefor, på det nye bildet ved først å klikke på det nye bildet og deretter avkastningen fra roi manager-fanen.
    3. Opprett en maske ved å klikke Rediger | Merket område | Opprett maske.
    4. Del maskebildet med 255 for å justere avkastningen til "1", og bakgrunnsverdiene blir "0". Klikk Behandle | Matte | Del og skriv inn 255.
    5. Multipliser maske med forholdet ved å klikke Behandle | Bildekalkulator | Multipliser funksjon. Dette vil resultere i et bilde med gråtoneforhold som bare viser avkastningen.
    6. Endre slå opp tabellen til "Brann" ved å klikke på Bilde | Slå opp tabeller | Brann.
      MERK: En multiplikasjonsfaktor kan brukes på alle bilder for bedre visualisering av forholdet ved å klikke på Behandle | Bilde | Multipliser.
    7. Konverter forholdet mellom bildet og 8-biters ved å klikke Bilde | Skriv inn | 8-biters.
    8. Legg til kalibreringslinje ved å klikke Analyser | Verktøy | Kalibreringslinje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dyrkede sebrafisk RGCer utvider aksoner innen 1d. Et representativt 405/480-forholdsbilde av H2O2-biosensoren vises i figur 4A. Cellelegemet, axon og vekstkjegler er tydelig synlige i individuelle nevroner. Disse nevronene kan bli utsatt for forskjellige behandlinger over tid for å overvåke H2O2 endringer. Vi har tidligere funnet ut at å legge til 100 μM H2O2 i kulturmedier øker forholdsverdiene, og viser at sanntidsendringer kan oppdages med dette systemet (Figur 4)24.

Figure 4
Figur 4: H2O2 avbildning i kultiverte sebrafisk-RGCer med roGFP2-Orp1. (A) Representant 405/480 nm ratio bilder av kultiverte RGC-nevroner fra 34 hk gamle sebrafiskembryoer. Neuron til venstre ble behandlet med serumfritt kontrollmedium og nevron til høyre ble behandlet med 100 μM H2O2 i 30 minutter. Skala bar = 10 μm. (B) Bar grafer som viser gjennomsnittlig H2O2 nivåer i vill type sebrafisk RGC vekst kjegler før og etter behandling med enten kontroll eller 100 μM H2O2. Dataene ble normalisert for å kontrollere behandlingen. Data vises gjennomsnittlig ± SEM. Antall vekstkjegler vises i parentes for hver gruppe. To-tailed Wilcoxon matchet-par signert rangering test; **p = 0,0009. Figuren er endret fra vår forrige publikasjon24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

H2O2 nivåer kan også bestemmes i hele sebrafisk embryoer (Figur 5). Når mRNA injiseres under encellet stadium, uttrykker alle vev roGFP2-Orp1 biosensor. I figur 5Aviser vi hoderegionen av sebrafisk larver på to forskjellige tidspunkter, med fokus på H2O2-nivåene i netthinnen, som et eksempel. Vi har tidligere vist at tillegg av H2O2 øker forholdsverdiene i sanntid, mens tillegg av reduksjonsmiddelet DTT reverserer denne effekten in vivo24. Her målte vi basale nivåer av H2O2 i de samme sebrafiskembryoene ved 2 dpf og 5 dpf. Ved 2 dpf var forholdsverdiene signifikant lavere enn ved 5 dpf (p<0,0001; Figur 5B). Videre viste hvert dyr et annet nivå av økning i deres retinal H2O2 innhold (Figur 5C).

Figure 5
Figur 5: In vivo H2O2 avbildning i sebrafisk larver med roGFP2-Orp1. (A) DIC og 405/480 nm ratio bilder av 2 og 5 dpf sebrafisk larver. Avkastning er definert som netthinne (gule linjer) for å måle forholdsverdier. De samme larver ble analysert ved 2 og 5 dpf. Skalastenger = 50 μm. (B) Måling av gjennomsnittlig H2O2 nivåer i netthinner på 2 og 5 dpf sebrafisk. Ved 5 dpf økes H2O2-nivåenebetydelig i netthinnen sammenlignet med 2 dpf. (C) Linjediagram over målinger av individuell fisk. Hvert dyr viser en økning i H2O2-nivåene i netthinnen fra 2 til 5 dpf. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Antall larver analysert vises i parentes for hver gruppe. To-tailed Wilcoxon matched-pairs signert rangering test, ****p<0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere kritiske trinn som trenger oppmerksomhet gjennom hele denne protokollen. Vi tror at å vurdere disse punktene vil forbedre den eksperimentelle strømmen. For primær RGC-kultur er steriliteten til ZFCM(-) svært viktig, siden dette kulturmediet ikke inneholder antibiotika og forurensning kan oppstå før eller under avbildning. For å unngå det, anbefaler vi å forberede og bruke ZFCM (-) bare inne i et biosikkerhetsskap og lage ferske ZFCM (-) medier regelmessig (trinn 1.5). I tillegg bør lamininlagrene holdes ved -80 °C. Tint laminin bør oppbevares ved 4 °C til enhver tid. Ikke hold lamininløsninger ved romtemperatur eller fryse på nytt, da det reduserer nevrittveksten som fremmer proteinets aktivitet.

Dissekering av sebrafisk netthinne til rett tid er viktig for å gi nok RGCer som utvider aksoner. Zebrafish RGCs er født på 28 HPF og utvide axoner ut av netthinnen starter 32-36 HPF. Derfor er det viktig å plate RGCs etter 28 HPF, helst mellom 32-36 HPF, for å tillate full differensiering av RGCs. Kulturer forberedt på tidligere tidspunkter kan ikke gi nok RGCer eller vil gi RGCer som kanskje ikke forlenger axoner innen 24 timer etter plating. Det anbefales på det sterkeste å endre ZFCM(-)-mediet ved avbildning i mer enn 30 minutter. Siden dette mediet mangler fenolrød, er pH-endringer ikke synlige og må kanskje vurderes. Bytt medier veldig nøye for å unngå å løsne nevroner under prosessen (trinn 4.7).

Til slutt er det nødvendig å endre mediet til E3 med PTU, men uten metylenblått med 24 hkf. PTU forhindrer pigmentering for forbedret larvgjennomsiktighet som kreves for in vivo fluorescensavbildning; Tidligere behandling med PTU kan imidlertid forårsake utviklingsfeil26. Metylenblå fjernes fra E3-medier for å redusere autofluorescens, hovedsakelig fra eggeplommen (trinn 5.1).

Denne metoden tillater cytoplasmic deteksjon av H2O2. Subcellulær oppdeling av H2O2 bidrar imidlertid til lokal signalisering, og cytoplasmatisk H2O2-nivåer gir kanskje ikke tilstrekkelig informasjon om spesifikke signalroller i H2O2. Siden roGFP2-Orp1 er en genetisk kodet biosensor, kan den målrettes mot vevsspesifikt uttrykk (f.eks. nevroner, astrocytter, glialceller osv.) eller spesifikke subcellulære steder (f.eks. plasmamembran, mitokondrier, kjerne, etc.). Siden roGFP2-Orp1 er en GFP-basert biosensor, er kombinasjonen med andre fluorescerende sonder begrenset til utslippsbølgelengder utenfor det grønne spekteret. Siden GFP er mye brukt som transgenesemarkør, kan utnyttelsen av GFP-baserte biosensorer begrenses. For å løse denne utfordringen har rødfluorescerende proteiner for H2O2 -deteksjonblitt utviklet nylig27. Videre er roGFP2-Orp1 midlertidig uttrykt i metoden som presenteres her. Derfor vil mRNA og proteinuttrykket forfalle over tid. Vi var fortsatt i stand til å oppdage signalet i 5 dpf larver; Imidlertid må transgene fiskelinjer etableres for stabilt uttrykk for biosensoren gjennom utvikling og inn i voksen alder.

Flere fargestoffbaserte analyser er tilgjengelige for å oppdage intracellulær ROS (f.eks. H2DCF-DA), eller spesielt H2O2 (PF6-AM)28,29. Å bruke en genetisk kodet biosensor, for eksempel roGFP2-Orp1, har flere fordeler i forhold til fargestoffbaserte metoder. For det første tillater det deteksjon av både forbigående endringer i oksidativ status på grunn av reversibilitet så vel som på bestemte subcellulære steder. Derfor overvåkes de dynamiske endringene godt med høy grad av romlig oppløsning30. For det andre viser det generelt mindre toksisitet for celler eller vev sammenlignet med fargemolekyler. Til slutt kan biosensoren manipuleres ytterligere genetisk for å møte behovene til spesifikke eksperimenter31. roGFP2-Orp1 er en rasjonmetrisk biosensor, siden den har to eksitasjoner og en utslippstopp. Ved interaksjon medH2O2, 405 nm eksitasjon øker, og 480 nm eksitasjon avtar. Derfor er avlesningen forholdet mellom intensitetsverdiene oppnådd med henholdsvis 405 og 480 nm eksitasjon. Fordi denne sonden er rasjonsmetrisk, blir bruk av en annen sonde unødvendig å korrigere for potensielle volumeffekter. Videre, siden denne sonden bare innebærer uttrykk for ett polypeptid, lider den ikke av potensielle problemer med differensialuttrykk av mer enn ett protein, for eksempel i tilfelle av intermolekylær Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET).

RoGFP2-Orp1 er en allsidig H 2 O2-sondefor å studere ROS-produksjon og signalering. I levende celler viser denne sonden dynamisk område på 4,8 (rundt 4 i transgene sebrafiskembryoer)15,32. Imidlertid er redokstilstanden til roGFP2-Orp1 gjenstand for endringer ved endogene tioredoxin- og glutaredoxinsystemer; Derfor ble mer følsomme sonder utviklet ved å erstatte Orp1 med et annet gjærperoksytoksin, Tsa233,34. Mens roGFP2-Orp1 er nyttig for å oppdage endringer i H2O2 i sebrafiskembryoer, er følsomheten for det meste begrenset til høyere konsentrasjoner av eksogent påført H2O2 24,31, eller til potente stimuli. For eksempel økte slit2-behandlingen roGFP2-Orp1-signalet i villtype RGCer, men ikke i nox2 mutant RGCer35. På den annen side var det ingen forskjell i basal H2O2 nivåer mellom wildtype og nox2 mutant RGCs og 2 dpf embryoer24,35. Derfor, for å oppdage basale nivåer eller små endringer i H2O2, vil det være behov for høyere følsomhetssonder.

HyPer er en annen mye brukt genetisk kodet og ratiometric H2O2-spesifikk biosensor36. Følsomheten til begge sondene er like; RoGFP2-Orp1 viste imidlertid langsommere respons på H2O2-endringene 15. Derfor kan nøyaktig deteksjon av endringer i sanntid kreve HyPer i stedet for roGFP2-Orp1. Mens innledende HyPer-versjoner påvirkes av pH-endringer, er roGFP2-Orp1 ikke16,36. Derfor er det viktig å inkludere en pH-kontrollsonde (SypHer3s) mens du bruker HyPer37. Den nyeste HyPer-sonden, HyPer7, overvant mange av ulempene ved eksisterende H 2 O2-sonder:HyPer7 har høyere pH-stabilitet, økt lysstyrke, raskere kinetikk og høyere dynamisk område38. Videre er HyPer7 validert både in vitro og in vivo, som viser subcellulær oppdeling og overvåking av sanntid H2O2 endringer i sebrafisk embryoer under sårheling38.

Metodikken som presenteres her kan utvides for å studere rollen som ROS-signalering både in vitro og in vivo. roGFP2-Orp1 som uttrykker nevroner kan bli utsatt for forskjellige behandlinger for å studere effekten på H2O2-signalering. For eksempel viste vi at RGCer reagerer på endringer i H2O2-nivåer i sanntid (figur 4), noe som tyder på at biosensoren kan oppdage umiddelbare endringer i H2O2. Å bestemme absolutt intracellulære H2O2-konsentrasjoner vil imidlertid kreve omfattende kalibrering av systemet. Deteksjonsgrensen for biosensoren er også uklar. I tillegg er den detaljerte romlige fordelingen av biosensoren i cellen ikke helt kjent, noe som kan forstyrre tolkningen av resultatene. Videre kan det å bestemme det nøyaktige stedssignalet fra roGFP2-Orp1 avsløre om det er stedsspesifikk H2O2-produksjon som bidrar til lokalisert intracellulær signalering.

Å lage transgen fisk som uttrykker roGFP2-Orp1 har mange fordeler. Biosensoren kan uttrykkes allestedsnærværende, eller under en vevsspesifikk promotor for å studere cellespesifikk H2O2-signalering ved å bruke Tol2 transgenese i sebrafisk39. Rollen til H2O2 i utvikling kan studeres ved allestedsnærværende uttrykk for biosensoren. For eksempel kan transgene sebrafiskembryoer overvåkes for å vurdere endringer i H2O2-nivåer og hvordan disse endringene bidrar til ulike utviklingsstadier. På den annen side fokuserer vevsspesifikk uttrykk for roGFP2-Orp1 på effekten av H2O2-produksjon i celler eller vev av interesse. Vevs- eller cellespesifikke promotorer kan brukes til å drive uttrykk for roGFP2-Orp1 i bestemte celler. Videre kan Gal4 / UAS-systemet brukes til sparsom merking av individuelle nevroner. Derfor tillater denne tilnærmingen å oppdage H2O2-nivåer med en mobiloppløsning in vivo. Til slutt kan stabile transgene linjer brukes til høygjennomstrømningsscreening av legemidler som involverer ROS-signalering og oksidativt stress i sebrafiskembryoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) og Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships ved Purdue University (Grant 210362). Vi takker Dr. Cory J. Weaver og Haley Roeder for å etablere sebrafisk RGC kulturprotokoll. Vi takker Haley Roeder i tillegg for å ha gitt dataene til figur 4. Vi takker Leah Biasi og Kenny Nguyen for hjelpen med RGC-kulturen. Vi takker Gentry Lee for at han redigerte teksten. Vi takker Dr. Tobias Dick for å ha levert roGFP2-Orp1 og Dr. Qing Deng for pCS2+ vektor som inneholder roGFP2-Orp1. Figur 2 opprettes med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 168 ROS hydrogenperoksid roGFP2-Orp1 biosensor RGC sebrafisk nevronutvikling
ROS Live Cell Imaging under nevronutvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter