Summary
여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
중성 지질 (LL)은 에너지와 지질 항상성에 중요한 역할을하는 소수성, 불책임한 생체 분자의 클래스입니다. LLs는 아세틸-CoA로부터 합성드 노보이며 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 형태로 주로 진핵생물에 존재한다. LL의 합성을 담당하는 효소는 Saccharomyces cerevisiae (효모)에서 인간에게 매우 보존되어 효모는 NL 신진 대사 효소의 기능과 조절을 해부하는 유용한 모델 유기체입니다. 아세틸-CoA가 다양한 NL 종으로 변환되는 방법에 대해 많은 알려져 있지만, NL 대사 효소를 조절하기 위한 메커니즘, 그리고 잘못된 규제가 세포 병리학에 어떻게 기여할 수 있는지에 대해서는 여전히 발견되고 있습니다. NL 종의 고립과 특성화를 위한 수많은 방법은 수십 년 동안 연구를 통해 개발되고 사용되었습니다. 그러나 주요 NL 종의 포괄적인 특성화를 위한 정량적이고 단순한 프로토콜은 논의되지 않았습니다. 여기서, 효모에서 주요 NL 종의 드 노보 합성을 정량화하는 간단하고 적응 가능한 방법이 제시된다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피와 결합 된 14C-아세트산 대사 라벨링을 적용하여 다양한 생리학적으로 중요한 LL을 분리하고 정량화합니다.
Introduction
아세틸-코아는 중성 지질(LL)을 포함한 다양한 생체분자의 기본 구성 블록으로, 멤브레인 을 구축하고 ATP를 생성하며 세포 신호1,2를조절하는 다목적 생체 분자 통화로 작용한다. 이러한 각 경로 중 어느 경로로든 LS를 회피할 수 있는 가용성은 부분적으로 스토리지에 의해 규제됩니다. 지질 방울(LDs), 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 소수성 코어로 구성된 세포질 세포기관은 대부분의 셀룰러 LL의 주요 저장 칸입니다. 이와 같이, LDs 격리 및 조절 LL, 이는 저하 될 수 있으며, 그 후 생화학 및 신진 대사과정에활용3,4. NL 및 LD 관련 단백질의 잘못된 조절은 lipodystrophy 및 대사 증후군5,6을포함하여 병리학의 개시와 상관관계가 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 때문에, 현재 LD 연구는 NL 합성이 공간적으로, 현세적으로, 그리고 다세포 유기체의 뚜렷한 조직에 걸쳐 어떻게 규제되는지에 집중됩니다. LL에 대한 유비쿼터스 세포 역할로 인해 LL의 합성 및 조절을 담당하는 많은 효소가 진핵생물7을통해 보존됩니다. 실제로 일부 prokaryotes도 LDS8에L을 저장합니다. 따라서, Saccharomyces cerevisiae (신진 효모)와 같은 유전적 인 기관체는 NL 합성 및 조절의 연구에 유용했습니다.
세포 추출물로부터의 LL의 분리 및 정량화는 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석법(UPLC-MS)9,10,11을포함한 무수한 방법으로 달성될 수 있다. 아마도 LL을 분리하는 가장 간단한 방법은 표준곡선(12,13)에서후속 밀도 정량화를 허용하는 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 통해서일 수 있다. TLC는 L의 코스 그레인 분리만 제공하지만 저렴하기 때문에 강력한 기술로 남아 있으며 여러 샘플에서 동시에 L을 신속하게 분리할 수 있습니다. TLC를 통해 LL의 연구에 직면 하는 가장 상당한 과제의 두 가지는: 1) NL 종 및 그들의 중간체의 세포 풍부의 광범위 한 범위, 그리고 2) NL 합성 경로 내에서 지질 중간체의 소수성/소수성의 범위. 따라서, TLC를 통해 NL 종의 정량화는 일반적으로 가장 풍부한 종으로 제한됩니다; 그러나, 14C-아세트산 방사성 라벨의 도입은 NL 경로 내에서 낮은 풍부 중간체의 검출을 크게 향상시킬 수 있습니다. 아세트산은 아세틸-코아 시냅스 ACS214에의해 아세틸-코아로 빠르게 변환되어, 이는 14C-아세트산을 효모15에서적합한 방사성 라벨기질로 만든다. 또한, 다수의 용매시스템(16)을사용하여 TLC에 의해 소수성 LL 및 LL의 친성 중급자 모두의 분리를 달성할 수 있다. 여기서, 효모에서 14C-아세트산 대사 라벨링을 사용하여 LL의 분리를 위한 방법이 제시된다. 펄스 기간 동안 표지된 지질은 그 후 잘 확립된 총 지질 격리프로토콜(17)에의해 격리되고, 그 다음으로 TLC에 의한 NL 종의 분리가 뒤따릅니다. 라벨이 부착된 지질을 시각화하기 위해 사인 방사선 촬영으로 TLC 플레이트를 개발하고 총 지질을 시각화하는 화학 스프레이를 개발하여 여러 가지 정량화 방법을 허용합니다. 개별 지질 밴드는 또한 면도날을 사용하여 TLC 플레이트에서 쉽게 추출할 수 있으며, 신경화 계수는 밴드 내의 방사성 라벨 재료의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 14C-아세트산을 가진 효모 세포의 성장 및 라벨
- 접시에서 식민지를 수확하고 2 % 덱스트로스를 포함하는 합성 완전 (SC) 매체의 20 mL로 분배하여 효모 문화를 접종 (SC 미디어의 조리법에 대한 보충 파일 참조). 200 rpm에서 흔들면서 하룻밤 동안 30 °C에서 배양하십시오.
참고: 성장 상태, 샘플 볼륨 및 치료는 관심의 지질에 따라 다를 것입니다. 전체 실험을 실행하기 전에 최적의 성장 조건과 배양 량을 경험적으로 결정해야 합니다. 이 프로토콜은 고정 된 단계로 성장 하는 효 모 배양의 방사선 라벨링에 대해 논의, 바이오 멤브레인 및 세포 성장 둔화 하는 성장 단계, 그리고 NL 합성은 매우 활성. - 분광광계를 이용하여 야간 배양의 OD600을 측정하고 효모 세포 배양을 2% 덱스트로스를 함유한 신선한 SC 배지50mL에서 0.2의 최종 OD600으로 희석한다. 24 시간 동안 또는 고정 된 단계에 도달 할 때까지 셀을 성장시면 (일반적으로 OD600 측정을 두 배로 하는 셀의 평평한 안감에 의해 정의됩니다).
- 셀을 수집하기 전에 담금질 버퍼를 만듭니다(자세한 내용은 보충 파일 참조). 각 샘플(즉, 각 샘플에 대한 40mL 담금질 버퍼)에 대해 20mL 의 담금질 버퍼를 만들고 두 개의 50mL 원문 튜브로 균등하게 분할합니다. 담금질 버퍼 알리코를 -80°C에 저장하여 향후 사용을 위해 사용합니다.
- 배양이 원하는 OD 또는 성장 단계에 도달하면 10 분 동안 4,100 x g에서 원심분리하여 세포를 수집하십시오. 시료가 원심분리기에 있는 동안, 10 μCi/mL의 최종 농도에서 덱스트로오스가 없는 SC 미디어에[1-14C]아세트산 나트륨 염을 추가하여 방사성 라벨링 미디어를 준비한다.
주의: 방사성 물질로 작업할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 방사성 물질의 적절한 저장, 사용 및 폐기에 대한 현지 지침을 항상 따르십시오.
참고: 라벨링 매체의 14C-아세트산 농도와 방사성 라벨링 인큐베이션 시간은 모두 관심의 대사산물(들)에 따라 조정되어야 한다. 여기서, 20 분 방사성 라벨 펄스 배큐브가 사용되며, 이는 풍부한 범위의 NL 종을 표시하기에 충분하다. - 펠릿 세포에서 상체를 제거하고, 피펫으로 펠릿을 다시 분리하여 덱스트로스없는 SC 매체의 20 mL로 한 번 셀 펠릿을 세척합니다. 5 분 동안 4,100 x g에서 원심 분리하여 세포를 다시 수집합니다.
- 덱스트로스가 없는 SC 매체의 1mL에서 세포를 다시 중단하고, 표지된 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 세포를 이송한다. 2 분 동안 4,100 x g에서 원심 분리하여 세포를 다시 수집합니다.
- 덱스트로스 없는 SC 매체의 500 μL에서 다시 한 번 세포를 다시 중단합니다. -10°C 또는 최저 온도 설정에 50mL 원심관을 장착한 원심분리기를 미리 식힙니다.
- 각 500 μL의 세포 현탁액(최종 14C-아세트산 농도 = 5 μCi/mL)에 500 μL의 방사성 라벨링 미디어를 빠르게 추가하여 방사성 라벨링 기간을 시작합니다. 라벨링 기간이 끝나기 전에 30°C에서 30°C에서 2분 동안 회전 인큐베이터에서 튜브를 배양하고- 80°C 냉동고에서 얼음 양동이로 각 샘플에 대해 담금질 버퍼의 20mL 알리쿼트 1개를 전송합니다.
- 무선 라벨링 기간이 끝나면 파이펫을 사용하여 전체 1mL 샘플을 20mL의 냉담금 버퍼로 떨어지도록 합니다. 5-10 s의 원식 튜브를 소용돌이치면 샘플이 담금질 버퍼와 철저히 혼합되었는지 확인합니다. 얼음에 2 분 동안 담금질 버퍼에 샘플을 배양.
- -10°C로 설정하거나 최저 온도 설정에서 3분 동안 5,000 x g에서 원심분리기에서 회전하여 셀 펠릿을 수집합니다. 샘플 튜브가 회전하는 동안 - 80°C 냉동고에서 얼음으로 채워진 양동이로 다른 담금질 버퍼 알리쿼트 세트를 전송합니다(즉, 샘플 당 담금질 버퍼 의 20mL 튜브).
- 담금질 버퍼 상체를 셀 펠릿에서 제거하고 20mL 신선하고 차갑고 담금질 버퍼로 교체하십시오. 소용돌이와 펠릿이 원물 관의 바닥에서 빠져나와 담금질 버퍼에서 완전히 재장식 될 때까지 샘플을 흔들어 주세요. 샘플을 -10°C에서 3분 동안 5,000 x g에서 다시 원심분리하여 세포를 수집합니다.
- 세포가 펠릿화되면, 상류체를 부어 파이펫으로 과잉을 제거하여 샘플에서 모든 담금질 버퍼를 철저히 제거합니다. 추가 처리를 위해 -80 °C에 튜브를 저장합니다.
2. 효모에서 총 지질의 격리
참고: 지질 차단을 위한 다음 프로토콜은 대부분의 중성 지질종(17,18)을효율적으로 추출하는 잘 확립되고 자주 사용되는 방법을 기반으로 합니다.
주의: 유기 용매를 사용할 때는 항상 적절한 PPE를 착용하고 가능하면 연기 후드 내부에서 작업하십시오. 지질 추출 하는 동안, 유기 용매와 호환 되지 않는 플라스틱을 사용 하지 마십시오. 폴리 프로필렌 튜브는 다음 프로토콜에 적합합니다.
- 각 샘플에 대해 산세척 유리 구슬 의 무게0.3 g의 무게와 얼음에 2 mL 미세 원심 분리 튜브에 저장합니다. -80°C 냉동고에서 셀 펠릿을 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 각 샘플에 350 μL 메탄올과 700 μL 클로로폼을 추가하고, 재주중단하고, 미리 계량된 유리 구슬이 들어 있는 미세원심분리기 튜브로 이송합니다.
- 1 분 동안 소용돌이 3 x에 튜브를 교반하여 세포를 lyse, 동요 사이의 얼음에 30 s 배양. 대안적으로, 세포는 3개의 1분 주기에 대한 미니 비드 비터를 사용하여 용해될 수 있다. 25-30 μL의 전체 셀 용재를 별도의 튜브에 저장하여 반짝이는 계수를 계산하십시오.
참고: 저장된 lysate는 펄스 기간 동안 각 샘플에서 차지하는 방사성 동위 원소의 상대적 양을 결정하는 데 사용되며, 이는 TLC 플레이트에 로드된 각 샘플의 양에 영향을 미칩니다. 이는 3.2단계에서 더 논의됩니다. - 2mL 마이크로센심분리기 튜브의 전체 내용을 15mL 유리 원심분리기 튜브 [Tube A]에 붓습니다. 메탄올 1mL를 추가하고 10-15s의 소용돌이를 추가하여 2mL 마이크로센트심분리기 튜브를 세척합니다. 1mL 메탄올 세척을 튜브 A로 옮기고 튜브 A에 2mL의 클로로폼을 추가하고 4.45mL의 최종 시료 부피를 위해 400 μL의 물을 튜브 A에 넣습니다.
- 1 분 동안 소용돌이 샘플은 1,000 x g에서 5 분 원심 분리가 뒤따릅니다. 원심분리 후 수성(위) 및 유기(하부) 위상은 인터페이스에 누워 있는 세포 파편과 시각적으로 명확하게 분리되어야 한다.
- 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 튜브 A에서 유기 상을 수집하고 새로운 15 mL 유리 원심 분리기 튜브 (튜브 B)로 이동합니다. 튜브 B에 1M KCl의 1mL를 추가합니다. 튜브 A에, 메탄올 1mL및 클로로폼 2mL, 200 μL MiliQ 물을 추가합니다. 튜브 A에서 소용돌이 및 원심 분리 단계를 반복합니다.
- 다시 한번 튜브 A에서 유기 상을 수집하고 튜브 B. 적절한 용기에 튜브 A의 처분에 추가합니다. 1 분 동안 소용돌이 튜브 B는 1,000 x g에서 5 분 원심 분리가 뒤따릅니다.
- 튜브 B에서 상부 수성 층을 제거하고 폐기합니다. 1mL의 신선한 1M KCl을 튜브 B에 다시 넣고 소용돌이/원심분리 단계를 반복합니다. 층이 분리되면 전체 하단 유기 층을 표지된 4mL 유리 유리 바이알로 조심스럽게 수집합니다.
참고: 이 단계에서 지질 추출물은 -80°C로 저장될 수 있거나, 또는 규의 TLC 분리를 위해 프로토콜을 계속할 수 있다.
3. 얇은 층 크로마토그래피에 의한 방사성 동위원소 표지 형 LL의 분리 및 정량화
- 지질 추출물을 -80°C에 배치한 경우 얼음을 배양하고 이후에 벤치탑에 배양하여 서서히 실온으로 가져옵니다. 진공 건조 또는 불활성 가스의 부드러운 스트림 (예 : 아르곤 또는 질소)의 부드러운 스트림을 사용하여 지질 추출물에서 용매를 완전히 증발시다. 한편, TLC 플레이트를 가열하기 위해 오븐을 145°C로 예열합니다.
- 샘플을 TLC 플레이트에 로드하기 전에 세포에 의해 채택된 상대적인 양의 방사성 라벨을 결정합니다. 전체 셀의 파이펫 10 μL은 2.2단계에서 6mL 유리 신자극 바이알로 lysate, 6mL의 신자극액을 추가하고 선반에 바이알을 배치합니다. 신경화 카운터를 사용하여 1분 계산 시간으로 설정된 카운트 싱글 랙 옵션을 사용하여 각 샘플의 cpm 또는 dpm을 측정합니다. 각 전체 셀 용액을 복제하여 각 샘플에 대한 평균을 얻습니다. 야생 유형 또는 참조 샘플에 따라 적재량 조정
참고: TLC 플레이트에 로드할 각 샘플의 양은 다음과 같은 방정식(평균 샘플 수)/(평균 참조 수) x 원하는 적재 량을 사용하여 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 기준 샘플의 20 μL이 TLC 플레이트에 로드되고 평균 수가 1,000인 경우 평균 수 2,000개에 대한 실험 샘플은 TLC 플레이트에 10μL을 로드합니다. - 1:1 (v/v%) 클로로폼:메탄올의 40-50 μL에서 시료 지질을 재구성하여 5분 동안 소용돌이를 가한다. 유리 졸업 실린더에서 이동상 용매의 101mL를 준비하십시오(50:40:10:1 (v/v/v/ v%) 헥산:석유 에테르:Diethyl ether:Diethyl ether:Acetic acid 용매에 의해 주요 NL 종 분리의 예를 위한 대표 결과 섹션을 참조하십시오.
- 용매를 20 x 20 TLC 채도 패드와 꽉 끼는 뚜껑이 들어 있는 유리 TLC 챔버에 붓습니다. 연필을 사용하여 접시 바닥 1.5cm 의 라인을 부드럽게 표시하여 채널20 x 20 실리카 젤 60 G 플레이트를 준비합니다. 선은 기원과 지질이 로드되는 위치를 지정합니다. 선 아래에는 각 차선에 로드될 샘플에 부드럽게 레이블을 지정합니다. TLC 플레이트가 준비되면 플레이트를 145°C 오븐에 145°C 오븐에 배양하여 플레이트를 예열하고 과도한 수분을 제거합니다.
- 플레이트가 충분히 가열되고 TLC 포화 패드가 용매로 포화되면 오븐에서 TLC 플레이트를 제거하고 즉시 TLC 플레이트를 적재합니다. 플레이트를 따뜻하게 하면서 적재하면 빠른 용매 증발이 보장됩니다. 관심있는 각 지질 종에 대해, 분리 및 예상 이동 거리를 추적하기 위해 TLC 플레이트의 차선에 정제 된 지질 표준의 5-20 μg를로드합니다. 파이펫을 사용하여 TLC 플레이트 의 하단 1.5cm 에 위치한 각 차선의 원점까지 5μL의 샘플을 발견하십시오. 샘플의 20-40 μL이 각 차선에 로드 될 때까지 5 μL 반점의 반복 적재.
참고: 라벨이 부착되지 않은 정제지질의 5-20 μg는 각 시료 차선에 지질의 TLC 분리 후 염색및 시각화할 수 있는 트레이서로 첨가할 수 있습니다. 스테인드 스탠다드의 존재는 후속 신경 세이를 위해 방사성 표지지질 밴드의 쉽게 추적 및 절제할 수 있게 해줍니다. 플레이트에 적재되는 정제 기준은 NL 종의 관심에 의해 결정됩니다. 올레산(FFA), 1,2디올리틸-글리세롤(DG), 트리레인(TG), 콜레스테롤(철), 콜스테릴 리놀레아테(SE), 스쿼렌을 시료 차선에 인접한 차선에서 분리하는 예를 들어 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오. - 표준 및 실험 샘플이 적재되면 플레이트를 개발 챔버에 놓고 용매가 플레이트 의 상단에 도달 할 때까지 기다립니다 (40-60 분). 플레이트가 완전히 개발되면 챔버에서 제거하고 연기 후드에서 20 분 동안 건조할 수 있습니다.
- 접시가 말린 후 플라스틱 필름으로 덮고 사인 라디오 그래피 스크린이있는 개발 카세트에 놓습니다. 플레이트가 24-48h의 화면으로 개발할 수 있도록 합니다.
4. TLC 분리 지질의 시각화 및 정량화
- 개발 중인 카세트에서 화면을 제거하고 인광선 이미지기 내부에 배치합니다. 인광 화상 진찰 옵션을 선택하고 800-1000 V에서 개발하십시오.
참고: 인광 화상 진찰은 TLC 플레이트에 방사성 표지된 지질의 질적 보기를 제공합니다. 그러나, 방사성 표지지질의 정량화는 신자극 계산에 의해 가장 잘 달성되고, 이는 이후에 설명된다. - p-아니살데히드 시약 100mL를 혼합하고(보충 파일참조) 유리 스프레이 병에 보관하십시오. 실리카가 포화 될 때까지 p-anisaldehyde 시약으로 TLC 플레이트를 스프레이하십시오. 접시를 145°C 오븐에서 5분간 굽거나 밴드가 나타나기 전까지는 굽습니다.
- 방사성 라벨 신경수 계수를 사용하여 개별 지질 종을 정량화하려면 면도날을 사용하여 유리 TLC 플레이트에서 실리카 젤을 긁어냅니다. 단일 방사성 표지지질 종에 대응하는 각 실리카 젤 밴드를 유리 신자극 바이알로 옮기고 6mL 의 신자극액을 추가한다. 실리카 밴드가 작은 조각으로 감소 될 때까지 소용돌이 적극적으로.
- 대안적으로, 지질은 3절에서 지질 추출 프로토콜을 사용하여 실리카 겔 대역에서 추출될 수 있다. 실리카 젤에서 지질을 추출하면 3.1 단계에서와 같이 용매를 완전히 증발시키고 말린 지질에 6mL 의 신자극액을 추가합니다. 신경병 바이알이 들어 있는 랙을 신경화 카운터에 넣습니다. 단일 랙 카운트 옵션을 선택하고 계산 시간을 바이알당 2분으로 조정합니다. 신경화 카운터의 결과가 인쇄되고 막대 그래프로 시각화할 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서, 우리는 NL 종의 라벨링, 검출 및 정량화가 14C-아세트산 대사 라벨링에 의해 달성될 수 있다는 것을 입증했습니다. 주요 NL 종은 50:40:10:10:1 (v/v/v/v%) 헥산:석유 에테르:Diethyl 에테르:아세트산(그림1A,B)의용매 시스템에서 분리될 수 있다. 인광 화상 진찰은 표지된 자유 지방산 (FFA), 트리아실글리세롤 (TG), diacylglycerol (DG), 콜레스테롤 (철), 및 스쿼렌 (SQ)의 시각화를 허용합니다(그림 1A). SEs는 이 용매의 다른 NL 종과 분리될 수 있지만, 20분 펄스에 따라 자동 라디오그램에서 검출되는 것은 없습니다. 이것은 효모에 있는 성장의 고정단계 도중 느린 SE 합성에 기인할 지도 모릅니다. 또한 정제지질종은 이 방법으로 분리될 수 있으며, 이후 P-아니살데히드 시약(도1B)을사용하여 TLC 플레이트의 분무에 의해 시각화될 수 있음을 입증하였다. NL 종은 이 용매에서 잘 분리되어 있지만, 포스파디들콜린(PC)과 같은 극성종은기원(도 1B)에머물러 있다. 펄스에 따른 방사성라벨 프리 미디어에 추격 기간을 적용함으로써 NL 경로를 통한 상대적 플럭스를 측정할 수있다(도 1C). 10분 추격 끝에 SQ의 주요 풀이 사라지고 총 철이 상승했습니다. 마찬가지로, 추격 기간에 DG의 출현은 FFA 신호의 감소와 관련이 있습니다.
그림 1: 14C-아세트산 방사성 라벨링은 여러 NL 종의 검출을 허용한다. (A)고정단계에서 14C-아세트산으로 표지된 효모 방사성 라벨로부터 분리된 TLC에 의해 분리된 지질의 자동 방사선사진. 명확하게 검출가능한 종은 자유 지방산 (FFA), 트리글리세라이드 (TG), diacylglycerol (DG), 콜레스테롤 (철), 및 squalene (SQ)를 포함한다. 레이블이 지정되지 않은 밴드는 확인되지 않은 NL 종입니다. (B)TLC에 의해 분리되고 p-애니살데히드 염색에 의해 시각화된 정제지질종. 시각화된 종은 스테롤 에스테르(SE) 및 포스파디딜콜린(PC) 이외에 (A)에 언급된 모든 지질을 포함한다. (C)지과의 자동 방사선 사진은 정지 단계에서 14-아세트산으로 펄스된 효모로부터 분리된 TLC에 의해 분리된 후 무선 라벨이 없는 미디어에서 10분 추격 기간이 뒤따랐다. SQ의 실종은 철의 증가에 부응합니다. 추격 기간에 DG의 상승은 FFA 종의 감소를 동반한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일: 버퍼, 미디어 및 솔루션을 위한 레시피입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 효모에서 NL 종의 합성을 정량적으로 모니터링하는 다목적 방사성 라벨링 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 매우 모듈식이므로 3-6 일 이내에 절차를 완료 할 수 있습니다. 또한, TLC 용매시스템(16,19)의간단한 변화와 함께 관심 있는 여러 지질 종을 검출할 수 있도록 하는 지질종과 대사산물을 분리하기 위해 TLC를 사용하는 데 많은문헌이존재한다. 이 프로토콜은 방사성 표지지질의 분리, 검출 및 정량화에 도움이 됩니다. 또한 레이블이 지정되지 않은 미디어의 추적 기간과 결합하여 레이블이 지정되지 않은 LL의 회전율을 감지할 수 있습니다.
HPLC, GC-MS 및 UPLC-MS와 같은 다른 방법은 지질 분리 및 정량화의 더 높은 해상도를 제공합니다. 그러나, 이것은 안정동위원소를 사용하여 극복될 수 있더라도, MS를 통해 방사성 표지된 견본을 실행하는 것이 일반적으로 최적이 아닙니다. 그럼에도 불구하고,이 무선 라벨 방법은 많은 지질 종에 대한 높은 검출 감도와 다기능성을 제공합니다. MS에 비해이 프로토콜의 또 다른 장점은 경제성입니다. 지질의 TLC 분리는 비교적 간단하고 사치스러운 장비가 필요하지 않으며 일반적인 실험실 재료에 의존합니다. 제한사항에 관해서는: 리소 지질과 같은 특정 저풍종은 14C라벨의 통합후에도 검출할 수 없을 수 있다. 또한, 대부분의 TLC 접근법은 주어진 용매 내에서 지질 종의 과정 곡물 분리로 인해 'lipidomic'특성에 적합하지 않습니다.
효모는 방사성 라벨 생화학적 접근을 통해 지질 연구를위한 편리하고 유전적 인 모델 시스템을 제공합니다. 그러나, 특정 유전 적 배경에서, 또는 특정 신진 대사 성장 조건 동안, 방사성 라벨 아세트산 또는 다른 방사성 라벨의 세포 섭취가 감소 될 수 있음을 주목해야한다. 포도당의 부재에 14C-아세트산을 가진 세포의 라벨링은 강하게 방사성 라벨의 섭취를 증가시킨다. 포도 당의 부재에 긴 잠복은 비례적으로 방사선 라벨 섭취량을 증가시킬 것이다; 그러나, 이것은 또한 문제의 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 특정 성장 조건에 대한 라벨링 효율은 14C-아세트산 방사성 라벨링 프로토콜을 완전히 따르기 전에 확립되어야 한다. 특히, 방사성 라벨링 기간의 길이에 주의를 기울이는다. 라벨링 시간은 관심있는 지질 종을 감지하기 위해 가능한 한 짧게 유지되어야합니다. 전부, 이 절차는 중요한 지질 합성 반응의 연구를 허용하고 그대로 세포에 있는 NL 규정의 조사를 허용해야 합니다.
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Disclosures
저자는이 원고의 준비에 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 이 연구의 완성에 도움이나 개념적 조언을 준 Henne 연구소의 회원들에게 감사를 표하고 싶습니다. W.M.H.는 웰치 재단(I-1873), NIH NIGMS(GM119768), 아라 파레스기 안의학 연구 기금, UT 남서부 인다우먼트 학자 프로그램의 기금으로 지원됩니다. S.R은 T32 프로그램 교부금(5T32GM0008297)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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