Summary

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Published: February 24, 2021
doi:

Summary

هنا، نقدم اختبار الثقافة المشتركة سهلة الاستخدام لتحليل الورم الأرومي الدبقي (GBM) الهجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. قمنا بتطوير ماكرو في برنامج FiJi لسهولة تحديد كمي لهجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية ، ولاحظنا أن الخلايا العصبية تعدل قدرة الخلايا الغازية GBM.

Abstract

الأورام الأرومية الدبقية (GBMs)، الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجة الرابعة، هي واحدة من أكثر أنواع السرطان البشري فتكا بسبب خصائصها العدوانية. على الرغم من التقدم الكبير في علم الوراثة من هذه الأورام، كيف تغزو خلايا GBM بارنشيما الدماغ السليمة ليست مفهومة جيدا. وتجدر الإشارة إلى أنه تبين أن خلايا GBM تغزو الفضاء المحيطي عبر طرق مختلفة؛ المصلحة الرئيسية لهذه الورقة هو الطريق على طول مساحات المادة البيضاء (WMTs). لا تتميز تفاعلات الخلايا السرطانية مع مكونات الخلايا العصبية المحيطة بالورم بشكل جيد. هنا، وقد وصفت طريقة تقيم تأثير الخلايا العصبية على غزو الخلايا GBM. تقدم هذه الورقة ثقافة مشتركة متقدمة في الفحص المختبري الذي يحاكي غزو WMT من خلال تحليل هجرة الخلايا الجذعية الشبيهة ب GBM على الخلايا العصبية. يتم مراقبة سلوك خلايا GBM في وجود الخلايا العصبية باستخدام إجراء تتبع تلقائي مع برامج مفتوحة المصدر والوصول الحر. هذه الطريقة مفيدة للعديد من التطبيقات، على وجه الخصوص، للدراسات الوظيفية والميكانية وكذلك لتحليل آثار العوامل الدوائية التي يمكن أن تمنع هجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية.

Introduction

الأورام الدبقية الخبيثة الأولية، بما في ذلك GBMs، هي أورام مدمرة، مع معدل بقاء متوسط من 12 إلى 15 شهرا لمرضى GBM. يعتمد العلاج الحالي على استئصال كتلة الورم الكبيرة والعلاج الكيميائي إلى جانب العلاج الإشعاعي ، والذي يمدد معدل البقاء على قيد الحياة لبضعة أشهر فقط. ترتبط الإخفاقات العلاجية ارتباطا وثيقا بضعف تسليم الأدوية عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) والنمو الغازي في المساحات المحيطة بالأوعية الدموية ، السحايا ، وعلى طول WMTs1. غزو الأوعية الدموية، وتسمى أيضا الأوعية الدموية الخيار المشترك، هو عملية مدروسة جيدا، والآليات الجزيئية بدأت في توضيح؛ ومع ذلك، فإن عملية غزو خلايا GBM على طول WMTs غير مفهومة جيدا. الخلايا السرطانية تهاجر إلى الدماغ السليم على طول الهياكل الثانوية شيرر2. في الواقع ، منذ ما يقرب من قرن واحد ، وصف هانز يواكيم شيرر الطرق الغازية ل GBM ، والتي يشار إليها الآن باسم الساتيليات البينوروانية ، وداء الشبع المحيطي والأوعية الدموية ، وانتشار تحت الحيوية ، والغزو على طول WMT (الشكل 1A).

بعض chemokines ومستقبلاتها، مثل الخلايا النجمية المستمدة من عامل-1α (SDF1α) وC-X-C عزر مستقبلات chemokine 4 (CXCR4)، ولكن ليس عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)، ويبدو أن متورطة في غزو WMT3. في الآونة الأخيرة ، وقد تبين أن محور NOTCH1-SOX2 عبر الخلايا ليكون مسارا هاما في غزو WMT من خلايا GBM4. وصف المؤلفون كيف تغزو الخلايا الشبيهة بالجذع GBM الدماغ parenchyma على الخلايا العصبية غير الميالينية جزئيا ، مما يشير إلى تدمير أغماد المايلين بواسطة خلايا GBM. تم الوصول إلى علامة فارقة في عام 2019 عندما تم نشر ثلاث مقالات بشكل قاطع في مجلة نيتشر ، مما يؤكد على دور النشاط الكهربائي في تطوير الورم الدبقي5،6. يلقي العمل الجوهري الذي يقوم به Monje والمتعاونون الضوء على الدور المركزي للنشاط الكهربائي في إفراز neuroligin-3 ، والذي يعزز تطور الورم الدبقي.

وصف وينكلر والمتعاونون الاتصالات بين خلايا GBM (microtubes) بأنها حاسمة في الخطوات الغازية ، وفي الآونة الأخيرة ، التفاعلات بين خلايا GBM والخلايا العصبية عبر نقاط الاشتباك العصبي الموصوفة حديثا. هذه الهياكل تفضل التحفيز الجلوتاماترجية لمستقبلات حمض α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسيزولبروبينيويك (AMPA) الموجودة في غشاء الخلية GBM، الذي يعزز تطور الورم والغزو. غزو الخلايا السرطانية هو عملية مركزية في نشر الانبثاث أو البؤر الثانوية البعيدة ، كما لوحظ في مرضى GBM. وقد تم تحديد عدة عوامل لتكون مهمة في غزو GBM مثل thrombospondin-1, بيتا عامل النمو تحويل (البروتين المصفوفي TGFа المنظمة, أو مستقبلات كيموكيني CXCR3)7,8.

هنا ، تم وصف نموذج المحاكاة الحيوية المبسطة لدراسة غزو GBM ، حيث يتم نقش الخلايا العصبية على مسارات صفمين ، ويتم بذر خلايا GBM عليه ، كخلايا واحدة أو كرويدات(الشكل 1B). وتهدف الإعدادات التجريبية اثنين في إعادة رسملة الغزو على الخلايا العصبية, الذي لوحظ في GBM9,10,11. وقد وضعت هذه النماذج في الماضي كما محاذاة المواد الحيوية nanofiber (core-shell electrospinning) التي تسمح لدراسة هجرة الخلايا عن طريق تحوير الخصائص الميكانيكية أو الكيميائية12. يسمح نموذج الثقافة المشتركة الموصوف في هذه المقالة بفهم أفضل لكيفية هروب خلايا GBM على الخلايا العصبية من خلال تحديد مسارات جزيئية جديدة تشارك في هذه العملية.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى (من مستشفى هاوكيلاند، بيرغن، النرويج، وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات المحلية). يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية والحيوانية في جامعة بوردو. تم إيواء الفئران الحامل وعلاجها في منشأة الحيوانات في جامعة بوردو. …

Representative Results

تم إعداد الخلايا العصبية المنقوشة المشاركة في استزراع خلايا GBM الفلورية كما هو موضح في قسم البروتوكول ، وأجريت تجارب التتبع. الخلايا GBM تعديل شكلها بسرعة أثناء الهجرة على الخلايا العصبية (الشكل 1B: لوحة 6 والفيديو 1). هاجرت الخلايا على طول امتدادات الخلايا ا…

Discussion

جليوبلاستوماس غزو واسع النطاق parenchyma باستخدام وسائط مختلفة: الخيار المشترك للأوعية الدموية المحيطة بها, غزو الخلالي, أو الغزو على WMTs18. هذا الوضع الأخير لا يتميز بشكل جيد في الأدب بسبب صعوبة في العثور على نماذج مناسبة في المختبر أو في الجسم الحي المتعلقة بغزو WMT. هنا ، ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ARC 2020 ، Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde) ، ARTC ، خطة السرطان 2021 ، INCA PLBIO. ويدعم Alveole من قبل وكالة الوطنية دي لا ريشرش (غرانت لابيكس الدماغ ANR-10-LABX-43). جوريس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU تولوز).

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane Sigma 440140-100ML The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate Sarstedt 2582624 Used to prepare spheroids
Accutase Gibco A11105-01 Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides Invitrogen C10283 Used to cell counting
Coverslips Marienfeld 111580 Cell culture substrate
Dessicator cartridges Sigma Z363456-6EA Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm² Falcon 10497302
HBSS Sigma H8264-500ML
Heparin sodium Sigma H3149-100KU Stored at 4 °C
Laminin 114956-81-9 Promotes neuronal adhesion
Leonardo software loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software  Molecular Devices LLC NA Microscopy automation software
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin – Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
PLPP Alveole PLPPclassic_1ml Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) Laysan Bio VA-PEG-VA-5000-5g Used as an anti-fouling coating
PRIMO Alveole PRIMO1 Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used for cell counting
Trypsin-EDTA Sigma T4049-100ML Used to detach adherent cells

References

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Play Video

Cite This Article
Guyon, J., Strale, P., Romero-Garmendia, I., Bikfalvi, A., Studer, V., Daubon, T. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (168), e62213, doi:10.3791/62213 (2021).

View Video