Здесь мы представляем простой в использовании анализ кокультуры для анализа миграции глиобластомы (GBM) на паттерновых нейронах. Мы разработали макрос в программном обеспечении FiJi для легкой количественной оценки миграции клеток GBM на нейронах и заметили, что нейроны модифицируют инвазивную емкость клеток GBM.
Глиобластомы (GBM), злокачественные глиомы IV степени, являются одним из самых смертоносных видов рака человека из-за их агрессивных характеристик. Несмотря на значительные успехи в генетике этих опухолей, то, как клетки GBM вторгаются в здоровую паренхиму мозга, не совсем понятно. В частности, было показано, что ячейки GBM вторгаются в перитуморальное пространство различными путями; основной интерес данной статьи представляет маршрут по трактам белого вещества (WMP). Взаимодействие опухолевых клеток с компонентами перитуморальных нервных клеток характеризуется недостаточно хорошо. Здесь описан способ, оцениваемый влияние нейронов на инвазию клеток GBM. В этой статье представлен передовой анализ кокультуры in vitro, который имитирует инвазию WMT путем анализа миграции стволовых клеток GBM на нейронах. Поведение клеток GBM в присутствии нейронов контролируется с помощью автоматизированной процедуры отслеживания с открытым исходным кодом и программным обеспечением свободного доступа. Этот метод полезен для многих применений, в частности, для функциональных и механистических исследований, а также для анализа эффектов фармакологических агентов, которые могут блокировать миграцию клеток GBM на нейроны.
Первичные злокачественные глиомы, включая GBM, являются разрушительными опухолями со средней выживаемостью от 12 до 15 месяцев, зарегистрированной для пациентов с GBM. Современная терапия опирается на резекцию большой опухолевой массы и химиотерапию в сочетании с лучевой терапией, которая только продлевает выживаемость на несколько месяцев. Терапевтические неудачи тесно связаны с плохой доставкой лекарств через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и инвазивным ростом в периваскулярных пространствах, мозговых оболочках и вдоль ВМТ1. Периваскулярная инвазия, также называемая сосудистым коовитацией, является хорошо изученным процессом, и молекулярные механизмы начинают выясняться; однако процесс инвазии клеток GBM вдоль WMT не совсем понятен. Опухолевые клетки мигрируют в здоровый мозг вдоль вторичных структур Шерера2. Действительно, почти столетие назад Ханс-Йоахим Шерер описал инвазивные пути ГБМ, которые теперь называют перинейрональным сателлитозом, периваскулярным сателлитозом, субпиальным распространением и инвазией вдоль WMT(рисунок 1A).
Некоторые хемокины и их рецепторы, такие как стромальный клеточный фактор-1α (SDF1α) и хемокиновый рецептор C-X-C (CXCR4), но не сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), по-видимому, причастны к инвазии WMT3. Совсем недавно было показано, что трансклеточная ось NOTCH1-SOX2 является важным путем при вторжении WMT в клетки GBM4. Авторы описали, как стволовые клетки GBM вторгаются в паренхиму мозга на частично немиелинированных нейронах, предполагая разрушение миелиновых оборок клетками GBM. Веха была достигнута в 2019 году, когда в журнале Nature были опубликованы три статьи, подчеркивающие роль электрической активности в развитии глиомы5,6. Основополагающая работа Монье и его коллег пролила свет на центральную роль электрической активности в секреции нейролигина-3, который способствует развитию глиомы.
Винклер и его коллеги описали связи между клетками GBM (микротрубками), которые имеют решающее значение на инвазивных этапах, а в последнее время взаимодействия между клетками GBM и нейронами через недавно описанные синапсы нейроглиомы. Эти структуры способствуют глутаматергической стимуляции рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA), расположенных на клеточной мембране GBM, что способствует развитию опухоли и инвазии. Инвазия опухолевых клеток является центральным процессом в распространении метастазов или отдаленных вторичных очагов, как это наблюдается у пациентов с ГБМ. Было идентифицировано несколько факторов, имеющих важное значение при инвазии GBM, таких как тромбоспондин-1, трансформирующий фактор роста бета (TGFβ-регулируемый матрицеллюлярный белок или хемокина-рецептор CXCR3)7,8.
Здесь описана упрощенная биомиметическая модель для изучения инвазии GBM, в которой нейроны узорчатся на следах ламинина, а клетки GBM засеиваются на нее, как одиночные клетки или как сфероиды(рисунок 1B). Две экспериментальные установки направлены на повторение инвазии на нейроны, которая наблюдается в GBM9,10,11. Такие модели были разработаны в прошлом в виде выровненных биоматериалов из нановолокна (электроспининг ядра-оболочки), которые позволяют изучать миграцию клеток путем модуляции механических или химических свойств12. Модель кокультуры, описанная в этой статье, позволяет лучше понять, как клетки GBM убегают на нейроны, определяя новые молекулярные пути, участвующие в этом процессе.
Глиобластомы широко вторгаются в паренхиму, используя различные режимы: коопалита окружающих кровеносных сосудов, интерстициальная инвазия или инвазия на WMT18. Этот последний способ не очень хорошо охарактеризован в литературе из-за трудности поиска подходящих моделей …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Альвеол поддерживается Национальным агентством исследований (Грант Лабекс МОЗГ ANR-10-LABX-43). Йорис Гийон является стипендиатом Университетской больницы Тулузы (CHU Toulouse).
(3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |