Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü
Summary
Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.
Abstract
Glioblastomas (GBM), grade IV malign gliomalar, agresif özellikleri nedeniyle en ölümcül insan kanseri türlerinden biridir. Bu tümörlerin genetiğindeki önemli gelişmelere rağmen, GBM hücrelerinin sağlıklı beyin parankimini nasıl istila ettiği iyi anlaşılamamıştır. Özellikle, GBM hücrelerinin peritümoral alanı farklı rotalarla istila ettiği gösterilmiştir; bu makalenin ana ilgisi beyaz madde yolları (WMTs) boyunca rotadır. Tümör hücrelerinin peritumoral sinir hücresi bileşenleri ile etkileşimleri iyi karakterize değildir. Burada nöronların GBM hücre invazyonunun üzerindeki etkisini değerlendiren bir yöntem tanımlanmıştır. Bu makale, GBM kök benzeri hücrelerin nöronlar üzerindeki göçünü analiz ederek WMT invazyonunun taklit edildiği gelişmiş bir ortak kültür in vitro testini sunun. GBM hücrelerinin nöronların varlığındaki davranışları, açık kaynaklı ve serbest erişimli yazılımlarla otomatik bir izleme prosedürü kullanılarak izlenir. Bu yöntem, özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar için birçok uygulamanın yanı sıra GBM hücre göçini engelleyebilen farmakolojik ajanların nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmek için yararlıdır.
Introduction
GBM’ler de dahil olmak üzere primer malign gliomalar yıkıcı tümörlerdir ve GBM hastaları için orta sağkalım oranı 12 ila 15 ay olarak bildirilmiştir. Mevcut tedavi, radyoterapi ile birlikte büyük tümör kitle rezeksiyonu ve kemoterapiye dayanır, bu da sağkalım oranını sadece birkaç ay uzatır. Terapötik başarısızlıklar, kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca zayıf ilaç dağıtımı ve pervasküler alanlarda, menenjitlerde ve WMTs1boyunca invaziv büyüme ile yakından ilgilidir. Vasküler ko-seçenek olarak da adlandırılan pervasküler istila iyi çalışılmış bir süreçtir ve moleküler mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır; ancak, WMTs boyunca GBM hücre istilası süreci iyi anlaşılamamıştır. Tümör hücreleri Scherer’in ikincil yapıları boyunca sağlıklı beyne göç2. Gerçekten de, neredeyse bir yüzyıl önce, Hans-Joachim Scherer, şimdi perineuronal satellitoz, perivasküler satellitoz, subpial spread ve WMT boyunca istila olarak adlandırılan GBM’nin istilacı yollarını tanımladı (Şekil 1A).
Stromal hücre türevi faktör-1α (SDF1α) ve C-X-C motifli kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi bazı kemokinler ve reseptörleri, ancak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) değil, WMT invazyon3’ekarışmış gibi görünmektedir. Daha yakın zamanda, hücrelerarası bir ÇEN1-SOX2 ekseninin, GBM hücrelerinin WMT istilasında önemli bir yol olduğu gösterilmiştir4. Yazarlar, GBM kök benzeri hücrelerin kısmen olgunlaşmamış nöronlarda beyin parenkimini nasıl istila ettiğini anlattılar ve miyelin kılıflarının GBM hücreleri tarafından yok edilmesini önerdiler. 2019 yılında Nature dergisinde üç makalenin güvenli bir şekilde yayınlandığı bir kilometre taşına ulaşıldı ve glioma gelişiminde elektriksel aktivitenin rolünün altını çizdi5,6. Monje ve işbirlikçilerinin ufuk açıcı çalışmaları, glioma gelişimini destekleyen nöroligin-3’ün salgılanmasında elektrik aktivitesinin merkezi rolüne ışık tutuyor.
Winkler ve işbirlikçileri, GBM hücreleri (mikrotüpler) arasındaki bağlantıların invaziv adımlarda ve son zamanlarda yeni tanımlanan nöroglioma sinapsları aracılığıyla GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerde çok önemli olduğunu açıkladılar. Bu yapılar, tümör gelişimini ve istilasını destekleyen GBM hücre zarındaki α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin glutamaterjik stimülasyonunu tercih eder. Tümör hücre invazyonu, GBM hastalarında gözlendiği gibi metastazların veya uzak sekonder odakların yayılmasında merkezi bir süreçtir. Thrombospondin-1, dönüşen büyüme faktörü beta (TGFβ tarafından düzenlenmiş matrisli protein veya kemokin reseptörü CXCR3)7,8gibi GBM invazyonunda önemli olduğu belirlenmiştir.
Burada, nöronların laminin izleri üzerinde desenli olduğu ve GBM hücrelerinin tek hücreli veya küresel olarak tohumlandığı GBM istilasını incelemek için basitleştirilmiş bir biyomimetik model tanımlanmıştır (Şekil 1B). İki deneysel ayar, GBM 9,10,11‘de gözlenen nöronlar üzerindeki istilayı yeniden yakalamayı amaçlamaktadır. Bu tür modeller geçmişte, mekanik veya kimyasal özellikleri modüle ederek hücre göçlerini incelemeye izin veren hizalanmış nanofiber biyomalzemeler (çekirdek kabuk elektrospinning) olarak geliştirilmiştir12. Bu makalede açıklanan ortak kültür modeli, bu süreçte yer alan yeni moleküler yollar tanımlayarak GBM hücrelerinin nöronlar üzerinde nasıl kaçtığını daha iyi anlamanızı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glioblastomas, farklı modlar kullanarak parenkimayı kapsamlı bir şekilde istila eder: WMTs18’dekan damarlarını çevreleyen ortak seçenek, interstisyel istila veya istila . Bu ikinci mod, literatürde WMT istilası ile ilgili uygun in vitro veya in vivo modelleri bulma zorluğu nedeniyle iyi karakterize değildir. Burada, kültürlü kemirgen nöronlarının laminin kaplı yüzeylerde desenli olduğu ve nöronların üzerine floresan GBM kök benzeri hücrelerin tohum edild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO tarafından desteklendi. Alveole, Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43) tarafından desteklenmektedir. Joris Guyon, Toulouse Üniversite Hastanesi’nden (CHU Toulouse) burs alan bir kişidir.
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
