Summary

Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner

Published: February 24, 2021
doi:

Summary

Her præsenterer vi en brugervenlig co-kulturanalyse til at analysere glioblastoma (GBM) migration på mønstrede neuroner. Vi udviklede en makro i FiJi-software for nem kvantificering af GBM-cellemigration på neuroner og observerede, at neuroner ændrer GBM-celle invasiv kapacitet.

Abstract

Glioblastomas (GBMs), grade IV ondartede gliomer, er en af de dødeligste typer af kræft hos mennesker på grund af deres aggressive egenskaber. På trods af betydelige fremskridt i genetik af disse tumorer, hvordan GBM celler invadere den sunde hjerne parenchyma er ikke godt forstået. Især har det vist sig, at GBM-celler invaderer det peritumorale rum via forskellige ruter; hovedinteressen i dette papir er ruten langs hvide stof skrifter (WMTs). Samspillet mellem tumorceller med peritumoralnervecellekomponenterne er ikke godt karakteriseret. Heri er der beskrevet en metode, der evaluerer neuronernes indvirkning på GBM-celleinvasion. Dette papir præsenterer en avanceret co-kultur in vitro assay, der efterligner WMT invasion ved at analysere migration af GBM stamceller på neuroner. GBM-cellers opførsel i nærværelse af neuroner overvåges ved hjælp af en automatiseret sporingsprocedure med open source- og friadgangssoftware. Denne metode er nyttig til mange applikationer, især til funktionelle og mekanistiske undersøgelser samt til analyse af virkningerne af farmakologiske midler, der kan blokere GBM-cellemigration på neuroner.

Introduction

Primære ondartede gliomer, herunder GBMs, er ødelæggende tumorer, med en medium overlevelsesrate på 12 til 15 måneder rapporteret for GBM patienter. Nuværende terapi er afhængig af store tumor masse resektion og kemoterapi kombineret med strålebehandling, som kun udvider overlevelsesraten med få måneder. Terapeutiske fejl er tæt forbundet med dårlig levering af lægemidler på tværs af blod-hjerne barrieren (BBB) og til invasiv vækst i perivascular rum, meninges, og langs WMTs1. Perivascular invasion, også kaldet vaskulær co-option, er en godt studeret proces, og de molekylære mekanismer er begyndt at blive belyst; processen med GBM-celleinvasion langs WMT’er er imidlertid ikke godt forstået. Tumorceller migrere ind i den sunde hjerne langs Scherer sekundære strukturer2. For næsten et århundrede siden beskrev Hans-Joachim Scherer de invasive ruter for GBM, som nu omtales som perineuronal satellitose, perivascular satellitose, subpiel spredning og invasion langs WMT (Figur 1A).

Nogle kemokiner og deres receptorer, såsom stromal celle-afledt faktor-1α (SDF1α) og C-X-C motiv kemokin receptor 4 (CXCR4), men ikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), synes at være impliceret i WMT invasion3. For nylig har en transcellulær NOTCH1-SOX2-akse vist sig at være en vigtig vej i WMT-invasion af GBM-celler4. Forfatterne beskrev, hvordan GBM stamceller invadere hjernen parenchyma på delvist unmyelinated neuroner, hvilket tyder på ødelæggelse af myelin kapper af GBM celler. En milepæl blev nået i 2019, da tre artikler blev foreløbigt offentliggjort i Nature-tidsskriftet, der understreger den elektriske aktivitets rolle i gliomudvikling5,6. Skelsættende arbejde af Monje og samarbejdspartnere kaste lys over den centrale rolle elektrisk aktivitet i udskillelsen af neuroligin-3, som fremmer gliom udvikling.

Winkler og samarbejdspartnere beskrev forbindelser mellem GBM-celler (mikrorør) som afgørende i invasive trin, og på det seneste har interaktioner mellem GBM-celler og neuroner via nyligt beskrevne neurogliomasynapser. Disse strukturer favoriserer glutamatergisk stimulation af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) receptorer placeret på GBM cellemembranen, som fremmer tumor udvikling og invasion. Tumorcelleinvasion er en central proces i udbredelsen af metastaser eller fjerne sekundære foci, som observeret hos GBM-patienter. Flere faktorer er blevet identificeret som vigtige i GBM invasion såsom thrombospondin-1, en transformerende vækstfaktor beta (TGFβ-reguleret matricellulært protein, eller kemokin receptor CXCR3)7,8.

Her er en forenklet biomimetisk model blevet beskrevet for at studere GBM-invasion, hvor neuroner er mønstret på spor af laminin, og GBM-celler er seedet på det, som enkeltceller eller som sfæroider (Figur 1B). De to eksperimentelle indstillinger har til formål at opsummere invasion på neuroner, som observeres i GBM9,10,11. Sådanne modeller er tidligere blevet udviklet som justerede nanofiberbiomaterialer (core-shell elektrospinning), der gør det muligt at studere cellemigration ved at modulere mekaniske eller kemiske egenskaber12. Den co-kulturmodel, der er beskrevet i denne artikel, giver en bedre forståelse af, hvordan GBM-celler undslipper på neuroner ved at definere nye molekylære veje, der er involveret i denne proces.

Protocol

Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle patienter (fra Haukeland Hospital, Bergen, Norge, i henhold til lokale etiske komité regler). Denne protokol følger retningslinjerne fra Bordeaux University human and animal research etiske komitéer. Gravide rotter blev opstaldet og behandlet i dyrefaciliteten på Bordeaux University. Aktiv dødshjælp af en E18-timet gravid rotte blev udført ved hjælp af CO2. Alle dyreforsøg er udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og godk…

Representative Results

Mønstrede neuroner, der var medkulturerede med fluorescerende GBM-celler, blev udarbejdet som beskrevet i protokolafsnittet, og sporingseksperimenter blev udført. GBM-celler ændrede hurtigt deres form, mens de migrerede på neuronerne (Figur 1B: panel 6 og Video 1). Celler migreret langs neuronale udvidelser, i en tilfældig bevægelse (Video 1). Fluorescerende GBM-celler og ikke-fluorescerende neuroner kan let skelnes, og dette gjorde de…

Discussion

Glioblastomas invaderer i vid udstrækning parenchyma ved hjælp af forskellige tilstande: co-option af omkringliggende blodkar, interstitiel invasion eller invasion på WMTs18. Sidstnævnte tilstand er ikke godt karakteriseret i litteraturen på grund af vanskelighederne med at finde egnede in vitro- eller in vivo-modeller relateret til WMT-invasion. Her er der foreslået en forenklet model, hvor dyrkede gnaverneuroner blev mønstret på lamininbelagte overflader, og fluorescere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole er støttet af Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon er modtager af stipendium fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane Sigma 440140-100ML The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate Sarstedt 2582624 Used to prepare spheroids
Accutase Gibco A11105-01 Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides Invitrogen C10283 Used to cell counting
Coverslips Marienfeld 111580 Cell culture substrate
Dessicator cartridges Sigma Z363456-6EA Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm² Falcon 10497302
HBSS Sigma H8264-500ML
Heparin sodium Sigma H3149-100KU Stored at 4 °C
Laminin 114956-81-9 Promotes neuronal adhesion
Leonardo software loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software  Molecular Devices LLC NA Microscopy automation software
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin – Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
PLPP Alveole PLPPclassic_1ml Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) Laysan Bio VA-PEG-VA-5000-5g Used as an anti-fouling coating
PRIMO Alveole PRIMO1 Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used for cell counting
Trypsin-EDTA Sigma T4049-100ML Used to detach adherent cells

References

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Play Video

Cite This Article
Guyon, J., Strale, P., Romero-Garmendia, I., Bikfalvi, A., Studer, V., Daubon, T. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (168), e62213, doi:10.3791/62213 (2021).

View Video