संवहनी परफ्यूजन-फिक्सेशन के साथ मुरीन फेफड़ों की वायु-मुद्रास्फीति
Summary
प्रस्तुत हवा के लिए एक विधि है फेफड़ों के संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ हवा मुद्रास्फीति के लिए है कि वायुमार्ग के भीतर कोशिकाओं के स्थान को बरकरार रखता है, alveoli और संरचना समारोह विश्लेषण के लिए interstitium । लगातार वायुमार्ग दबाव को वायु-मुद्रास्फीति कक्ष के साथ बनाए रखा जाता है जबकि फिक्सेटिव को सही वेंट्रिकल के माध्यम से प्रेरित किया जाता है। फेफड़ों को हिस्टोलॉजिक अध्ययन के लिए संसाधित किया जाता है।
Abstract
फेफड़ों के हिस्टोलॉजी का उपयोग अक्सर फेफड़ों के होमोस्टेसिस और रोग रोगजनकता के दौरान हवाई क्षेत्र की कोशिकाओं द्वारा प्रदान किए गए योगदान की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले इन्स्टिलेशन-आधारित निर्धारण विधियां हवाई क्षेत्र की कोशिकाओं और बलगम को टर्मिनल एयरवेज में विस्थापित कर सकती हैं और ऊतक आकृति विज्ञान को बदल सकती हैं। इसकी तुलना में, संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण तकनीक हवाई क्षेत्रों और म्यूकोसल अस्तर के भीतर कोशिकाओं के स्थान और आकृति विज्ञान को संरक्षित करने में बेहतर हैं। हालांकि, यदि सकारात्मक वायुमार्ग दबाव एक साथ लागू नहीं किया जाता है, तो फेफड़ों के क्षेत्र गिर सकते हैं और केशिकाएं अल्वेलर रिक्त स्थान में उभार सकती हैं, जिससे फेफड़ों की शरीर रचना में विकृति आ सकती है। इसके साथ ही, हम वायु-मुद्रास्फीति के लिए एक सस्ती विधि का वर्णन करते हैं, जो वायुमार्ग और अल्वोलार कोशिकाओं के आकृति विज्ञान और स्थान को संरक्षित करने के लिए संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के दौरान हवा-मुद्रास्फीति के लिए एक सस्ती विधि का वर्णन करता है और डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिक अध्ययनों के लिए मुरीन फेफड़ों में इंटरस्टिटियम। लगातार हवा का दबाव एक सीलबंद, हवा से भरे कक्ष से श्वासनली के माध्यम से फेफड़ों को दिया जाता है जो समायोज्य तरल स्तंभ के माध्यम से दबाव बनाए रखता है जबकि फिक्सेटिव सही वेंट्रिकल के माध्यम से किया जाता है।
Introduction
फेफड़ों की हिस्मोलॉजी स्वास्थ्य और रोग के दौरान फेफड़ों की वास्तुकला का आकलन करने के लिए सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करती है और फेफड़े के शोधकर्ताओं द्वारा सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरणों में से एक है1। इस तकनीक के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक फेफड़ों के ऊतकों का उचित अलगाव और संरक्षण है, क्योंकि इस चरण में परिवर्तनशीलता से ऊतक की गुणवत्ता खराब हो सकती है और गलत परिणाम1,2,3हो सकते हैं। जीवित जानवरों में, फेफड़ों की मात्रा फेफड़ों और बाहरी बलों के आवक लोचदार हटना के बीच संतुलन द्वारा निर्धारित किया जाता है छाती की दीवार और सतह तनाव से डायाफ्राम से प्रेषित । तदनुसार, जब छाती में प्रवेश किया जाता है, तो बाहरी ताकतें खो जाती हैं और फेफड़े गिर जाते हैं। ढह फेफड़ों से तैयार हिस्टोलॉजिक सेक्शन में भीड़-भाड़ वाली उपस्थिति होती है और शारीरिक डिब्बों (यानी, हवाई क्षेत्र, वास्कुलेचर और इंटरस्टिटियम) के बीच सीमाएं अलग करना मुश्किल हो सकता है। इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए शोधकर्ता अक्सर रासायनिक निर्धारण के दौरान फेफड़ों को फुलाते हैं ताकि हवाई क्षेत्र का आकार और वास्तुकला बनाए रखा जा सके ।
फेफड़ों को हवा या तरल के साथ फुलाया जा सकता है। एक ही मात्रा के लिए फेफड़ों को फुलाने के लिए आवश्यक दबाव वायु-तरल इंटरफेस पर अंतरमॉलिकुलर बलों के कारण हवा और तरल मुद्रास्फीति के बीच अलग होता है। सतह के तनाव को दूर करने और ढह गई अल्वियोली4को खोलने के लिए तरल मुद्रास्फीति (उदाहरण के लिए, 12 सीएमएच 2 ओ) की तुलना में वायु-मुद्रास्फीति के दौरान उच्च दबाव (उदाहरण केलिए,25सीएमएच 2 ओ) की आवश्यकता होती है। एक बार अल्वियोली की भर्ती हो जाने के बाद, एक कम दबाव अल्वियोली को दबाव-मात्रा वक्र पठारों के समान मात्रा में खुला रख सकता है, और पास्कलके कानून4,5,6,7, 8के अनुसार पूरे फेफड़ों में दबाव बराबर होजाताहै।
फेफड़ों की मुद्रास्फीति और निर्धारण के दो मुख्य तरीके हिस्टिन फेफड़ों को हिस्त विज्ञान के लिए संरक्षित करने के लिए मौजूद हैं। सबसे अधिक, हवाई क्षेत्र तरल के साथ डाले जाते हैं – अक्सर एक स्थिर होते हैं। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत आसान है और थोड़ा प्रशिक्षण की आवश्यकता है । जबकि सुधारात्मक के इंट्राचेल इन्स्टिलेशन को उन अध्ययनों में प्राथमिकता दी जा सकती है जो वैक्यूलेचर पर ध्यान केंद्रित करते हैं, श्वासनली के माध्यम से डाले जाने वाले तरल समीपस्थ वायुमार्ग कोशिकाओं और म्यूसिन को अधिक डिस्टल हवाई क्षेत्र क्षेत्रों में धकेल देते हैं जबकि वायु मुद्रास्फीति1, 3,4,9,10,11नहीं होती है । इसके अलावा, तरल मुद्रास्फीति के दौरान एपिथेलियम से ल्यूकोसाइट्स की अनजाने टुकड़ी उनकी आकृति विज्ञान को बदल देती है, जो उन्हें एक सरल, गोलाकार उपस्थिति4,10,11,12देती है। अंत में, तरल के साथ फेफड़ोंकी मुद्रास्फीति अनजाने में इंटरस्टिटियम4,10,11संपीड़न कर सकती है। साथ में, ये कारक संरक्षित फेफड़ों के भीतर सामान्य शरीर रचना विज्ञान और सेलुलर वितरण को विकृत कर सकते हैं, इस प्रकार तकनीक को सीमित कर सकते हैं।
ऊतक संरक्षण की एक वैकल्पिक विधि संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण है। इस विधि में, सुधारक वेना कावा या सही वेंट्रिकल के माध्यम से फेफड़े के वास्कुलेचर में व्याप्त है। यह विधि हवाई क्षेत्र ल्यूमेन में कोशिकाओं के स्थान और आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है। हालांकि, जब तक फेफड़ों को परफ्यूजन-निर्धारण के दौरान फुलाया जाता है, तब तक फेफड़ों के ऊतकों के पतन की संभावना होती है।
संवहनी परफ्यूजन-निर्धारण के साथ वायु-मुद्रास्फीति उपरोक्त निर्धारण तकनीकों में से प्रत्येक से ताकत का दोहन करती है। इसके साथ ही हम इस तकनीक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। आवश्यक सामग्री और उपकरण अपेक्षाकृत सस्ती हैं और आसानी से प्राप्त और इकट्ठे किए जा सकते हैं। पूरा सेटअप, चित्रा 1Aमें दिखाया गया है, एक समायोज्य, तरल पदार्थ से भरे कॉलम के माध्यम से फेफड़ों के लिए लगातार वायुमार्ग दबाव प्रदान करता है, जबकि एक परिस्टाल्टिक पंप सही वेंट्रिकल के माध्यम से फिक्सेटिव बचाता है । संरक्षित आकृति विज्ञान वाले फेफड़ों को तब संरचना-कार्य विश्लेषणों के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि आमतौर पर उपयोग किया जाता है, इंट्राचेल-आधारित निर्धारण विधियां वायुमार्ग से ल्यूकोसाइट्स को विस्थापित करती हैं और सामान्य फेफड़ों की वास्तुकला को बदल सकती हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल हार्ट, लंग, और ब्लड इंस्टीट्यूट (एनएचएलबीआई) अनुदान HL140039 और HL130938 द्वारा वित्त पोषित किया गया था । लेखक शैनन हॉट और जाज़ले मैकक्लेंडन को उनकी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
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