Summary
Presentert er en metode for luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering av lungene som bevarer plasseringen av celler i luftveier, alveoler og interstitium for strukturfunksjonsanalyser. Konstant luftveistrykk opprettholdes med et luftinflasjonskammer mens fixative er perfused via høyre ventrikel. Lungene behandles for histologiske studier.
Abstract
Lunge histologi brukes ofte til å undersøke bidragene fra luftromsceller under lunge homeostase og sykdomspatogenese. Imidlertid kan ofte brukte instillasjonsbaserte fikseringsmetoder fortrenge luftromsceller og slim i terminale luftveier og kan endre vevsmorfologi. Til sammenligning er vaskulære perfusjonsfikseringsteknikker overlegen til å bevare plasseringen og morfologien til celler i luftrom og slimhinnen. Men hvis positivt luftveistrykk ikke brukes samtidig, kan lungens regioner kollapse og kapillærer kan bule inn i alveolarrommene, noe som fører til forvrengning av lungeanatomien. Her beskriver vi en billig metode for luftinflasjon under vaskulær perfusjonsfiksering for å bevare morfologien og plasseringen av luftveis- og alveolarceller og interstitium i murin lunger for nedstrøms histologiske studier. Konstant lufttrykk leveres til lungene via luftrøret fra et forseglet, luftfylt kammer som opprettholder trykket via en justerbar væskekolonne mens fikseringsmiddelet perfunderes gjennom høyre ventrikel.
Introduction
Lunge histologi representerer gullstandarden for å vurdere lungearkitektur under helse og sykdom og er et av de mest brukte verktøyene av lungeforskere1. En av de mest kritiske aspektene ved denne teknikken er riktig isolasjon og bevaring av lungevev, siden variasjon i dette trinnet kan føre til dårlig vevskvalitet og feilaktige resultater1,2,3. Hos levende dyr bestemmes lungevolumet av balansen mellom indre elastisk rekyl av lungen og utover krefter overført fra brystveggen og membranen ved overflatespenning. Følgelig, når thoraxen kommer inn, går ytre krefter tapt og lungen kollapser. Histologiske seksjoner tilberedt fra kollapsede lunger har et overfylt utseende og grenser mellom anatomiske rom (dvs. luftrom, vaskulatur og interstitium) kan være vanskelig å skille mellom. For å omgå denne utfordringen blåser forskerne ofte opp lungene under kjemisk fiksering slik at luftromsstørrelsen og arkitekturen opprettholdes.
Lunger kan blåses opp med luft eller væske. Trykket som er nødvendig for å blåse lungene opp til samme volum, varierer mellom luft- og væskeinflasjon på grunn av intermolekylære krefter ved luftvæskegrensesnittet. Høyere trykk (f.eks. 25 cmH2O) kreves under luftinflasjon enn væskeinflasjon (f.eks. 12 cmH2O) for å overvinne overflatespenningen og åpne den kollapsede alveolen4. Når alveoler er rekruttert, kan et lavere trykk holde alveolene åpne til samme volum som trykkvolumkurveplatåene, og trykket utjevnes gjennom hele lungen i henhold til Pascals lov4,5,6,7,8.
To hovedmetoder for lungeinflasjon og fiksering eksisterer for å bevare murin lunger for histologi. Vanligvis er luftområdene innpodet med væske - ofte inneholder et fikseringsmiddel. Den største fordelen med denne tilnærmingen er at den er relativt enkel og krever lite trening. Mens intratrakeal instillasjon av fixative kan foretrekkes i studier som fokuserer på vaskulaturen, har væske som innpodes via luftrøret en tendens til å presse proksimale luftveisceller og muciner inn i mer distale luftromsområder mens luftinflasjonen ikke1,3,4,9,10,11. Videre endrer utilsiktet løsrivelse av leukocytter fra epitelet under flytende inflasjon deres morfologi, og gir dem et enkelt, avrundet utseende4,10,11,12. Til slutt kan inflasjonen av lungene med væske utilsiktet komprimere interstitium4,10,11. Sammen kan disse faktorene forvrenge normal anatomi og cellulære fordelinger i de bevarte lungene, og dermed begrense teknikken.
En alternativ metode for vevsbevaring er vaskulær perfusjonsfiksering. I denne metoden er fikseringsmiddel perfundert i lungevaskulaturen via vena cava eller høyre ventrikel. Denne metoden bevarer plasseringen og morfologien til celler i luftromslumen. Men med mindre lungene er oppblåst under perfusjonsfiksering, vil lungevevet sannsynligvis kollapse.
Luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering utnytter styrker fra hver av de ovennevnte fikseringsteknikkene. Her gir vi en protokoll for denne teknikken. Materialene og utstyret som kreves er relativt billige og kan enkelt oppnås og monteres. Det ferdige oppsettet, vist i figur 1A, gir konstant luftveistrykk til lungene ved hjelp av en justerbar, væskefylt kolonne mens en peristaltisk pumpe leverer fiksering via høyre ventrikel. Lunger med bevart morfologi kan deretter behandles videre for strukturfunksjonsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet i denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i National Jewish Health.
MERK: Protokollen er organisert i tre komponenter. Den første komponenten beskriver byggingen av luftinflasjonen med perfusjons-/fikseringsutstyr. En annen del beskriver hvordan du konfigurerer utstyret for et eksperiment. Den siste delen beskriver hvordan du forbereder dyret og utfører eksperimentet.
1. Konstruksjon av vannsøyleapparatet (Figur 1B)
- Fjern stempelet fra en 60 ml slip tip sprøyte.
- Fest tape rundt sprøyten ved 30 ml-merket. Sett sprøytens høyde på dette merket for det første inflasjonstrykket på 25 cmH2O. Det er også her vannstanden i kolonnen skal være gjennom hele prosedyren. Merk båndet enten som "25 cm" (som vist i figur 1A) eller "inflasjon".
MERK: Et inflasjonstrykk på 25 cmH2O brukes til å sikre rekruttering av sammenrastede luftrom. Når alveoli er rekruttert, senkes trykket til 20 cmH2O for å sikre at luftområdene ikke er distended. - Mål 5 cm fra båndet mot stempelenden og fest et annet stykke tape til sprøyten. Flytt sprøyten ned til dette merket for å senke inflasjonstrykket til 20 cmH2O under fiksering. Merk båndet enten som "20 cm" (som vist i figur 1A) eller "fiksering".
- Fest 180 PVC-slange (polyvinylklorid) til glidespissenden av sprøyten. Lengden på slangen avhenger av avstanden mellom sprøyten og luftinflasjonskammeret (ca. 25-30 cm).
- Plasser en mannlig Luer (2) trådstil tee (1.219 inches lengde, 0.904 inches høyde, 0.0904 inches indre diameter) inn i den andre enden av slangen. Denne mannlige Luer vil koble seg til stoppekranen til luftinflasjonskammeret (trinn 2.4).
2. Bygging av luftinflasjonskammeret (Figur 1C)
- Bor to hull (ca. 4 mm i diameter) i en 500 ml plastbeholder med skruehett. Hullene skal ha samme størrelse som de kvinnelige Luers (1.224 inches lengde, 0.312 inches høyde, 0.098 inches indre diameter).
MERK: Tomme medier eller bufferbeholdere kan brukes til luftinflasjonskammeret. - Frakktråder av kvinnelige Luers med silikonpakningsjern og legg den mindre siden inn i beholderens forborede hull.
- Tilsett silikonpakningsjern rundt de kvinnelige Luers der de kommer inn i beholderen for å sikre en lufttett forsegling.
- Skru på en enveis stoppekran på den nedre kvinnelige Luer på luftinflasjonskammeret.
- Klipp slangen til lengden på omtrent 25 cm og fest mannlige Luers til de frie endene av slangen. Koble den mannlige Luer på den ene enden av slangen til den frie kvinnelige Luer på luftinflasjonskammeret. Den andre mannlige Luer vil koble seg til dyreprosesseringsbeholderen.
3. Bygging av dyreprosesseringsbeholderen (Figur 1D)
- Bor et hull (ca. 4 mm diameter) i siden av en stor plastbeholder. Hullet skal være diameteren til den kvinnelige Luer. Plastbeholderen er nødvendig for å fange overflødig fikseringsløsning.
MERK: En oppbevaringsbeholder på 30 cm x 22 cm, 3,8 L plast ble brukt. - Frakktråder av en kvinnelig Luer med en silikonpakningsmaker og legg den mindre siden inn i beholderens forborede hull.
- Tilsett silikonpakningsjern rundt den kvinnelige Luer der den kommer inn og ut av beholderen for å sikre en lufttett forsegling.
- Skru en enveis stoppekran på den kvinnelige Luer. Rør fra luftinflasjonskammeret vil feste seg til denne stoppekranen.
4. Utarbeidelse av løsninger
- Heparin-løsning
- Fyll en beholder med kalsiumfri PBS og heparin (20 U/ml). Forbered totalt 10 ml heparinløsning for hver mus. Heparin er en antikoagulant som forhindrer blodpropper i å danne seg i karene under perfusjonsfiksering. Heparinoppløsning vil bli brukt til å skylle blod fra lungene før perfusjonsfiksering.
- Fixativ løsning
FORSIKTIG: Fixativer kan utgjøre en helsefare og bør brukes i en kjemisk avtrekkshette. Alle apparater er satt opp i en kjemisk avtrekkshette for å forhindre innånding av fikseringer.- Fyll en beholder med kalsiumfri PBS og paraformaldehyd (4% endelig konsentrasjon). Forbered totalt 50 ml fixative løsning for hver mus.
MERK: Typen fikseringsmiddel som brukes kan variere og vil avhenge av nedstrøms histologiske studier.
- Fyll en beholder med kalsiumfri PBS og paraformaldehyd (4% endelig konsentrasjon). Forbered totalt 50 ml fixative løsning for hver mus.
5. Fremstilling av perfusjonsapparat
MERK: En peristaltisk pumpe foreslås for levering av væsker i vaskulatur for å sikre konstant strømningshastighet. Følgende anvisninger er for å sette opp den peristaltiske pumpen og kan være forskjellig for hver modell. Alternativt, hvis en peristaltisk pumpe ikke er tilgjengelig, kan et annet vannsøyleapparat konstrueres for å parfyme væsker fra en høyde på 35 cm H2O.
- Plasser først slangen rundt rulleenheten.
- Fest slangen i hakkede stolper.
- Lås spakene på plass ved først å plassere venstre spak rundt slangen og feste den på plass med toppen og deretter høyre spak.
- Plasser den proksimale enden av slangen i heparinoppløsningen og den distale enden i dyrebehandlingsbeholderen.
- Før heparinoppløsningen inn i slangen ved å kjøre pumpen for å fjerne luft fra slangen.
- Fest en 25 G x 5/8" nål på enden av venstre side av slangen.
6. Utarbeidelse av luftinflasjonsapparater
- Plasser sprøyten for vannsøylen i en ringholder.
- Mål en vertikal høyde på 25 cm fra dyreplattformen til "25 cm" tapemerket (trinn 1.2) på vannsøylen.
- Fest enden av vannsøylens rør til stoppekranen på luftkammeret.
- Fest et rør fra den kvinnelige Luer av luftkammeret til stoppekranen på dyrebehandlingsbeholderen.
MERK: Hvis luftinflasjonskammeret er konstruert som vist i figur 1C, kan det å feste slangen i omvendt rekkefølge føre til at vann lekker ut i slangen som kobles til trakealkanylen. - Påse at hetten til luftkammeret er tett lukket.
- Påse at stoppekranen på utsiden av dyrebehandlingsbeholderen er lukket og at stoppekranen på slangen som fører fra vannsøylen til luftinflasjonskammeret er åpen.
- Fyll sprøyten med vann til "25 cm" -merket. Vann vil forlate sprøyten gjennom slangen inn i luftkammeret. Når trykket er utjevnet, vil vann slutte å strømme.
- Det er mulig at vann sakte vil lekke ut i luftinflasjonskammeret når omgivelseslufttrykket i den kjemiske hetten svinger. Hold øye med vannstanden i sprøyten og tilsett mer om nødvendig. Oppretthold vannstanden ved "25 cm"-merket gjennom hele prosedyren.
MERK: Vanligvis vil vannstanden holde seg konsistent for første del av luftinflasjonen på 25 cmH2O; men mer vann må sannsynligvis legges til sprøyten under fiksering. Hvis vannet ikke slutter å strømme, er det sannsynlig at det er en luftlekkasje i luftinflasjonskammeret. Mer silikon pakning maker må kanskje påføres rundt Luers for å forhindre luftlekkasjer.
- Det er mulig at vann sakte vil lekke ut i luftinflasjonskammeret når omgivelseslufttrykket i den kjemiske hetten svinger. Hold øye med vannstanden i sprøyten og tilsett mer om nødvendig. Oppretthold vannstanden ved "25 cm"-merket gjennom hele prosedyren.
7. Fremstilling av dyr (Figur 2)
MERK: Denne prosedyren er endret fra Gage et al13. Vi har fullført denne prosedyren på voksne mannlige og kvinnelige mus i forskjellige aldre og noterer ingen alder eller kjønnsbias.
- Avlivet dyret med natrium pentobarbital (150 mg / kg, intraperitoneally.). Forsikre deg om at dyret er dødt før du begynner disseksjonen.
MERK: Mens denne prosedyren utføres på euthanized dyr, kan denne prosedyren utføres på levende dyr for å utnytte hjertet til å pumpe perfusater over hele dyret. - Lag to laterale snitt gjennom bukveggen. Gjør det første snittet under ribbeburet og det andre over hoftene. Klipp langs midtlinjen fra det dårligere snittet mot det overlegne snittet.
- Bruk stump saks, gjør forsiktig et snitt inn i sidesiden av membranen. Lungene skal kollapse så snart membranen er punktert.
MERK: Det må utvises forsiktighet for å unngå punktering av lungene. En punktert lunge er mindre sannsynlig å blåse opp under senere trinn. - Klipp tverrgående langs membranen for å åpne thoraxhulen.
- Klipp overlegent langs brystbenet fra xiphoid-prosessen til jugularet og lateralt over ribbeburet for å eksponere hjertet og lungene fullt ut. Fest ned sidene av ribbeina.
- Lag et midtlinje snitt i nakken over luftrøret. Fjern hud, muskler, skjoldbruskkjertelen og bindevev rundt luftrøret.
- Bruk buede tang, skyv to stykker tråd eller sutur under bakre luftrør. Bruk det ene suturen til å holde luer-stub-adapteren på plass, og bruk den andre til slutt til å binde av luftrøret ved avslutningen av luftinflasjon og vaskulær perfusjonsfiksering.
- Stikk et lite hull i luftrøret med en 18G x 1" nål eller Vannas vårsaks.
- Plasser en 20G Luer-stub adapter i dette hullet i luftrøret.
- Bind en tråd rundt luftrøret umiddelbart distalt til der Luer-stub-adapteren kommer inn for å holde den på plass.
- Overfør dyret til dyrebehandlingsbeholderen.
- Fest Luer-stub-adapteren til den kvinnelige Luer på innsiden av dyrebehandlingsbeholderen.
8. Luftinflasjon, perfusjon og fiksering av lungene (Figur 2)
- Plasser den 25G x 5/8" nålen festet til perfusjonsapparatet som slanger inn i hjertets høyre ventrikel.
- Klipp abdominal aorta for å tillate blod å drenere fra hjertet og for å fremme strømmen av perfusate gjennom lungene.
- Åpne stoppekranen på utsiden av dyrebehandlingsbeholderen for å blåse opp lungene.
MERK: Det kan ta tid før lungene blåses helt opp. Se vannstanden i sprøyten, den bør ikke reduseres raskt med mindre det er en lekkasje i lungene. - Blås opp lungene ved 25 cmH2O i 5 minutter. Inflasjon ved 25 cmH2O forutsetter lungen og hjelper til med å rekruttere atelektatiske lungeregioner.
MERK: En liten mengde vann må kanskje tilsettes sprøyten for å opprettholde 25 cm høyde. Betennelse og/eller eksperimentelt indusert lungeskade kan påvirke lungenes inflasjon. I dette tilfellet kan det være nødvendig å øke inflasjonspresset opp til maksimalt 35 cmH2O for å bidra til å rekruttere atelektatiske regioner. - I løpet av det siste minuttet av lungeinflasjonen, slå på den peristaltiske pumpen til en strømningshastighet på 10 ml / min. Heparinoppløsningen skal strømme fra flasken gjennom slangen inn i dyret.
- Målet med heparininfusjon er å forhindre dannelse av trombe i karene. Fyll derfor heparin til lungene blir hvite og er blottet for blod. Hvis lungene ikke blir hvite, kan justering av høyre ventrikulær nål være nødvendig.
- Etter oppblåsthet i 5 minutter, slå av den peristaltiske pumpen og slå av perfusjonsslangen fra heparinoppløsningen til fikseringsmiddelet.
- Senk vannsøylesprøyten til "20 cm"-merket (trinn 1.3). Det er normalt at luftbobler beveger seg innenfor vannsøylen når trykket endres fra 25 til 20 cmH2O.
- Kontroller vannstanden i sprøyten. Det skal være ved "25 cm" -merket. Det kan være nødvendig å legge til mer nå.
- Vent i 1 min for å la lungene tømmes fra 25 til 20 cmH2O.
- Start perfusjonspumpen på nytt med en strømningshastighet på 6,5 ml/min.
- Vaskulær perfusjonsfiks i 10 - 15 minutter.
9. Ekstraksjon av lunger (Figur 3)
- Bind det andre trådstykket tett rundt luftrøret som er distalt til Luer-stub-adapteren. Fjern Luer-stub-adapteren fra luftrøret.
- Fjern nålen fra hjertet.
- Frigjør lungene og hjertet fra thoracic hulrommet ved å kutte bindevevet bakre til mediastinum med stump saks. Pass på å unngå å punktere lungene.
- Fjern forsiktig hjertet fra lungene.
- Plasser lungene i fikseringsmiddel over natten.
MERK: Varigheten av fixative varierer avhengig av nedstrøms histologiske studier.- Plasser lungene i et 50 ml konisk rør som inneholder 20-25 ml fikseringsmiddel. Plasser tråden som fester luftrøret gjennom åpningen av det koniske røret og fest den ved gjengene på hetten. Snu det koniske røret for å sikre at de oppblåste, luftoppblåste lungene forblir helt nedsenket i fikseringsmiddel, ellers vil de flyte til toppen av væsken.
- Behandle lungene for histologiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en intakt thorax holdes lungene åpne av ytre krefter påført av brystveggen via pleuralrommet6,14. Når membranen legges inn under disseksjonen, avskaffes integriteten til pleuralrommet og lungene skal kollapse (Figur 2A, 2B). For å utvide lungene igjen utføres luftinflasjon. Som et første trinn påføres 25 cm vanntrykk for å sikre rekruttering av kollapsede luftrom. Følgelig, når stoppekranen utenfor dyreholdebeholderen åpnes, vil luft komme inn i lungene via luftrøret, og inflasjonen bør lett observeres (Figur 2C). Når lungene er fullstendig utvidet, reduseres inflasjonstrykket til 20 cm vanntrykk (Figur 2D). 20 cm vanntrykk er valgt fordi det opprettholder fullstendig inflasjon av lungene, men over-distend luftområdene.
Lungene skal forbli oppblåst etter trakeal ligation (Figur 3A) og etter fjerning fra thoraxen (Figur 3B). Deflasjon av lunger (Figur 3C) kan oppstå hvis lungene punkteres under dyreforberedelse eller ekstraksjon. Å legge til fikseringsmiddel på pleuraloverflaten kan bidra til å forsegle mindre lekkasjer under prosedyren; Fixative bør imidlertid påføres forsiktig, da overflødig kan holde lungene til thoracic hulrommet. Eventuelle lekkasjer som ikke er forseglet under fiksering vil føre til kollapsede lunger ved fjerning fra luftinflasjonsapparatene. Deflasjon av lungene kan også oppstå hvis luftrøret ikke er helt bundet av. Når de er nedsenket i fikseringsmiddel, vil riktig oppblåste lunger ha større oppdrift enn oppblåste lunger.
Oppblåste lunger kan deretter behandles for histologiske analyser i henhold til etablerte protokoller1,15. For figur 4ble lungene behandlet for frossen seksjonering og farget med et kommersielt manuelt fargingssystem. Svært få immunceller er til stede i luftveislumenene av vev festet ved hjelp av tradisjonell væskebasert inflasjon (Figur 4A). I motsetning bevares inflammatoriske celler gjennom luftrom i vev festet via vaskulær perfusjon med luftinflasjon (figur 4B).
Figur 1: Montering av apparater. A. Full montering av alle apparater. B. Vannsøylen består av en 60 ml sprøyte koblet til luftinflasjonskammeret via 180 PVC-rør og en toveis hannluer. C. En 500 ml forseglet plastbeholder ble brukt til å konstruere luftinflasjonskammeret. Vannsøylens mannlige Luer kobles til en stoppekran koblet til en kvinnelig Luer innenfor kammerets vegger. En ekstra kvinnelig Luer forbinder rør fra luftinflasjonskammeret til dyrebehandlingsbeholderen. Begge kvinnelige luers er belagt i silikon pakningsmaker for å sikre en lufttett forsegling. To mannlige Luers er koblet til begge ender av rør som forbinder luftinflasjonskammeret til dyreprosesseringsbeholderen. D. Dyr er festet til luftinflasjonskammeret gjennom en 20G Luer stub adapter plassert gjennom et hull i luftrøret. Luer stub-adapteren er koblet til en kvinnelig Luer innenfor veggene i dyrebehandlingsbeholderen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dyreforberedelse, tilknytning til luftinflasjonskammeret og inflasjon av lunger. A. Etter eutanasi blir dyrets bukhinne og thoraxhuler utsatt. Ribbeinburet fjernes eller festes for å tillate utvidelse av lungene ved inflasjon. En Luer stub adapter settes inn i et lite hull kuttet inn i luftrøret og sikret med tråd eller sutur. Luer stub-adapteren er koblet til en kvinnelig Luer i veggen av dyrebehandlingskammeret. Den andre enden av den kvinnelige Luer er festet til en stoppekran for å kontrollere luftstrømmen fra luftinflasjonskammeret (ikke vist). B. Kollapset lungene før luftinflasjonen. C. Lungene er oppblåst til 25 cm vanntrykk for å rekruttere atelektasiske regioner. D. Når trykket endres til det tiltenkte fikseringstrykket (20 cm vann), tømmes lungene litt. Også avbildet er plassering av en 25G x 5/8 nål i høyre ventrikel for vaskulær perfusjon-fiksering av lungen. Alle bilder er fotografier med en oppløsning på 15,9 megapiksler og med et størrelsesforhold på 4:3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ekstraksjon av lunger etter ferdigstillelse av luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering. A. Luftrøret er bundet distalt til Luer stubb adapter og lungene ekstraheres ved å kutte bindevev bakre til mediastinum. B. Luftoppblåste lunger etter vellykket prosessuell gjennomføring. C. Eksempel på dårlig oppblåste lunger som følge av en luftlekkasje som skjedde i luftinflasjonskammeret. Legg merke til at disse lungene er mindre enn de vellykket oppblåste lungene. Alle bilder er fotografier med en oppløsning på 15,9 megapiksler og med et størrelsesforhold på 4:3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av lungevev oppnådd ved intratrakeal-basert fiksering versus luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering. A. Lunger bevart ved intratrakeal-basert fiksering. B. Lunger bevart av luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering. B (innsettt). Piler viser leukocytter i luftveiene i en lunge festet av vaskulær perfusjonsfiksering; stjerner markere leukocytter i alveolene. Til sammenligning er leukocytter merkbart fraværende i luftveiene i lungene festet via intratrakealruten (A-innfelt) og intra-alveolar leukocytter er forskjøvet, ser ut til å være i tett kontakt med epitelceller. Forkortelser: A- luftvei, V- fartøy. Forstørrelse av bilder er 40x med henholdsvis 100x og 200x for A- og B-innsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om de ofte brukes, fortrenger intratrakealbaserte fikseringsmetoder leukocytter fra luftveiene og kan endre normal lungearkitektur. Metoden for luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering som er gitt i denne protokollen, overvinner disse fallgruvene og bevarer mer nøyaktig lungeanatomi. Nøklene til å skaffe vev av høy kvalitet fra den vaskulære perfusjonsfikseringsmetoden inkluderer nøye overvåking av luftinflasjonstrykk, unngåelse av luftlekkasjer og sikre tilstrekkelig perfusjon av fiksering i vaskulaturen.
En begrensning i denne prosedyren er at når thoraxens integritet avbrytes, kollapser lungene og re-inflasjon av lungene etter kollaps er nødvendig for nøyaktig histologisk vurdering. Et alternativ til protokollen som ville opprettholde lungeinflasjonen uten kollaps ville være bruk av en liten dyreventilator. Imidlertid er slikt utstyr ofte dyrt, og protokollen her tilbyr en billig løsning. I sunne lunger bidrar overflateaktivt middel produsert av alveolar epitelceller til å redusere overflatespenningen, og i de fleste tilfeller kan lungene lett utvides. Men i syke lunger kan vev være stivere og lungeoveraktiv funksjon kan endres, og fremmer lungekollaps. For å dempe denne effekten kan sammenrastede områder "rekrutteres" ved hjelp av litt høyere luftinflasjonstrykk (dvs. 25 cmH2O)5. Trykket kan deretter reduseres for å tillate liten deflasjon av lungene til fysiolog størrelse. I våre hender fungerer et inflasjonstrykk på 20 cm vann godt. Trykk høyere enn dette kan over-distend alveoli og svekke vaskulær perfusjon. På den annen side fører lavtrykk til at luftrommet kollapser. Langs lignende linjer må vaskulære perfusjonstrykk også titreres. Overdreven perfusjonstrykk kan distend kapillærer inn i alveolarrommet eller til og med skade kapillærene og forårsake lungeødem4. På den annen side, hvis vaskulært perfusjonstrykk er for lavt, kan perfusjon være utilstrekkelig. Vi har funnet ut at strømningshastigheter på 10 ml/min for heparinløsningen og 6,5 ml/min for den fixative løsningen oppnår et optimalt resultat.
Kontroll av luftinflasjonskammeret for lekkasjer er viktig for å sikre konstant inflasjonstrykk under vaskulær perfusjonsfiksering. Når vann er tilsatt sprøyten, skal det strømme inn i bunnen av luftinflasjonskammeret til trykket utjevnes. En liten mengde ekstra vann må kanskje legges til sprøyten for å opprettholde en kolonnehøyde på 25 cm for inflasjon og 20 cm for fiksering. Silikonforseglingsmiddel må kanskje byttes ut hvis strømmen inn i luftinflasjonskammeret ikke opphører.
En annen årsak til luftlekkasje er skade på lungene. Dette skjer oftest under åpning av thoracic hulrommet eller under utvinning av lungene fra thoraxen. Dermed må praksis og stor forsiktighet tas for å unngå å skade lungen under museforberedelse. En mindre vanlig årsak er lungepatologi som skyldes alvorlig lungesykdom. Ledetråder til luftlekkasjer fra lungene inkluderer langsom tømming fra væskekolonnen i sprøyten, en hissende lyd eller bobler som kommer fra lungeoverflaten. Påføring av en liten mengde fiksering på lungene på lekkasjestedet kan bidra til å forsegle små lekkasjer; men visse fikseringsmiddel kan føre til overholdelse av lungene til thoracic hulrommet og når lungeskaden er omfattende, lungene kan fortsatt kollapse når lufttrykket er fjernet.
Når noen kilder til luftlekkasje er vurdert og styrt, bør lungene blåse opp og forbli oppblåst under fiksering. Luftrøret bør ligated under kanylen før fjerning fra inflasjonsapparatet for å forhindre kollaps. Lungene kan deretter behandles for histologiske studier. Luftinflasjon med vaskulær perfusjonsfiksering av lunger har som mål å bevare tall, morfologi og plassering av luftveisceller, samtidig som den tilstrekkelig bevarer global lungearkitektur for histologiske strukturfunksjonsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) tilskudd HL140039 og HL130938. Forfatterne vil takke Shannon Hott og Jazalle McClendon for deres tekniske ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S.
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I.
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A.
