Summary
神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。
Abstract
ミクログリアは、パーキンソン病やアルツハイマー病を含むいくつかの神経変性疾患における神経免疫応答を調整します。ミクログリアは、食細胞性の特殊な形態である食細胞性のプロセスを通じて、死んで死んでいるニューロンをクリアします。貪食機能は、ミクログリアに影響を与える環境または遺伝的危険因子によって破壊される可能性があります。本論文は、過食性貨物に対してpH感受性色素を標識したヒト神経芽細胞細胞株(SH-SY5Y)を用いて、ミクログリアの人工多能性幹細胞(iPSC)モデルにおける微小性分胸細胞症を研究するための迅速かつ簡単なインビトロ顕微鏡プロトコルを提示する。この手順は、食細胞によって「eat-me」シグナルとして認識される表面ホスファチジルセリンを表示する死んだ神経芽細胞細胞の高い収率をもたらす。96ウェルプレートアッセイは、ライブセルタイムラプスイメージングに適しているか、またはプレートをさらなる処理の前に正常に固定し、高含有顕微鏡で定量することができます。固定細胞高含有顕微鏡検査により、アッセイをスケールアップして、小分子阻害剤のスクリーニングや、遺伝的変異型iPSCラインの貪食機能を評価することができます。このアッセイは、iPSCマクロファージによる全死神経芽細胞細胞の貪食を研究するために開発されたが、シナプトソームやミエリン、その他の貪食細胞タイプなどの神経変性疾患に関連する他のカルゴに容易に適応させることができる。
Introduction
ミクログリアは脳組織に居住するマクロファージであり、その機能には免疫監視、傷害/感染に対する炎症反応の調整、シナプスリモデリング、死んだ細胞、ミエリン、タンパク質凝集体、病原体の貪食作用が含まれる。食道は、ミクログリアが表面受容体を持つ貨物を認識し、細胞骨格を再編成して物体をファゴソームに巻き込み、リソソームと融合して貨物を分解するプロセスです。健康なミクログリア貪食アポトーシスアポトーシス脳細胞は、壊死性1になる前にそれらを除去する。アポトーシス細胞の貪食症は、また、エフェロサイトーシスとして知られており、そして、死にかけている細胞2によるホスファチジルセリン「eat-me」シグナルの表示を必要とする。多数のミクログリア受容体は、直接ホスファチジルセリンに結合します, TIM-4を含みます, BAI1, スタビリン-2, およびTREM2.ミクログリアTAM受容体(例えば、MERTK)およびインテグリンは、間接的にホスファチジルセリンに結合し、それぞれ、補助タンパク質GAS6またはMFG-E8を用いた。他の「eat-me」シグナルは、死にかけている細胞の認識に必要であり、これらはグリコシル化または表面タンパク質の電荷の変化を含む。細胞内タンパク質ICAM3、カレチコン、アネキシン-Iの細胞表面での発現;酸化されたLDL;または、ミクログリア生成補体C1q1,2によるアポトーシス細胞のコーティング。
パーキンソン病、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患は、死細胞、ミエリン断片、タンパク質凝集体などの脳内細菌の蓄積を含むミクログリア機能の障害と関連しており、これらの刺激に対する炎症性反応を誇張した3。食道症は、老化、炎症、または特異的な遺伝的リスク変異体4、5の組み合わせのために、神経変性疾患において障害され、病理に寄与する可能性がある。一方、ミクログリアが不適切に貪食可能なニューロンまたはシナプス6、7、8を食い込む可能性があるという神経変性疾患の動物モデルからの証拠もある。この機構は、微小性貪食受容体TREM2またはGPR56によって直接感知される損傷した神経突起のホスファチジルセリンディスプレイによって扇動される可能性が高く、または可溶性C1qコーティングを補体C1qで間接的に感知し、CR3媒性アゴサイスを導く。
食作用機能のインビトロアッセイは、例えば、ミクログリアにおける遺伝的リスク変異体の表現型の影響を評価するために、ラテックスビーズ4などの非生理学的なカルゴを用いて頻繁に行われる。蛍光標識細菌やザイモサンも使用され、生理学的であるが神経変性疾患には関係ない。非生理的食細胞性の貨物は、貪食性の巻き込みの基本的な機械の欠陥を検出するために使用することができますが、正確にアポトーシスニューロンの貪食における最初の「認識」ステップをモデル化することができません。大きさ、形状、剛性、および貨物の種類はまた、活性化される細胞内シグナル伝達経路を決定し、ミクログリア活性化状態の異なる結果をもたらす。例えば、大腸菌は、ヒト細胞とは異なり、小さく硬直しており、その表面のリポ多糖類は、食細胞細胞および炎症促進シグナル経路を活性化するToll様受容体4(TLR4)によって認識される2,12である。
神経変性疾患研究の文脈では、より関連性の高い貪食性貨物は哺乳類の形質素膜にホスファチジルセリンディスプレイを有し、理想的にはヒトおよび神経細胞であり、ミクログリアが遭遇する可能性が高い信号を含むであろう。この貪食プロトコルについては、ヒト神経芽細胞株SH-SY5Yを培養しやすいニューロンモデルとして選んだ。永久表面ホスファチジルセリンディスプレイはパラホルムアルデヒドによって人工的に誘導され、これは以前に血小板13のホスファチジルセリンディスプレイを引き起こすことが示されている。ミクログリア細胞モデルについては、ヒトiPSCマクロファージが用いられ、ヒトミクログリアの上生及び転写プロファイルを模倣し、貪食的に有能である14、15、16、17である。iPSCマクロファージは、最も本格的なミクログリアモデルではなく、例えば、ミクログリア形態を模倣していません。しかし、必要に応じて、より本格的な単一培養iPSCモデルのミクログリア(15.15など)に置き換えることができます。ヒトiPSCモデルは、神経変性を研究するための一次げっ歯類ミクログリアよりも好ましいが、ヒト対マウス神経変性疾患組織18において観察されるミクログリア転写モジュールの限られた重複に対する懸念に起因する。死んだSH-SY5Ysは、中性pHで弱く、貪食後のiPSCマクロファージの貪食ソームの中でより強く蛍光を発する酸感受性色素で染色される。酸感受性色素を使用すると、貪食事象を検出する精度が向上し、生きたマクロファージと固定マクロファージの異なる読み出しに対する汎用性が向上します。このプロトコルは、貪食の生細胞タイムラプスイメージングと、読み出し前の同じ細胞調製ステップを有する貪食に対する固定高含有イメージングアッセイの両方を概説する(図1)。
図1: 方法論の概略図SH-SY5Ysの調製とiPSCマクロファージの染色が並行して行われ、SH-SY5YsがiPSCマクロファージにピペット化される貪食アッセイの概要。ライブ細胞のタイムラプスイメージングをすぐに行うか、または細胞を必要な期間、37°C/5%CO2でインキュベートし、高内容顕微鏡を行う前に固定します。PFA:パラホルムアルデヒド、HBM:フェノール赤自由HEPES緩衝培地、pHr:pH感受性赤色蛍光色素STPエステル溶液、PRFMM:フェノール赤色遊離マクロファージ培地。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
このプロトコルは、オックスフォード大学オックスフォードパーキンソン病センター(倫理委員会:国民保健サービス、健康研究機関、NRES委員会サウスセントラル、バークシャー、英国(REC 10/H0505/71)に由来するヒトiPS細胞株の使用に関するガイドラインに従っています。人間のiPSCは、可能なアドベントエージェントから労働者を保護するためにクラスIIの安全キャビネット内で処理される必要があります。地域、国、EUの安全衛生規制を遵守する必要があります。細胞培養培地の組成物は 表1に詳述されており、すべての材料は補足 資料表に記載されています。
実験前の細胞培養
- iPSC培地中の培養iPSC(表1)は、hESC修飾基膜マトリックスであらかじめコーティングされた6ウェルプレート、サブコンフルエント、低通路数でコーティングされた。
- ヒトiPSCをiPSCマクロファージ前駆体に区別する:胚体培地2mLのマイクロウェル低接着24ウェルプレートに400万iPSCを播種し、胚性身体形成を促進し、毎日75%のメディア変化を5〜6日間行う。胚体をT175フラスコに移し、フラスコ当たり約150個の胚体を、20mLの工場培地を含む(表1)。工場のメディアの10-20 mLを追加することにより、毎週フィード。
注:iPSCマクロファージ前駆体は、約2〜3週間後に上清に出現し、数ヶ月間連続して生産されます。この実験では、分化工場を設置してから約6週間後の細胞を用いることが好ましい。以前に収穫されたiPSCマクロファージは、増殖能力を保持し、接着性が低く、低細胞密度での播種を防ぎます。食細胞化能力の上限年齢制限は定められていない。 - iPSCマクロファージに対するiPSCマクロファージ前駆体を区別する:上清の必要な体積を除去することによって前駆体を収穫する。40 μmの細胞ストレーナーを通して塊を取り除く。400 x gで遠心分離器を5分間ペレット細胞に対し、マクロファージ培地で再懸濁する(表1)。96ウェル組織培養(TC)処理したマイクロプレート(黒い井戸壁と光学的に透明な底)で、1ウェル当たり100μLのマクロファージ培地で、1ウェルあたり20,000〜30,000細胞の種子iPSCマクロファージ。エッジウェルを避け、PBSでこれらを埋めます。これは、蒸発がアッセイに及ぼす影響を低減するために重要である。37°C/5%CO2でインキュベーションにより6-10日間分化する。
注:このアッセイでは、iPSCラインBIONi010-C(ECACC ID:66540023)が使用されました。ただし、別の iPSC 回線を置き換えることができます。 - SH-SY5Ysを20 mLのSH-SY5Y培地(表1)でT75フラスコのサブ合流に維持し、3~4日ごとに通過します。
| 名前 | ベースメディア | 添加剤、最終濃度 |
| iPSCメディア | mTeSR1 | - |
| 胚体培地 | mTeSR1 | BMP4、50 ng/mL |
| VEGF, 50 ng/mL | ||
| SCF、20 ng/mL | ||
| 工場メディア | XVIVO15 | グルタマックス、2 mM |
| ペニシリン、100ユニット/mL | ||
| ストレプトマイシン、100 μg/mL | ||
| 2-メルカプトエタノール、50 μM | ||
| IL-3、25 ng/mL | ||
| M-CSF、100 ng/mL | ||
| マクロファージメディア | XVIVO15 | グルタマックス、2 mM |
| ペニシリン、100ユニット/mL | ||
| ストレプトマイシン、100 μg/mL | ||
| M-CSF、100 ng/mL | ||
| SH-SY5Yメディア | DMEM/F12 | 胎児ウシ血清、10% |
| ペニシリン、100ユニット/mL | ||
| ストレプトマイシン、100 μg/mL |
表1:メディアレシピ
プロトコルで使用される細胞培養培地の構成成分。メディア コンポーネントの詳細については、 資料一覧を参照してください。
2. 死んだSH-SY5Ysの準備
- クラスIIの生物学的安全キャビネットにおいて、SH-SY5Ysを解離し、組換えトリプシン様酵素と1.1 mM EDTAを含む細胞解離緩衝液の4mLを添加することにより(材料表を参照)、これは、1mL未満が薄膜コーティングとして細胞として残るように直ちに除去すべきである。37°C/5%CO2で2-3分間インキュベートします。
- T75フラスコにHBSSの10 mLを加えてすすがり、SH-SY5Ysを15 mL円錐形遠心分離管にピペットします。400 x g で 5 分間遠心分離機。上清を吸引し、フェノールを赤く含まないHEPES緩衝媒体の2 mLで細胞を再中断する( 材料表を参照)。ペレットを慎重に再懸濁し、100-1,000 μL ピペットでピペット処理して、固定前に塊を分解してください。
- 4%パラホルムアルデヒド(最終濃度2%)の2 mLをチューブに加えて細胞を固定します。チューブの時折穏やかな攪拌で室温で10分間インキュベートします。
- チューブに10mLのHBSSを加えます。遠心分離機は7分間1,200 x g で、フェノール赤自由HEPES緩衝培地の2 mLで再懸濁した。
注:ステップ2.4の後、固定SH-SY5Y製剤は、アネキシンV-FITCで染色して、アクセス可能なホスファチジルセリンおよびヨウ化プロピジウムを示すことで品質管理され、フローサイトメトリーの読み出しで細胞透過性を測定することができます。ステップ2.2から得られたSH-SY5Ysを生きと固定準備を比較します。セクション 7 および 補助図 S1を参照してください。ステップ 2.4 以降の固定 SH-SY5Ys のストレージは、評価されていないので推奨されません。
3. pH感受性赤色蛍光色素による死んだSH-SY5Ysの標識
- ステップ2.4の後、細胞を数え、2mL低タンパク結合チューブに必要な細胞の総数を除去した。100万個のSH-SY5Ysごとに、フェノールを赤く含まないHEPES緩衝媒体で2mLチューブの総容積を300~500 μLに構成します。37°Cの水浴でチューブを短時間温めます。
- pH感受性の赤色蛍光色素STPエステル( 材料表を参照)を再構成し、細胞の暖かい2mLチューブに100万SH-SY5Y当たり12.5μgの色素を添加します。ピペットでやさしく混ぜます。光から保護された30分間、室温でチューブをインキュベートします。
注:pH感受性色素のSTPエステル種は一次アミンと反応するため、標識バッファーには遊離アミンを含んではなりません。水性緩衝液の溶解性が限られているため、DMSO溶存色素を温水バッファーにのみ添加し、すぐに混合し、沈殿の兆候(光顕微鏡下の暗い粒子)を調べます。 - HBSSと遠心分離機を1200 x g で1mL、4°Cで7分間追加します。 上清を捨て、2 mL HBSSで洗います。遠心分離を繰り返します。
- 上清を捨て、フェノール赤を含まないマクロファージ培地( 材料表を参照)の細胞を200,000-120万細胞/mLの濃度に再び懸濁し、50μLが10,000-60,000細胞(すなわち、0.5x-3x以上のSH-SY5Ys iPS-マクロエイジ)になるようにします。
注:メディアのフェノールレッドはバックグラウンド蛍光を増加させるため、生細胞イメージングを行う場合はフェノールの赤いフリーメディアを使用する必要があります。これは評価されていないので、数時間以上の染色SH-SY5Ysの貯蔵はお勧めできません。氷の上に染色SH-SY5Ysを保ち、光から保護します。
4. iPSCマクロファージの染色
- 生物学的安全キャビネットにおいて、深い赤蛍光、細胞透過性、コシニミジルエステル反応性色素のマクロファージ培地に溶液を調製する( 材料表参照)。Hoechst 33342 を追加します ( 資料一覧を参照)。水浴中の37°Cに作業溶液を温めます。
- マルチチャンネルピペットを用いて細胞上清を滅菌貯留槽に入れ、iPSCマクロファージ培地を穏やかに吸引する。ステップ4.1で調製した色素溶液の70μL/ウェルを、マルチチャンネルピペットを使用してiPSCマクロファージに添加します。37°C/5%CO2で1時間インキュベートする。
- フェノール赤自由マクロファージ培地で実験的な治療を準備します。陰性対照処理として10μMのサイトカラシンDを挙す。ポストインキュベーションは、iPSCマクロファージ培地をマルチチャンネルピペットで非常に穏やかに吸引し、ハンクの緩衝生理食液(HBSS)の100 μL/wellを加えて洗浄します。すぐに穏やかなピペットでHBSSを取り除き、100 μLの培地±化合物を加えます。37°C/5%CO2で10分間インキュベートします。
注:サイトカラシンDは強力なアクチン阻害剤であり、食作用をブロックします。より長いインキュベーションを必要とする任意の実験的な処置、例えば、24-72時間、完全なマクロファージ媒体での100 μL/well処理を使用してステップ4.1の前に実験的処理を行う。細胞染色が行われ、続いてフェノール赤自由マクロファージ培地で治療が食細胞化アッセイの残りの部分に再適用されるように、プロトコルに従ってステップ4.1〜4.3に従ってください。
5. 画像化貪食
以下は、サブセクション5.1または5.2を選択して、2つの異なる貪食読み出し方法です。
- ライブセルタイムラプスイメージング
- 貪食症の前に、生細胞のタイムラプスイメージング顕微鏡(材料表参照)、コンピュータ、環境チャンバー、CO2ガスをオンにします。イメージ キャプチャ ソフトウェアを開きます。DAPI、RFP、およびCY5ライトキューブが顕微鏡に取り付けられていることを確認します。タイムラプスをクリック|インキュベート|環境室を有効にし、CO2ガスで37°Cに温暖化を選択し、また湿度が選択解除されることを確認します。顕微鏡が37°Cまで温めるのに30分ほどの時間を許す。
- ステップ4.3での化合物インキュベーション中に、iPSCマクロファージプレートを顕微鏡にロードします。
- 画像|をクリックします 。キャプチャ|船舶エキスパート. ウェルプレートを 選択し、96ウェルプレートタイプを選択します。
- [ イメージ] タブで、フェーズ チャネルをオンにし、セルがフォーカスされるように、垂直スライダを使用して粗い微調整を調整します。水平スライダーで照明レベルを調整します。DAPI、RFP、および CY5 チャネルをクリックし、各チャンネルの照明レベルを調整します。
- [ システム ]タブで、[ 容器の調整 ]をクリックし、画面の指示に従います。
- タイムラプスをクリック|ルーチン|新しいルーチンの作成タイムラプスウィザードの最初の画面で、ルーチンに名前を付けます。[次へ] をクリックします。2 番目の画面で、20x 目標を選択し、[モノクロキャプチャ] を選択して、DAPI、RFP、CY5、およびフェーズ チャネルを選択します。[サンプルの自動検索]、[自動ファインフォーカス]、[Z-Stack]、[自動照明]のオプションは選択しないでください。[次へ] をクリックします。
- 次の画面では、各ウェルの中央にビーコンを設定し、顕微鏡が各時間ポイントに対して同じ照明設定で同じコーディネートに戻ることができます。各ビーコンの焦点と照明の設定は独立しています。ビーコンを設定するには:青い円をプレートマップ上の位置にドラッグし、粗い焦点と細かいフォーカスの垂直スライダーを使用し、満足したら [ビーコンの追加]をクリックします。ビーコンの設定は、 後で[選択した更新] ボタンを使用して更新できます。
- 貪食アッセイを開始する準備ができたら、アッセイプレートを取り外し、生物学的安全キャビネットに置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり50 μLのSH-SY5Ysを追加し、液体の端にある各ウェルの側面に追加します。
- プレートを顕微鏡に積み込み、熱シフトが平衡するまで約30分待ちます。
注:プレートが顕微鏡内にある最初の30分の間に、アッセイプレートの温度変化により焦点がずれてしまう。プレートが平衡化できない場合、キャプチャされた画像はタイムラプス中に焦点が合わない状態になります。 - 各ビーコンをクリックし、フォーカス設定を更新します。[ 次へ] をクリックします。 タイムラプス ウィザードの次の画面で、ファイル形式 の TIFFを選択し、[ 個々のチャネルを保存する] オプションを有効にし、[ 各ビーコンに対してビデオを作成する] オプションを有効にし、[ 次の情報を透かしとして含める] のオプションを有効にします。[ 次へ] をクリックします。
- シーン数を 1 に設定します。[次へ] をクリックします。時間経過の持続時間と間隔を設定し、例えば、3時間および5分ごとにイメージングする。[1 フレームのみキャプチャ] を選択しないでください。[次へ] をクリックします。
- 37 °CおよびCO2 の温度で、環境室を有効にする(湿度は、短い実験のために任意です)。 [次へ ] を 2 回クリックします。データを保存するパスを選択します。[ 次へ] をクリックします。 [開始 ]をクリックして、タイムラプスを開始します。
- 固定細胞高含有イメージング
- マルチチャンネルピペットを使用して、ラベル付きSH-SY5Ysの50 μLをウェルあたりに追加し、液体の端にある各ウェルの側面に追加します。37°C/5%CO2で3〜5時間インキュベートする。
- 食細胞化後、マルチチャネルピペットでピペット化して細胞上清を軽く吸引し、廃棄する。100 μL PBS で 1 回洗浄します。
- パラホルムアルデヒド2%の100 μLを加えてプレートを固定し、室温で15分間インキュベートします。
- 井戸を吸引し、PBSの100 μLを追加します。プレートシーラーとホイルで覆います。必要になるまで4°Cで保管してください。
注:アッセイプレートは、信号の大幅な劣化なしに、少なくとも1週間はこのように保存できます。より長いストレージはテストされていません。 - 高含有イメージング顕微鏡の電源を入れ( 表を参照)、画像キャプチャソフトウェアを開きます。画面の上部にある [荷重 ]アイコンをクリックして、アッセイプレートを顕微鏡にロードします。
- [ セットアップ ] タブを選択します。左上のボックスのドロップダウンメニューで、適切なプレートタイプを選択し、オートフォーカスオプション の2つのピーク(デフォルト)を選択し 、目的の40x Water、NA1.1を選択し、 共焦点 モードを選択し、ビン化を 1から選択します。
- [設定]メニューから、使用前に40倍の水の目的をフラッシュします。
- [ チャンネルの選択 ] ボックスで、[+] アイコンを使用して、チャンネル DAPI、Alexa 647、Alexa 568 を追加します。1 μmの単一平面で測定するように設定します。アッセイプレートの染色効率のために 時間 と 電力 の設定を最適化します。
注:ガイドラインとして、DAPIを200 msの露出と100%の電力に、Alexa 647を1500 msの露出と100%のパワーで、Alexa 568を100 msの露出と40%の電力に設定します。 - チャンネルシーケンスをクリックしてチャンネルを分離することで、 チャンネル が同時に測定されないようにします。
- ナビゲーション |レイアウトを定義し、測定のウェルを選択し、ウェルごとに9-12フィールドを選択します。
- セットアップ中に、プレートマップ上の代表フィールドをクリックし、各測定チャネルを順番に確認して、チャンネルオフセットを調整して染色が存在し、画像が焦点を合わせているかどうかを確認します。
- リモート分析用にサーバーにアップロードするデータを作成するには、[ オンライン ジョブ ] ボックスと該当する画面名をクリックします。これにより、イメージング後にデータをサーバに自動的にアップロードできるようになります。
- 保存ボタンをクリックしてアッセイプロトコルを 保存 します。
- 上部の [ 実験の実行 ] タブをクリックし、実験プレートに名前を付けてから、[ 開始] をクリックします。
6. データ分析
以下に、2つの異なるデータ分析方法を示し、サブセクション 5.1 が続いている場合はサブセクション 6.1 を選択し、サブセクション 5.2 が続いている場合はサブセクション 6.2 を選択します。
- 生細胞タイムラプス顕微鏡で得られる食細胞性画像の解析
- 推奨されるオープンソースソフトウェアをダウンロードしてインストールします( 資料一覧を参照)。ソフトウェアを開きます。
- [入力モジュール] ボックスで、[ イメージ] を選択します。
- Windows エクスプローラから、ビーコン-1、ビーコン-2という名前のサブフォルダを含むデータのフォルダを開きます。すべてのビーコン フォルダを選択して、[ファイル] リスト ボックスにドラッグします。
- [ 入力モジュール] ボックスで、[ メタデータ] を選択します。[ メタデータの抽出]で [ はい] を選択します。[ メタデータ抽出方法] の横にあるドロップダウン メニューで、[ ファイル/フォルダ名から抽出] を選択します。[ メタデータ ソース] で 、[ フォルダ名] を選択します。正規表現の右側にある虫眼鏡をクリックし、".*[\.*]と入力します(?正規表現テキストボックスに P<ビーコン>.*$」を入力します(引用符を除く)。 [ 送信 ]をクリックします。[ メタデータの抽出]で 、[ すべてのイメージ] を選択します。画面の下部にある [更新 ] をクリックします。画像はビーコンでグループ化されます。
- [ 入力モジュール] ボックスで、[ 名前と種類]を選択します。次のプロセスでは、各タイムポイントの画像を正しい蛍光チャネルに割り当てることができます。 イメージ一致ルール (ドロップダウン メニュー) に名前を割り当てます。次のルールの [すべて ] (ドロップダウン メニュー) に一致するルール条件を選択します。 ファイル (ドロップダウン メニュー)、 処理 (ドロップダウン メニュー)、 含む (ドロップダウン メニュー )、DAPI (テキスト ボックス)。これらのイメージ DAPI (テキスト ボックス) に割り当てる名前。イメージタイプ「 グレイスケール・イメージ」(ドロップダウン・メニュー)を選択します。 イメージ メタデータ (ドロップダウン メニュー) から強度の範囲を設定します。
- 画面の下部にある [ 別の画像を追加] をクリックし、手順 6.1.5 を繰り返します。 DAPI を RFPに置き換え、RFP イメージをグループ化します。
- CY5チャンネル画像に対してステップ6.1.6を繰り返します。
- 画面の下部にある [更新] をクリックすると、DAPI、RFP、およびCY5というラベルの3つの列に画像ファイルが表示されます。
- [ 入力モジュール] ボックスで、[ グループ] を選択します。[ イメージをグループ化しますか?] で 、[ はい] を選択します。 [メタデータ カテゴリ] のドロップダウン メニューで、[ ビーコン] を選択します。
- [ 解析モジュール] ボックスで、空白を右クリックして、すべてのモジュールのリストを呼び出します。
- [追加] |をクリックします。画像処理|機能の強化または抑制 。入力イメージとして、最初のドロップダウン ボックスから[DAPI]を選択します。出力イメージに「DAPIspeckles」という名前を付けます。操作タイプ[エンハンス]および[フィーチャ タイプ]を選択し、機能サイズが20ピクセルのSpecklesを選択します。速度と精度オプション高速/六角形を選択します。
- 新しいモジュールを作成します。 |を追加するオブジェクト処理|プライマリ オブジェクトの識別:入力イメージとして、最初のドロップダウン ボックスから [DAPIpeckles] を選択します。プライマリ オブジェクトに「Nuclei」という名前を付けます。オブジェクトの典型的な直径を 10 ~ 35 ピクセル単位で入力します。このパラメータは最適化できます。しきい値戦略 グローバル、しきい値法 RidlerCalvard、平滑化法 [自動]を選択し、しきい値補正係数を下限 0 ~ 1 で 12 として指定します。束のオブジェクトを Shape に区別する方法を変更しますが、その他のパラメータはデフォルトの設定のままにします。
注: iPSC マクロファージ核は、直径を小さくし、核のコントラストを増加させる画像処理ステップに従って、ステップ 6.1.12 で大まかにセグメント化されています。SH-SY5Ysは、かすかな核として現れ、そうでなければiPSCマクロファージと間違えられるので、最も明るい核だけが選択されることは重要です。選択された核の比率を調整するには、しきい値補正係数を増減します。試験段階では、得られた核選択をビーコンの位相画像と比較し、細胞形態を用いてiPSCマクロファージとSH-SY5Yを区別しやすくする。 - 新しいモジュールを作成します。 |を追加する画像処理|照度計算を修正します。入力イメージとして最初のドロップダウン ボックスから CY5 を選択します。出力イメージに「IllumCY5」という名前を付けます。[ イルミネーションの選択]で、ドロップダウン メニューから [背景 ] を選択します。その他のパラメーターは、デフォルトの設定のままにします。
- 新しいモジュールを作成します。[追加] |をクリックします 。画像処理|正しいイルミネーション適用.入力イメージとして最初のドロップダウン ボックスから CY5 を選択します。出力イメージに「CorrCY5」という名前を付けます。[ イルミネーションの選択] で、ドロップダウン メニューから [IllumCY5] を選択します。[ イルミネーションの選択]で、ドロップダウン メニューから [除算 ] を選択します。
注: ステップ 6.1.13-6.1.14 の目的は、正しいセルセグメンテーションを妨げる可能性がある CY5 画像の背景照明の変化を修正することです。 - 新しいモジュールを作成します。[追加] |をクリックします 。オブジェクト処理|セカンダリ オブジェクトの識別:入力イメージとして最初のドロップダウン ボックスから CorrCY5 を選択します。入力オブジェクトとして [Nuclei] を選択します。セカンダリ オブジェクトに「Mac」という名前を付けます。識別方法を [距離 - B]として選択します。しきい値戦略 グローバル、しきい値法 RidlerCalvard、平滑化法 なしを選択し、しきい値補正係数を下限 0 ~ 1 で 1 として指定します。その他のパラメーターは、デフォルトの設定のままにします。
注: このセルセグメンテーションステップでは、セル境界を拡大または縮小するためにしきい値補正係数を調整することにより、最適化が必要になる場合があります。セグメンテーション効率は、イメージング中のiPSCマクロファージ染色の強度、またはCY5ライトキューブの照明を増加させることによっても改善することができる。 - 新しいモジュールを作成します。[追加] |をクリックします 。画像処理|機能の強化または抑制 。入力イメージとして最初のドロップダウン ボックスから [RFP] を選択します。出力イメージに「フィルタされたRFP」という名前を付けます。操作タイプ[ エンハンス] および[フィーチャ タイプ Speckles]を選択し、機能サイズを 15 ピクセルにします。機能のサイズを最適化できます。速度と精度オプション 高速/六角形を選択します。
- 新しいモジュールを作成します。[追加] |をクリックします 。オブジェクト処理|プライマリ オブジェクトの識別:入力イメージとして最初のドロップダウン ボックスから FilteredRFP を選択します。プライマリ オブジェクトに "pHr" という名前を付けます。オブジェクトの典型的な直径を 5 ~ 20 ピクセル単位で入力します。しきい値戦略 の [手動]を選択し、しきい値を手動で入力します (0.005 など)。このメソッドを変更して、束のオブジェクトを Shape に区別しますが、その他のパラメータはデフォルトの設定のままにします。
注: SH-SY5Ys は、直径を減らし、パンクタのコントラストを高める画像処理ステップに従って、ステップ 6.1.17 でセグメント化されています。pH感受性色素の強度は、貪食粒子で時間の経過とともに増加し、他の閾値戦略は、早期の時点でpH感受性色素穿刺の数を人為的に膨らませるので、手動閾値を実行することが重要です。手動しきい値は、テストモードを使用して、後続の実験の繰り返しごとに調整する必要があります。 - 新しいモジュールを作成します。[追加] |をクリックします 。オブジェクト処理|リレートオブジェクトドロップダウン メニューから入力子オブジェクト pHrを選択します。ドロップダウンメニューから入力親オブジェクト Mac を選択します。[ すべての子の測定に対する親ごとの平均を計算しますか?]で、[ はい] を選択します。子親距離を計算しない (なし) 。
注:ステップ6.1.18は、pH感受性色素信号をiPSCマクロファージに関連付け、iPSCマクロファージ当たりの食細胞化物の平均数を測定することを可能にする。 - 新しいモジュールを作成します。[追加] |をクリックします 。ファイル処理|スプレッドシートにエクスポートします。列の区切り記号を タブ として選択し、ファイル名のプレフィックスを追加してビーコン番号を示します。以下に示すように、エクスポート用の特定の測定値を選択します(手順 6.1.19.1 ~ 6.1.19.4)。その他のパラメータはデフォルト設定のままにします。
- 画像||カウントpHrと Mac を選択します。
- 画像|ファイル名
- 画像|群
- マック|子供|pHr
- [ 出力 ] ボックスの [ 出力設定の表示] をクリックします。この実験用にデスクトップに新しいフォルダを作成し、これをデフォルトの出力フォルダとして設定します。
- パイプライン ファイルの|を保存しますプロジェクトを名前を付けて保存します。
- 左下隅にある [テスト モードの開始 ] をクリックして、代表的なイメージでパイプラインをテストおよび最適化します。プログラムはテスト用の最初の画像を自動的に選択し、パイプラインの各ステップを見ることができます目のシンボルをクリックして出力を表示し、 次に実行をクリックします。テストに使用するビーコンを変更するには、上部のメニューバーで[テスト]をクリック |[イメージ グループ]を選択します。ビーコン内の画像(タイムポイント)を変更するには、上部のメニューバーで[テスト]をクリック |[イメージ セット]を選択します。最適化する必要があるパラメーターは、前の手順で説明されています。
- パイプラインに問題がなければ、[ テストモードの終了 ] をクリックし、開いた目のシンボルをクリックして閉じます。パイプラインを保存します。 [画像の解析 ] をクリックして、完全な画像解析を開始します。
- 生成されたテキスト ファイルは、適切なスプレッドシート ソフトウェアを使用してスプレッドシートとして開くことができます。
注: Count_Mac と Count_pHr は、iPSC マクロファージの数と、イメージ内の識別された pH に敏感なオブジェクトの数を表します。カウントには、貪食されていない薄暗い蛍光SH-SY5Ysが含まれるので、Count_pHrデータを使用しないでください。列 Mean_Mac_Children_pHr_Count は、個々の画像、すなわちビーコンの個々の時点に対して、Macあたりの食細胞化されたpHrオブジェクトの平均数(ステップ6.1.18 RelateObjects)を取ります。 - 各ビーコンがスプレッドシート上の別々の列になるようにデータを配置し、画像は時系列の行として配置され、異なるパラメータがスプレッドシートブックの異なるシートを占めます。
- Mean_Mac_Children_pHr_Countの測定値にCount_Macを掛けて、パラメータ画像あたりのスポット数を生成します。ビーコンごとに平均Count_Macを計算します。[画像ごとのスポットの数] をビーコンの平均Count_Macで割り、パラメータ [セルあたりのスポット数] を生成します。
注: ステップ 6.1.26 は、ビーコンのすべてのタイムポイントにわたって、データを平均 iPSC マクロファージ数に正規化することにより、iPSC マクロファージ数(Count_Mac)で発生する可能性のある誤った変動を修正します。 - 食道細胞化が開始されてからの時間を各画像行に割り当てます(分)。
- 複製ウェル/ビーコンの平均と標準偏差を生成します。時間(x軸)に対する細胞あたりのスポット数(y軸)をグラフ化して、食道細胞化の速度を可視化します。
図2:高含有食道性解析における細胞セグメンテーション 非食道SH-SY5Yに近接したiPSCマクロファージの良好なセグメント化と貧弱なセグメンテーションを示す図、第2のSH-SY5Y完全に貪食細胞化を有する。両方の細胞タイプが灰色で示されている場合、コンピュータ分析によって描かれたiPSCマクロファージのセル境界は、輪郭(青)です。SH-SY5Ysは、貪食イベントとしてカウントされ、分析から除外された場合、緑色または赤の輪郭が描かれられます。中央のイメージは、セグメントの不良を示しています。iPSCマクロファージは、細胞境界内の非食細胞SH-SY5Yを含む最適以下の線引きを有し、これは食細胞細胞化イベントとしてカウントされる。右の画像は、iPSCマクロファージ細胞境界を定義するより厳しいパラメータによる良好なセグメンテーションを示しており、非貪食SH-SY5Yが分析から正しく除外されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 高含有顕微鏡で得られた貪食画像の解析
- 推奨されるイメージ処理ソフトウェアにログインします ( 資料一覧を参照)。
- 画面名フォルダを選択し、左側のメニューからイメージング実行サブフォルダを選択します。 画像解析 アイコン(虫眼鏡を持つ画面)をクリックします。分析パイプラインを設定するためのプレート レイアウトの代表用の井戸を選択します。
- 最初の解析構成要素は入力画像です。スタック処理のデフォルト設定 (個別平面) とフラットフィールド補正 (なし) をそのまま使用します。ブロックの右上隅にある +記号をクリックして次の構成要素を追加し、[ 核の検索] を選択します。
- [ 核の検索] で、チャネルを DAPI、ROI の母集団を None、セグメンテーションの方法を Cとして設定します。メソッドボックスには、パラメータを最適化できるドロップダウンメニューが含まれ、共通のしきい値(0.40)と面積(つまり、>30 μm2)の設定が含まれています。出力人口に「Nuclei」という名前を付けます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[ 細胞質を検索 ]を選択します。
- [ 細胞質を検索] で、チャンネルを Alexa 647、 メソッドを Bとして設定します。メソッドボックスには、パラメータを最適化できるドロップダウンメニューが含まれ、共通のしきい値(0.45)と個別のしきい値(0.20など)の設定が含まれています。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[ 母集団の選択] を選択します。
注: 細胞質セグメンテーションを適切に最適化して、食細胞細胞化されていないが、貪食した貨物を除外しない隣接するSH-SY5Ysを除外することが重要です( 図2参照)。 - [母集団の選択] で、デフォルトの設定 (母集団の核)、メソッドの共通フィルター、および 「境界オブジェクトの除去」のチェックマーク、および「選択された核」という名前の出力母集団をそのまま使用します。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[モルフォロジー プロパティの計算] を選択します。
- [ モーフォロジー プロパティの計算] で、母集団を [選択された核]に設定し、領域を [セル] に設定し、メソッドを [標準] に設定します。ドロップダウンメニューで、領域と丸みが選択されていることを確認します(μm2)。出力人口に「形態細胞」という名前を付けます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[ 母集団の選択] を選択します。
- [母集団の選択 (2)]で、[選択された母集団核] と [プロパティによるフィルタ]を選択します。[フィルタ F1]のドロップダウン ボックスで、[モーフォロジー セル領域 ][μm2]を選択します。右側のドロップダウン ボックスから [>] を選択し、右側のボックスに「160」と入力します。出力母集団に「選択された核 2」と名前を付けます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[スポットの検索] を選択します。
注: この手順では、不適切にセグメント化されたセルと、デッド セルは、それ以降の分析から除外されます。カットオフサイズを増減させることで最適化が必要な場合があります。 - [スポットの検索] で、チャネルAlexa 568、ROI 母集団の核選択 2、ROI 領域セル、メソッドBを選択し、出力人口に「スポット」という名前を付けます。この方法は、必要に応じて、検出感度(0.20)と分割感度(0.400)の設定を使用して、ドロップダウンメニューを使用して最適化することができます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[モルフォロジー プロパティの計算] を選択します。
- [ モーフォロジー プロパティの計算 (2)]で、[人口 スポット]、[領域 スポット]、[ 標準] メソッドを選択します。ドロップダウンメニューで、領域と丸みが選択されていることを確認します(μm2)。出力プロパティに「モーフォロジー スポット」という名前を付けます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[ 母集団の選択] を選択します。
- [ 母集団の選択 (3)]で、人口 スポット と[ プロパティでフィルタ]を選択します。 [フィルタ F1]のドロップダウン ボックスで、[ スポットエリア [px2]> を選択します。[ フィルタ F2]のドロップダウン ボックスで、[ スポットエリア [px2]< を選択します。[ フィルタ F3]のドロップダウン ボックスで、[ モーフォロジー スポット丸み]>、0.6を選択します。[ フィルタ F4]のドロップダウン ボックスで、[ スポットから領域の強度、>、2.5]を選択します。出力人口に「スポット選択」という名前を付けます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[ 母集団の選択] を選択します。
注:自動スポット選択は、iPSCマクロファージ内の自己蛍光体に起因する多くの小さな蛍光斑点をセグメント化します。このステップは、スポットの領域、丸み、強度に厳しいカットオフを適用することによって、自己蛍光体をフィルタリングすることを目的とし、いくつかの最適化を必要とするかもしれません。 - [母集団の選択 (4)]で、[選択した母集団 2]と [プロパティによるフィルタ]を選択します。[フィルタ F1]のドロップダウン ボックスで、[スポットの数]、[>、0.5]を選択します。出力人口に「スポットポジティブセル」という名前を付けます。[ + ] 記号をクリックして次の構成要素を追加し、[結果の定義] を選択します。
- [ 結果の定義] で、最初の方法を [ 出力の一覧 ]として選択します。既定の設定では、各母集団に対して計算されるオブジェクトの数が設定されます。 [母集団: 選択した核 2] のドロップダウン メニューをクリックして 、[オブジェクトの数] にチェックマークが付いていることを確認し、[ すべてに適用] ドロップダウン メニューで [ すべて] を選択します。母集団の スポット正のセルの場合は、 オブジェクト数 がチェックされていることを確認します。他の集団では、パラメータを報告する必要はありません。2 番目の方法を [式の出力] として選択し、式 (a/b) * 100を入力します。変数 A スポット正セル - オブジェクト数として選択し、変数 B として [核選択 2 - オブジェクト数] を選択します。出力に「スポットポジティブセル(%)」と名前を付けます。
- パイプラインを保存する:アイコンをクリックして 、ディスクに分析を保存 (下矢印付きのフロッピー ディスク)。
- アイコンバッチ 分析 (画面の上部に沿ってファネルと歯車のシンボル) をクリックします。左側の実験用フォルダから、選択した測定値の数を 1に更新する生データ ファイルを選択します。[ 解析オプション] 領域で、[ 方法] のドロップダウン メニューをクリックし、[ 既存の分析] を選択します。をクリックします。[スクリプト ファイル] の横に表示され、保存された解析ファイル (サフィックス .aas) を参照します。次に、[解析の開始] の横にある緑色の矢印をクリックします。分析の進捗状況は、(画面の右上隅にある) [ジョブステータス ]をクリックして監視できます。
- 分析が完了したら、[ エクスポート] タブ をクリックし、実験フォルダを選択して、展開先フォルダを選択します。デフォルトの設定はそのままで、データはエクスポートしますが、TIFF イメージはエクスポートせず、エクスポートを開始します。
- ダウンロードしたファイルをスプレッドシートとして適切なスプレッドシートソフトウェアで開きます。ウェルは行に配置され、パラメータは列に並んでいます。[スポット陽性セル (%)]、[選択した核 2 - スポットの数 - ウェルあたりの平均]、および [核選択された 2 - 合計スポット領域 - 平均] と表示される列のデータを選択し、各パラメータの新しいスプレッドシートにコピーします。各条件の複製ウェルのパラメータ平均を計算し、必要に応じてグラフ化します。
7. 固定SH-SY5Ysの均質性のための品質管理アッセイ
- ステップ2.2から生きたSH-SY5Ysのアリコートを収集し、1mL当たり約20万細胞の濃度でアネキシンV-FITC染色用キット( 材料表を参照)からアネキシン結合バッファーに再中断します。
- ステップ2.4から固定SH-SY5Ysのアリコートを収集し、mL当たり約20万細胞の濃度でアネキシン結合バッファーに再懸濁します。
- 5 μLのアネキシンV-FITCと5 μLのヨウ化プロピジウムを用いた試験管を2つ用意する( 材料表を参照)。1つのチューブに500 μLのライブSH-SY5Ysを加え、もう一方のチューブに500 μLの固定SH-SY5Yを追加します。
- 3つのコントロールチューブを用意:1つは5μLのアネキシンV-FITC、1つは5μLのヨウ化プロピジウム、1つのチューブは空です。ライブと固定SH-SY5Yの1:1の比率を混ぜ合わせ、これを500 μLずつ各コントロールチューブに加えます。
- ピペットでチューブを軽く混ぜます。光から保護された10分間室温でインキュベートする。
- フローサイトメーターですぐに測定する(Ex = 488 nm;Em = 530 nm) アネキシン V-FITC 用 FITC 信号検出器 (通常 FL1) と、ヨウ化プロピジウム用のフィコエリスリン放出信号検出器 (通常は FL2) を使用した。
- FITCとPI信号のドットプロットを表示し、矩形の格子線ツールを使用して二重負母集団を選択するには、任意のフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用します。二重負の母集団内で、FSC対SSCを表示し、ポリゴンゲーティングツールを使用して、非常に低いFSCおよびSSCを持つ集団の周りに除外ゲートを作成します。残りのイベントを FITC 対 PI 信号として表示し、単染色および未染色のコントロールを使用して、FITC-PI、FITC+/PI-、FITC -/PI+、および FITC+/PI+ イベントの象限ゲートを設定します。
注:粗い取り扱い、渦、または生きたSH-SY5Ysでの長いインキュベーションは避け、人工的にホスファチジルセリンディスプレイを誘発する可能性があります。遅延なくサイトメトリーを流れるに進みます。望ましい結果は、FITC-/PI-イベントの割合が固定SH-SY5Ysで<5%であるということです。代表的な結果は 、補足図 S1に示されています。
Representative Results
ライブセルタイムラプスイメージングは、以前に概説されたプロトコルを使用して行われ、野生型iPSCマクロファージはウェルあたり20,000細胞に播種されました。異なる量のSH-SY5Yが適用され(10,000-30,000分およびステップ3.1の細胞数から推定される)、および食作用抑制剤サイトカラシンDがいくつかのウェルで前培養(1h)され、SH-SY5Ysの各量に対する食細胞化を抑制する制御として作用した。画像撮影はSH-SY5Ysの添加後40分に開始し、画像は次の3時間の5分間隔で撮影された(データは最初の40分遅延を含む)。補足 データには代表的なタイムラプス ビデオが含まれており、 図 3に示す定量的データを分析します。ウェル当たり10,000個のSH-SY5Ysの量で、細胞当たりの食細胞粒子(スポット)の数は時間とともに直線的に増加し、サイトカラシンDによって約50%阻害された。サイトカラシンDによる阻害は予想よりも弱く、3つの画像フィールドで1つの条件が画像化されたため、技術的または生物学的複製が不十分であった可能性が最も高かった。1ウェル当たりのSH-SY5Ysの量が多く(20,000と30,000)、貪食症は、より混雑した視野でiPSCマクロファージとSH-SY5Ysのセグメント化が悪いため、直線性が悪かった。
固定細胞高含有イメージングは、以前に概説されたプロトコルを使用して行われ、野生型iPSCマクロファージはウェルあたり20,000細胞、数種類のSH-SY5Ys(1ウェルあたり10,000-80,000)、アッセイプレートを固定し、5時間後にイメージングしました。食道細胞症の代表的な画像を図4Aに示し、分析データを図4B17に示す。SH-SY5Ysの量を増やすと、細胞当たりの貪食性粒子(斑点)の数が多くなりました。しかし、SH-SY5Y量の倍増は、セルあたりのスポット数が1.5倍に増加するだけです。これは、テストされた量が食細胞化に対するレート制限ではないことを示しています。続いて高含有イメージング食作用アッセイは、いくつかの貪食抑制剤を用いて検証した(図4C)17.このアクチン重合阻害剤であるサイトカラシンDおよびジャスプラキノリドは、貪食前に1時間前に予時インキュベートした場合、それぞれ91%および90%の顕著に食作用を阻害した。細胞カラシンDまたはジャスプラキノリドが陰性制御として使用される場合のアッセイの堅牢なZ'は、それぞれ0.7および0.8として計算され、それぞれ20。リソソーム酸性化阻害剤であるバフィロマイシンA1は、貪食の前に1時間培養した場合に、食作用を31%有意に減少させた。リソソーム酸性化阻害剤とアクチン阻害剤の弱い効果は、内在化された貨物の検出がファゴソームの完全な酸性化を必要としないかもしれないことを示唆している。組換えアネキシンVは、SH-SY5Ysの表面に露出したホスファチジルセリンを特異的に遮断するコントロールとして使用され、食細胞受容体がリガンドにアクセスするのを防ぎ、重要な「eat-me」シグナルである。組換えアネキシンVの添加は、SH-SY5Y添加の直前にウェルに添加した場合、30%減少した。固定SH-SY5Ysはホスファチジルセリンを露出することが確認され、蛍光アネキシンVプローブを使用し、一方、生のSH-SY5YsはアネキシンV染色に対して陰性であった(図4D)。
この微小貪食受容体TREM2は、アポトーシスニューロン21の貪食に重要であることが以前に示されている。TREM2のR47H変異は、アルツハイマー病の遅発発症のリスク遺伝子であり、TREM223のリガンド結合を減少させると仮定される。R47H TREM2およびTREM2 KOの貪食機能評価を目的として、固定細胞高含有食作用アッセイをWT/R47H/KO TREM217でアイソジェニックiPSCマクロファージラインを用いて実施した。1〜5時間の貪食期間のいくつかの長さをテストし、貪食性貨物(40,000 SH-SY5Ys)の驚異的な添加を使用してテストした。結果として得られる信号は直線的に4hに増加し、5h(図5)17でわずかにオフにした。減少した食細胞化率および容量(%スポット陽性細胞)は、WTと比較してTREM2 KOで明らかであったが、R47H TREM2変異体は変わった食細胞化を示さなかった。TREM2 KO細胞における食細胞性欠損は、R47H TREM2突然変異によってフェノコピーされず、TREM2機能が正常な食細胞化を支えるのに十分であるために見える。
図3:生細胞時間経過貪食アッセイのデータ例 野生型iPSCマクロファージBIONi010-C(ECACC ID:66540023)による死んだSH-SY5Ysの取り込みは、3時間5分間隔で画像化した。グラフに表示される時間は、測定なしで最初の40分を含む貪食の開始からである。3つの複製ウェルからのセルあたりの平均スポット数がプロットされます。10,000のSH-SY5Ysの貪食は1時間前処理の10 μMのサイトカラシンDで阻害され、SH-SY5Ys(20,000および30,000)のより高い量は、食細胞化の最適でない定量化を有する。標準偏差(SD)±平均値、N= 1実験。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:固定細胞高含有貪食アッセイの最適化と検証(A)野生型iPSCマクロファージBIONi010-C(ECACC ID:66540023)によるSH-SY5Ys貪食の代表的な高含有顕微鏡画像。40,000 SH-SY5Ys の 3 時間のタイムポイントを示します。蛍光チャネルは、iPSCマクロファージ染色が赤、核が青色、SH-SY5Ysが黄色で示され、結合されます。インセットパネルは、画像拡大3xのセクションである(B)5時間後に食細胞細胞死SH-SY5Ysの細胞当たりのスポット数を、野生型iPSCマクロファージに異なる量の貨物添加を使用する。平均±平均の標準誤差(SEM)、N = 3収穫の場合。(C)食道(3h)は、10 μMのサイトカラシンD(Cyt)、1 μMバフィロマイシンA1(Baf)、1 μMジャスプラキノリド(1時間前処理付き)で阻害される。Jas)、および13 μg/mL組換えアネキシンV(死んだSH-SY5Ysに同時に加える;アン)。SH-SY5Yを追加していないiPSCマクロファージは陰性コントロール(-ve)として使用され、SH-SY5Ysを追加した陽性(+ve)コントロールは未処理のiPSCマクロファージです。データは、実験の繰り返しの平均に正規化されました。SEM±、N=3-6の収穫および2つの野生型細胞株(SFC840-03-03)について、この行の特徴付けは(フェルナンデスら21およびBIONi010-C)ダネットのポストテストホックとの1ウェイANOVAに記載されている。*p<0.05、***< p00000000.(D)新たに固定されたSH-SY5Ysは、ホスファチジルセリンディスプレイ(アネキシンV-FITC)用に均一に染色し、細胞透過性(ヨウ化プロピジウム)が限られている。生きたSH-SY5Ysは、培養中の少数の死細胞に存在する焦点染色を除いて、アネキシンV-FITCまたはヨウ化プロピジウムに染色しない。フィギュアはアルツハイマーの研究&治療17の許可を得て再現されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:TREM2 KOでは食細胞化は減少するが、R47H TREM2 iPSCマクロファージでは減少していない。高含有食細胞性アッセイは、驚異的な添加物を備えた1井戸あたり40,000 SH-SY5Ysで行われます。各パラメータについて、細胞あたりのスポット数、細胞当たりのスポット領域の合計(μm2)、および細胞ごとに食細胞細胞化粒子を含む細胞の割合を定量化しました。データは、実験ごとに各遺伝子型の平均値に正規化した。平均±SEM、N = 3収穫の場合。ダネットのポストホックテストである2ウェイANOVAの繰り返し測定は、毎回WTと対方向比較します:*p < 0.05、**p <0.01、***p <0.001です。フィギュアはアルツハイマーの研究&治療17の許可を得て再現されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図 S1: SH-SY5Ys調製のための QC の例。 解約したSH-SY5Ysを、0%(生細胞)、1%、パラホルムアルデヒド(PFA)の2%で10分間固定し、次いで洗浄した。細胞をアネキシンV-FITCとヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、すぐにフローサイトメトリーで測定した。色密度ドットプロットは、単染色された非染色コントロールを使用して象限ゲートを配置するフローサイトメトリー解析ソフトウェアで作成されました。象限には、その象限内のイベントの割合が付きます。生細胞は主に第4四半期で、固定細胞は主に第2四半期です。Q1 = アネキシン V/PI-, Q2 = アネキシン V+/PI+, Q3 = アネキシン V+/PI-、 Q4 = アネキシン V/PI- (生細胞) このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ:ライブ細胞のタイムラプス食道。 野生型iPSCマクロファージBIONi010-C(ECACC ID:66540023)によって食細胞化SH-SY5Ysの代表的なタイムラプスビデオ。画像は3時間5分ごとに撮影した。ビデオはトリミングされ、毎秒3フレームで実行され、アッセイの最後の1.5時間を示しています。酸感受性染料染色SH-SY5Ysは、貪食酸性化に伴って増加する赤色のシグナル強度で示されている。Hoechst 33342で染色された細胞核は青色で示されている。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
Discussion
ミクログリアは、アポトーシスニューロンの貪食症を含む神経変性疾患の開始および進行に影響を与える重要な機能を有する。シナプスの微小性貪食症および不適切な貪食症はいずれも神経変性疾患と関連しているが、基礎となるメカニズムおよび因果関係は4,23に十分に理解されていない。本論文では、iPSCマクロファージによるアポトーシス細胞の食細胞を測定する食細胞細胞の測定法を概説し、生細胞タイムラプスイメージング読み出しまたは固定細胞高含有顕微鏡、または単一アッセイ上での組み合わせのいずれかを用いた。この多様性は、アッセイがいくつかのウェルで時間の経過とともに個々の貪食事象を研究するために使用することができるか、または複数の条件または処置の高内容スクリーニングに使用することができることを意味する。高含有アッセイは単一のタイムポイントで固定されるため、複数のアッセイプレートを同時に調製することができました。高含有アッセイは、マクロファージ/ミクログリアを疾患関連遺伝子変異体と特徴付けたり、食作用の変化に対する小分子阻害剤をスクリーニングしたりするための潜在的な有用性を有する。アッセイはまた、他のミクログリアモデル、または潜在的にアストロサイトの貪食症を研究するために容易に適応することができる。この貪食アッセイは、例えば、ミトコンドリア、カルシウム、またはROS指標などの生細胞イメージング染色で多重化され、また、関心のあるタンパク質に対する免疫蛍光染色を後固定することができます。アポトーシス神経細胞を利用する既存の貪食アッセイと比較して、このプロトコルが与える主な利点は、貪食性貨物の調製が比較的簡単かつ迅速であり、均一な製品をもたらすということです。他のアッセイは、2時間25のS-ニトロソ-L-システインを用いたニューロンまたはSH-SY5Ysのアポトーシスを誘導し、3h22のオカダ酸、4-16 h 26、27、28、29または24時間30のUV照射の細胞に生じ得る。さらに、著者が知る限り、ライブセルイメージングおよび高コンテンツイメージング読み出しは、これまで説明されていなかった。パラホルムアルデヒド固定を使用して貪食性貨物を準備する主な制限は、細胞がアポトーシスのプロセスを完全に再現しないことです。固定が食細胞を引き付ける標的細胞からのヌクレオチド「私を見つける」シグナル(例えば、ATP、UDP)の分泌にどのような影響を及ぼすかは分かっていない。アポトーシス細胞と同様に、固定SH-SY5Ysはヨウ化プロピジウムに対して膜透過性を示す。膜透過性は「私を見つける」信号の放出に関連付けられます。しかし、これは固定SH-SY5Ysでは研究されておらず、ヌクレオチドがあまりにも速く放出されると、SH-SY5YsがiPSCマクロファージに添加される前に洗い流されるであろう。
プロトコルの最初の重要なステップは、pH感受性赤色蛍光色素のSTPエステルを用いた死んだSH-SY5Ysの染色です。この染料は、死んだSH-SY5Ysの表面上の遊離一次アミンと迅速かつ共有的に反応する。染色の期間を最適化する必要はありません。ただし、ラベルを付ける前に染料の取り扱いに注意する必要があります。遊離アミンを含むバッファーでは、標識反応を行ってはなりません。さらに、DMSOストックが冷水バッファーまたは高い最終濃度で希釈された場合、沈殿のリスクがあります。沈殿物は、顕微鏡下で密な暗い物体として表示されます。さらに、pHに敏感な色素の溶液は規則的なプラスチック遠心管に付着し、ゆっくりと流し落とす;したがって、ラベル付け工程には低結合のチューブが推奨されます。永久蛍光色素の代わりにpH感受性染料を使用すると、細胞膜に隣接する粒子に対して、巻き込まれた粒子の同定に役立ちます。中性pHでは蛍光がいくらかあるため、貪食性貨物とiPSCマクロファージの密度は、正確なセグメンテーションのために十分低く保つ必要がありますが、多くの貪食事象が捉えられるほど高い。高含有顕微鏡検査では、ウェル内の中密度の貨物(iPSCマクロファージあたり2 SH-SY5Ys以上)で貪食を正確に同定することができた。逆に、深紅のスペクトルにおける顕微鏡の感度が弱いため、生細胞のタイムラプス画像データにおけるiPSCマクロファージのセグメンテーションは信頼性が低く、偽陽性の可能性を減らすために非常に低密度の貨物を使用する必要がありました(2つのiPSCマクロファージごとに1 SH-SY5Y)。適切なセグメンテーションと貨物密度の検証は、未処理のウェルとサイトカラシンD処理されたウェルとの比較で行う必要があります。十分に最適化されたアッセイでは、サイトカラシンDは未処理サンプルに対して細胞当たりの平均スポット数を90%削減する必要があります。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、iPSCマクロファージ染色であり、細胞を識別し、画像解析でセグメント化して、外部SH-SY5Yがカウントから除外されるようにします。推奨染料は細胞透過性であり、細胞質内の不溶性蛍光産物に変換され、固定性、無毒である( 材料表を参照)。染色工程は、高含有イメージング食細胞化アッセイによるiPSCマクロファージの使用に最適化されており、他の細胞タイプを用いる場合は再最適化を推奨する。細胞染色の持続時間を増加させ、細胞内の不溶性蛍光生成物の沈着を改善することができる。色素濃度が最適化されている場合は、有機溶剤車両の有毒なレベルを避けるために注意する必要があります。
アッセイの成功に対する第3の重要な要素は、データ分析である。提供される分析パイプラインは、染色強度や細胞形態の違いが書かれたパイプラインのセグメンテーションの有効性を低下させる可能性があるため、規範的ではなくガイダンスを意図しています。そのため、適切な正と負のコントロールでパイプラインをテストして、いくつかの最適化が必要になり、最適化する必要のあるパラメーターがプロトコル テキストに示されます。陰性コントロールには、sh-SY5Ysを添加する前に、iPSCマクロファージがシトカラシンDなどの強力な食作用抑制剤で前処理される状態が含まれるべきです。もう一つの可能な負の制御は、アッセイの最後にiPSCマクロファージの以前に未処理の井戸にSH-SY5Ysを追加することです, これは、貨物のいくつかのセトリングを可能にしますが、ファゴサイトーシスのかなりの量が発生するには短すぎます.食細胞性イベントは、深い赤い蛍光チャネルを用いたソフトウェアアルゴリズムによって定義されるiPSCマクロファージの境界内の赤色蛍光物体として定義される。細胞のセグメンテーションが悪い場合(図2)、iPSCマクロファージに近接した多くの非貪食SH-SY5Ysが誤って分析に含まれる可能性がある、すなわち偽陽性。良好なセグメンテーションを達成する上で最も重要な要素は、iPSCマクロファージの厳格な線引です。両方の解析のセグメンテーションは自動化されているため、すべてのセルに対して完全なセグメンテーションを得ることは不可能です。ただし、いくつかのテストイメージを参照として使用して、セグメンテーションをより最適にするためにいくつかのパラメータを調整することができます。この状態で検出された貪食性イベントの数が多い場合、セグメンテーションが最適ではないことが示されるため、サイトカラシンD制御は最適なセグメンテーションを評価するために重要です。細胞1個あたりの貪食事象の数がシトカラシンD条件で80%〜90%低くなるまで、データ分析パイプラインの最適化を繰り返す必要があります。
起こりがちな貪食アッセイの問題は、(1)陽性制御における弱いpH感受性蛍光、(2)アッセイ終了時のマクロファージのまばらまたは不均一な分布、または(3)非貪食SH-SY5Ysからの分析における偽陽性の数が多い。弱いpH感受性蛍光のトラブルシューティングは、まずSH-SY5Ysの染色が強いマゼンタ色の細胞ペレットをもたらしたことを確認する必要があります。色が弱い場合は、新鮮な染料ストックが使用されていることを確認し、標識バッファーがアミンフリーであることを確認し、染色前にSH-SY5Ysに余分な洗浄を加え、SH-SY5Ysの正しい数が染色されたかどうかを確認し、染料の標識濃度を最適化します。SH-SY5Ysが強く染色されている場合は、アッセイプレートに加えた濃度が正しいかどうかを確認し、iPSCマクロファージが健康で古すぎないことを確認します。第2のタイプの問題、不均一なマクロファージ分布は、ピペッティング中の細胞の喪失から生じる可能性があり、狭孔先端を避けて細胞が経験するピペット力を減らすためのステップを取る必要があります。問題が残る場合は、細胞透過色素でiPSCマクロファージをロードするインキュベーション時間を短縮します。第3の問題は、分析における非貪食性粒子の誤った包含に関して、分析パイプラインのより多くの最適化が必要であることを示している。トラブルシューティングでは、まず、セルのセグメンテーションと、ソフトウェアに隣接するオブジェクトが含まれているかどうかに焦点を当てる必要があります。調整できる特定のパラメータは、関連ステップの下の注記で提案されています(ライブセルタイムラプス分析のステップ6.1.11-6.1.15、ハイコンテンツ分析の場合はステップ6.2.4-6.2.8)。細胞のセグメンテーションをさらに改善できない場合、高含有分析には、不適切にセグメント化されたiPSCマクロファージを除外する追加のステップ(ステップ6.2.8)があります。さらに、iPSCマクロファージ内のpH感受性蛍光の許容スポットをフィルタリングするモジュールを最適化し、受け入れられたオブジェクトの閾値強度を高め、非貪食性SH-SY5Ysを除外するのに役立つはずです(ライブ細胞タイムラプス分析のステップ6.1.17、および高コンテンツ分析のためのステップ6.2.11)。
我々は、それぞれが利点と限界を有する貪食アッセイのための2種類の顕微鏡読み出しを開発した。ライブ細胞のタイムラプスイメージングは、貪食動態に関する追加情報を提供するメリットがあり、高コンテンツイメージングプラットフォームよりも広く利用可能です。推奨されるオープンソースソフトウェアは、顕微鏡の供給源に依存せず、生細胞のタイムラプス機能の有無にかかわらず、良質の蛍光顕微鏡で使用することができます。ライブセルイメージングの主な制限は、感度と光学系が限られているため、iPSCマクロファージの良好なセグメンテーションを検出して実行することがより困難になります。この制限は、iPSC マクロファージ染色の持続時間を長くするか、より敏感な顕微鏡に切り替えることによって軽減することができます。高含有イメージングファゴサイトーシスアッセイは、高含有イメージングシステムが利用可能な場合に推奨される読み出しです。高コンテンツイメージングシステムは、より高いスループットとより信頼性の高いデータを可能にし、このアッセイをスクリーニングに使用することを可能にし、このアッセイは、≥0.7の堅牢なZ'出力20に対して期待されるであろう。ライブセルのタイムラプス法と比較して、高コンテンツ顕微鏡読み出しは、より高い感度、より高い自動化と速度、より多くのウェルおよびイメージングフィールドを処理することができ、高解像度の共焦点画像が生成されます。細胞セグメンテーションは良好な画像でより効果的であり、セグメンテーションは、高い不規則な形状の細胞に適したより多くの細胞セグメンテーション方法を提供する高コンテンツイメージング解析ソフトウェアによってさらに助けられます。高含有イメージング解析ソフトウェアは、食細胞の割合などのオープンソースソフトウェアと比較して、貪食のパラメータも多く計算した。高含有食細胞性アッセイの主な制限は、イメージングシステムと解析ソフトウェアのコストとアクセシビリティの1つです。
結論として、本論文で提示された定量食細胞化アッセイは、インビトロで死んだニューロンのミクログリア貪食症をモデル化するための有用なツールである。ミクログリアはiPSCマクロファージによってモデル化され、死んだニューロンはパラホルムアルデヒド固定SH-SY5Ysによってモデル化される。公開されている最も本格的なミクログリアと死んだ/アポトーシスニューロンモデルではありませんが、これらは簡単に準備でき、スケーラブルです。アッセイ自体は非常に汎用性が高く、2種類のイメージング読み出しが詳細で、異なるミクログリア/マクロファージ単培養モデル、または食細胞性貨物として機能する異なる細胞タイプでの使用に適応する可能性があります。高含有イメージング読み出しは、定量的データを得るのに有利であり、iPSCマクロファージにおける貪食症の小分子モジュレーター、またはスクリーニング遺伝的変異体をアッセイするためにスケールアップすることができる。しかし、高含有イメージングシステムは高価でデータが多いため、必要に応じて高品質の従来の蛍光顕微鏡に置き換えることができるライブセルタイムラプス顕微鏡を使用して、代替イメージング読み出しがプロトコルに含まれています。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ヴァル・ミラー博士とソハイブ・ニザミ博士が高内容顕微鏡の支援をしてくれたことに感謝し、ダニエル・エブナー博士が高コンテンツ顕微鏡にアクセスしてくれたことに感謝している。さらに、著者らは、エマ・ミード博士のアッセイ開発アドバイス、キャシー・ブラウン夫人にiPSCサポートに感謝しています。この研究は、オックスフォード・マーティン・スクールLC0910-004のジェームズ・マーティン幹細胞施設オックスフォード(S.A..C.)への追加支援を受けて、アルツハイマー研究英国オックスフォード創薬研究所(ARUK ODDI、助成金参照ARUK-2020DDI-OX)によって支援されました。パーキンソン病英国からのモニュメントトラストディスカバリー賞(J-1403);MRC認知症プラットフォーム英国幹細胞ネットワーク資本設備MC_EX_MR/N50192X/1、パートナーシップMR/N013255/1、モメンタムMC_PC_16034賞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
| 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
| 2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
| 6-well plate, tissue culture treated | |||
| AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
| Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
| Automated cell counter | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
| CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
| CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
| Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
| CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
| CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
| Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
| EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
| EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
| Flow cytometer | |||
| Flow cytometry analysis software | |||
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
| HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
| Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
| Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
| Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
| Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
| M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
| mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
| Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
| pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
| Serological pipette filler | |||
| T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
| T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
| Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
| TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
| Water bath, set to 37°C | |||
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |
References
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