利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

摘要

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。

摘要

基于脂质的药物载体因其尺寸小、生物相容性好以及包封效率高，已被用于临床和商业化给药系统。利用脂质纳米颗粒（LNPs）包封核酸具有优势，可保护RNA或DNA免于降解，同时促进细胞摄取。LNPs通常包含多种脂质组分，如可电离脂质、辅助脂质、胆固醇以及聚乙二醇（PEG）偶联脂质。由于可电离脂质的存在，LNPs能够高效包封核酸：在低pH条件下，该脂质呈阳离子态，可与带负电荷的RNA或DNA发生复合。本文中，LNPs通过将信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）包封，并将脂质组分的有机相与核酸组分的水相进行快速混合而形成。该混合过程采用精确的微流控混合平台完成，可在维持层流的同时实现纳米颗粒的自组装。通过动态光散射（DLS）测定其流体动力学尺寸和多分散性。通过测量Zeta电位确定LNPs的有效表面电荷。采用荧光染料定量被包封的核酸，以表征包封效率。代表性结果展示了该方法的可重复性，以及不同配方和工艺参数对所制备LNPs的影响。

引言

药物载体用于保护和递送治疗性药物，通常具有低细胞毒性、提高的生物利用度和增强的稳定性等有利特性^1,2,3。聚合物纳米颗粒、胶束和基于脂质的颗粒此前已被用于核酸的包封与递送^4,5,6,7。脂质已被用于多种类型的纳米载体系统中，包括脂质体和脂质纳米颗粒（LNP），因其具有良好的生物相容性和高稳定性⁸。LNP可有效包封核酸用于基因递送^9,10。它们可在全身循环过程中保护核酸免受血清蛋白酶的降解¹¹，并可改善向特定部位的递送效果，因为LNP的表面形貌和物理性质会影响其在体内的分布¹²。LNP还可提高组织穿透性和细胞摄取效率⁹。先前的研究已证明将siRNA成功包封于LNP中的可行性

方案

整体流程的示意图见图1。

1. 缓冲液的制备

注意：建议在此处对缓冲液进行无菌过滤，以去除可能影响核酸和脂质纳米颗粒（LNP）质量的任何微粒。

1. 磷酸盐缓冲液（PBS）
   1. 使用8 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl 和 2.7 mM KCl 溶于无核酸酶水中配制1x PBS，并将pH值调节至7.4。
   2. 使用0.22 µm孔径滤膜通过真空过滤法进行灭菌。
2. 柠檬酸盐缓冲液
   1. 使用5 mM 柠檬酸钠、5 mM 柠檬酸和150 mM 氯化钠溶于无核酸酶水中配制柠檬酸盐缓冲液，并调节pH至4.5。
   2. 使用0.22 µm孔径滤膜通过真空过滤法进行灭菌。
      ​注意：仅当mRNA为将被包封于LNP中的核酸时，才需要配制柠檬酸盐缓冲液。若将包封DNA，则跳过步骤1.2，直接进入步骤1.3。
3. 苹果酸缓冲液
   1. 使用20 mM 苹果酸和30 mM 氯化钠溶于无核酸酶水中配制苹果酸缓冲液，并调节pH至3.0。
   2. 使用0....

结果

在不同日期制备了多批具有相同脂质配方和N/P比为6的脂质纳米颗粒（LNPs），以验证该技术的可重复性。第1批和第2批的粒径分布重叠，且多分散性相似（图2A）。两批样品在粒径和包封效率方面均未观察到显著差异（图2B）。每批样品的包封效率均较高（>98.5%），粒径相似，脂质纳米颗粒直径为77 nm。颗粒均一，第1批的平均多分散系数（PDI）为0.15，第2批为0.18。

在N/P比、所用可电离脂质及包封的核酸方面，配方参数的变化显示出一些微小但具有统计学意义的差异。尽管存在这些差异，但需要指出的是，所有形成的脂质纳米颗粒（LNP）的包封率均超过80%，大多数配方的包封率高于95%，且粒径小于110 nm，表明本研究中开发的所有配方均适用于基因递送。首先，使用可电离脂质A在N/P比为10和36的条件下制备LNP。降低N/P比导致包封效率下.......

讨论

与现有其他方法（如脂质膜水合和乙醇注射）相比，采用微流控混合制备脂质纳米颗粒（LNP）具有可重复性高、速度快和样品用量少等显著优势。我们已证实该方法具有良好的可重复性，在不同批次的LNP制备中，包封效率和粒径均未出现显著差异。这对于包括LNP在内的任何治疗性产品实现临床应用而言，是一项至关重要的标准。

本文所述技术采用交错鱼骨状微流控混合方法，可在仅几分钟的时间尺度内实现脂质纳米颗粒（LNP）的形成。该混合方式利用混沌对流，有利于混合过程的控制并缩短混合时间²⁷。这种混合器可使水相与有机相有效地相互包裹²⁷。已有研究显示，采用交错鱼骨状混合时，颗粒会形成热力学上最小的稳定尺寸³²，这意味着组分通常会影响LNP的粒径和多分散性^27,32,33。在代表性结果中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（C-14 PEG）	Avanti Polar Lipids	880151P
10 µl 带刻度滤芯吸头 （无RNase、无DNase、无DNA）	USA Scientific	1121-3810
1000 µl 带刻度滤芯吸头（无RNase、无DNase、无DNA）	USA Scientific	1111-2831
20 µl 斜面滤芯吸头（无RNase、无DNase、无DNA）	USA Scientific	1120-1810
200 µl 带刻度滤芯吸头（无RNase、无DNase、无DNA）	USA Scientific	1120-8810
3β-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾烯-3β-醇（胆固醇）	Sigma-Aldrich	C8667
BD Slip Tip 无菌注射器（1 ml 注射器）	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Slip Tip 无菌注射器（3 ml 注射器）	Thermo Fisher Scientific	14-823-436
BD Vacutainer 通用注射器针头（BD 钝头填充针 18G）	Thermo Fisher Scientific	23-021-020
台式离心机	Beckman Coulter
黑色 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT 无RNase、无DNase、无DNA 微量离心管（1.5 mL）	Thermo Fisher Scientific	14-380-813
柠檬酸	Fisher Scientific	02-002-611
Corning 500 ml 真空过滤/储存瓶系统，0.22 µm 孔径	Corning	430769
一次性折叠毛细管池	Malvern	DTS1070
乙醇，纯度 200 proof	Sigma-Aldrich	459844
Fisher Brand 半微量比色皿	Thermo Fisher Scientific	14955127
Invitrogen 圆底离心管（15 mL）（无DNase-RNase）	Thermo Fisher Scientific	AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra 离心过滤装置	Thermo Fisher Scientific	UFC901024
NanoAssemblr 台式系统	Precision Nanosystems
无核酸酶水	Thermo Fisher Scientific	AM9930
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	P7589
Quant-iT RiboGreen RNA 定量检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	R11490
氯化钠	Fisher Scientific	02-004-036
柠檬酸钠二水合物，颗粒状	Fisher Scientific	02-004-056
SpectraMax i3x	Molecular Devices
Zetasizer Nano	Malvern