Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formulering og karakterisering lipid nanopartikler til genlevering ved hjælp af en mikrofluidisk blandingsplatform

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

Lipid nanopartikler er udviklet ved hjælp af en mikrofluidisk blanding platform tilgang til mRNA og DNA indkapsling.

Abstract

Lipid-baserede lægemiddelbærere er blevet brugt til klinisk og kommercielt tilgængelige leveringssystemer på grund af deres lille størrelse, biokompatibilitet og høje indkapslingseffektivitet. Brug af lipid nanopartikler (LNPs) til at indkapsle nukleinsyrer er fordelagtigt at beskytte RNA eller DNA fra nedbrydning, samtidig med at fremme cellulære optagelse. LNPs indeholder ofte flere lipid komponenter, herunder en ioniserbar lipid, hjælper lipid, kolesterol, og polyethylen glykol (PEG) konjugeret lipid. LNPs kan let indkapsle nukleinsyrer på grund af den ioniserbare lipid tilstedeværelse, som ved lav pH er kationisk og giver mulighed for kompleksitet med negativt ladet RNA eller DNA. Her lnsulating messenger RNA (mRNA) eller plasmid DNA (pDNA) ved hjælp af hurtig blanding af lipid komponenter i en organisk fase og nukleinsyre komponent i en vandig fase. Denne blanding udføres ved hjælp af en præcis mikrofluidisk blandingsplatform, der giver mulighed for nanopartikler selvmontering, samtidig med at laminar flow opretholdes. Den hydrodynamiske størrelse og polydispersitet måles ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). Den effektive overfladeladning på LNP bestemmes ved at måle zetapotentialet. Indkapslingseffektiviteten er karakteriseret ved hjælp af et fluorescerende farvestof til at kvantificere fanget nukleinsyre. Repræsentative resultater viser, at denne metode er reproducerbarhed, og hvilken indflydelse forskellige formulerings- og procesparametre har på de udviklede LNP'er.

Introduction

Lægemiddelbærere bruges til at beskytte og levere en terapeutisk med typiske gunstige egenskaber, herunder lav cytotoksicitet, øget biotilgængelighed og forbedret stabilitet1,2,3. Polymere nanopartikler, micelles og lipidbaserede partikler er tidligere blevet undersøgt for nukleinsyreindkapsling og levering4,5,6,7. Lipider er blevet brugt i forskellige typer af nanocarrier systemer, herunder liposomer, og lipid nanopartikler, da de er biokompatiible med høj stabilitet8. LNPs kan let indkapsle nukleinsyrer til genlevering9,10. De beskytter nukleinsyren mod nedbrydning ved serumproceer under systemisk cirkulation11 og kan forbedre leveringen til bestemte steder, da overfladen topografi og fysiske egenskaber lnps påvirke deres biodistribution12. LNPs også forbedre væv penetration og cellulære optagelse9. Tidligere undersøgelser har vist succesen med siRNA-indkapsling inden for en LNP13, herunder den første kommercielt tilgængelige LNP, der indeholder siRNA terapeutisk til behandling af polyneuropati af arvelig transthyretin-medieret amyloidose14 behandling, der blev godkendt af United States Food and Drug Administration (FDA) og Det Europæiske Lægemiddelagentur i 2018. For nylig er LNPs ved at blive undersøgt til levering af større nukleinsyre moieties, nemlig mRNA og DNA9. Fra 2018 var der ~ 22 lipidbaserede nukleinsyreleveringssystemer, der gennemgår kliniske forsøg14. Derudover er mRNA indeholdende LNPs i øjeblikket førende kandidater og har været ansat til en COVID-19 vaccine15,16. Den potentielle succes for disse ikke-virale genterapier kræver dannelse af små (~ 100 nm), stabile og ensartede partikler med høj indkapsling af nukleinsyren.

Brug af en ionizable lipid som en hovedkomponent i LNP formuleringen har vist fordele for kompleksitet, indkapsling, og levering effciciency14. Ioniserbare lipider har typisk en syre dissociation konstant (pKa) < 7; for eksempel, dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), den ioniserbare lipid, der anvendes i FDA godkendt LNP formulering, har en pKa på 6,4417. Ved lav pH bliver amingrupperne på den ioniserbare lipid protoneret og positivt ladet, hvilket giver mulighed for samlingen med negativt ladede fosfatgrupper på mRNA og DNA. Forholdet mellem amin, "N", grupper til fosfat, "P", grupper bruges til at optimere samlingen. N/P-forholdet er afhængigt af de anvendte lipider og nukleinsyrer, som varierer afhængigt af formuleringen18. Efter dannelse kan pH-virksomheden justeres til en neutral eller fysiologisk pH-situation for at give mulighed for terapeutisk administration. Ved disse pH-værdier er den ioniserbare lipid også deprotoneret, hvilket giver lnp neutral overfladeladning.

Den ionizable lipid også hjælpemidler i endosomal flugt19,20. LNPs gennemgår endokytose under cellulær optagelse og skal frigives fra endosomet for at levere mRNA-lasten ind i cellens cytoplasma eller DNA-last til kernen21. Inde i endosomet er typisk et mere surt miljø end det ekstracellulære medium, hvilket gør den ioniserbare lipid positivt ladet22,23. Den positivt ladede ioniserbare lipid kan interagere med negative ladninger på den endosomale lipidmembran, som kan forårsage destabilisering af endosomet, der giver mulighed for frigivelse af LNP og nukleinsyre. Forskellige ioniserbare lipider er i øjeblikket ved at blive undersøgt for at forbedre effekten af både LNP distribution, samt endosomal flugt14.

Andre typiske komponenter i en LNP omfatter hjælper lipider, såsom en fosfattidylcholin (PC) eller fosfoethanolamin (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC), og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC) er almindeligt anvendte hjælper lipider24,25. DOPE har vist sig at danne en omvendt sekskantet II (HII) fase og forbedre transfection ved membran fusion26,mens DSPC er blevet anset for at stabilisere LNPs med sin cylindriske geometri27. Kolesterol er også indarbejdet i formuleringen for at øge membran stivhed, efterfølgende medvirken i stabiliteten af LNP. Endelig er lipid-konjugeret polyethylenglycol (PEG) inkluderet i formuleringen for at give den nødvendige steriske barriere for at hjælpe i partikel selvmontering27. PEG forbedrer også LNP'ernes lagerstabilitet ved at forhindre sammenlægning. Desuden er PEG ofte bruges som en stealth komponent og kan øge omsætningstiden for LNPs. Denne egenskab kan dog også give udfordringer for rekruttering af LNPs til hepatocytter gennem en endogen målretningsmekanisme drevet af apolipoprotein E (ApoE)28. Undersøgelser har således undersøgt acylkædelængden for diffusion af PEG fra LNP og fundet, at korte længder (C8-14) tager afstand fra LNP og er mere modtagelige for ApoE-rekruttering sammenlignet med længere acyllængder28. Endvidere har graden af mætning af lipidhale, som PEG er konjugeret til, vist sig at påvirke vævsfordelingen af LNPs29. For nylig, Tween 20, som er et almindeligt anvendt overfladeaktivt stof i biologiske lægemiddel produkt formuleringer og har en lang umættet fedtehale, viste sig at have høj transfection i dræning lymfeknuder i forhold til PEG-DSPE, som stort set transfected musklen på injektionsstedet29. Denne parameter kan optimeres for at opnå den ønskede LNP biodistribution.

Konventionelle metoder til dannelse af LNPs omfatter tyndfilmshydreringsmetoden og ethanolinjektionsmetoden27. Mens disse er let tilgængelige teknikker, de er også arbejdskrævende, kan resultere i lav indkapsling effektivitet, og er udfordrende at skalere op27. Fremskridt i blanding teknikker har resulteret i metoder mere modtagelige for at skalere op, samtidig med at udvikle mere ensartede partikler27. Disse metoder omfatter T-junction blanding, forskudt sildeben blanding, og mikrofluidisk hydrodynamisk fokus27. Hver metode har en unik struktur, men alle giver mulighed for hurtig blanding af en vandig fase, der indeholder nukleinsyren med en organisk fase, der indeholder lipidkomponenterne, hvilket resulterer i høj indkapsling af nukleinsyren27. I denne protokol anvendes hurtig og kontrolleret blanding gennem en mikrofluidisk patron, som anvender det forskudte sildebensblandingsdesign. Denne protokol beskriver forberedelse, samling og karakterisering af nukleinsyre indeholdende LNPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Der findes et skema over den samlede proces i figur 1.

1. Udarbejdelse af buffere

BEMÆRK: Steril filtrering af bufferne er stærkt foreslået her for at fjerne eventuelle partikler, der kan påvirke nukleinsyren og LNP-kvaliteten.

  1. Fosfat buffered saltvand (PBS)
    1. Forbered 1x PBS ved hjælp af 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl i nucleasefrit vand og juster pH til 7,4.
    2. Steriliseres ved vakuumfiltrering ved hjælp af et filter i 0,22 μm porestørrelse.
  2. Citrat buffer
    1. Citratbufferen forberedes med 5 mM natriumcitrat, 5 mM citronsyre og 150 mM natriumchlorid i nukleasefrit vand, og der justeres til pH 4.5.
    2. Steriliseres ved vakuumfiltrering ved hjælp af et filter i 0,22 μm porestørrelse.
      BEMÆRK: Citratbufferen skal kun fremstilles, hvis mRNA er den nukleinsyre, der indkapsles i LNP. Hvis DNA vil blive indkapslet springe 1,2 og gå videre til 1,3.
  3. Buffer til æblesyre
    1. Lavsyrebufferen fremstilles med 20 mM æblesyre og 30 mM natriumchlorid i nukleasefrit vand, og der justeres til pH 3.0.
    2. Steriliseres ved vakuumfiltrering ved hjælp af et filter i 0,22 μm porestørrelse.
      BEMÆRK: Æblesyrebufferen skal kun fremstilles, hvis DNA er den nukleinsyre, der vil blive indkapslet i LNP. Spring 1,3 over, hvis mRNA skal indkapsles. Citratbuffer anvendes til mRNA-indkapsling, da den lavere pH-fejl på 3.0 med æblesyrebuffer kan føre til øget sandsynlighed for mRNA-nedbrydning. Protokollen kan sættes på pause her.

2. Forberedelse af lipid mix

  1. Hvis bestanden lipider er i pulverform, opløses i ren 200 korrekt ethanol.
  2. Beregn den nødvendige blanding af lipidkomponenter baseret på det ønskede molarforhold. En molar ratio på 50:10:39:1 (ioniserbar lipid:helper lipid:kolesterol:PEG) vil blive brugt her som et eksempel for en samlet lipid koncentration på 10 mM. Tabel 1 viser de koncentrationer og mængder, der er nødvendige for hver af disse komponenter.
    BEMÆRK: Ved beregning af den volumen, der er nødvendig for at opnå lipidblandingskoncentrationen i ethanol (EtOH) for mikrofluidisk mixer, tages der højde for det samlede volumen for at sikre, at tilsætningen af EtOH ikke påvirker lipidkoncentrationerne. For eksempel beregnes et ioniserbart lipidvolumen på 68,5 μL ved at multiplicere 5 mM-koncentrationen i ethanol med et samlet lipidblandingsvolumen på 533 μL og derefter dividere med lagerlipidkoncentrationen på 38,9 mM.
  3. Tilsæt den passende mængde af hver lipid lageropløsning til et glas hætteglas for at tillade komponenter at blande med intermitterende vortexing. Der tilsættes 200 korrekt ethanol for en samlet blanding af 533 μL. For eksemplet i tabel 1er dette 254 μL ethanol.
    BEMÆRK: For en enkelt kørsel til fremstilling af 1 mL LNPs er der behov for 342,5 μL lipidopløsning. Dette skyldes en 3:1 blanding af vandig nukleinsyre til organisk lipidopløsning med en vis volumen kasseret før og efter prøveindsamling. Der laves en blanding af 533 μL for at kompensere for oversvind.

3. Fremstilling af nukleinsyreopløsning

BEMÆRK: Tilberedning og håndtering af nukleinsyreopløsninger skal udføres i et sterilt og RNasefrit miljø, hvor det er muligt. Arbejd i et biosikkerhedskab, når det er muligt med nukleinsyren.

  1. Beregn I/P-forhold. N/P-forholdet er det samlede antal ioniserbare lipidamingrupper (N) til det samlede antal negativt ladede nukleinsyrephosphatgrupper (P). N/P-forholdet er ofte en parameter, der kan optimeres under LNP-formation. Følg nedenstående trin.
    1. Beregn antallet af N-enheder ved hjælp af nedenstående formel:
      Equation 1
      BEMÆRK: Den ioniserbare lipidkoncentration (tabel 1) er 5 mM, hvilket svarer til 5 x 10-6 mol/mL. Det krævede lipidinjektionsvolumen er 0,3425 mL. For eksempel, hvis antallet af N-enheder pr molekyle er 1, ved hjælp af ovenstående ligning, er der 1,03 x 1018 N enheder i lipid mix.
    2. Beregn P-enhederne for det ønskede I/P-forhold. Her bruges en N/P = 36 f.eks.
      Equation 2
  2. Beregn den nødvendige nukleinsyrekoncentration for at opnå 2,86 x 1016 P enheder ved hjælp af nedenstående ligning.
    Equation 3
    Hvor, antallet af P-enheder pr base par for mRNA er 1 og DNA er 2. For et mRNA med 1.200 baser er den mængde mRNA, der kræves til en N /P = 36, 3,96 x 10-11 mol.
  3. Massekoncentrationen af mRNA, der kræves til N/P = 36, ved hjælp af nedenstående ligning.
    Equation 4
    Den gennemsnitlige molekylvægt af en ribonukleotid monophosphat enhed er 322 g/mol30. Med 1.200-base mRNA er mRNA'ens molekylvægt 386.400 g/mol. Den krævede injektionsvolumen af nukleinsyreopløsning er 1,028 mL. Koncentrationen af mRNA er således 1,488x10-5 g/mL, hvilket er 14,88 μg/mL.
  4. Der fyldes 1,5 mL 14,88 μg/mL mRNA i citratbuffer.
    BEMÆRK: Når DNA vil være nukleinsyre indkapslet, skal du bruge æblesyre buffer til at udgøre nukleinsyreopløsningen.

4. Priming de mikrofluidiske kanaler

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra instrumentproducentens retningslinjer.

  1. Indtast primingparametrene i instrumentsoftwaren ved at klikke på de relevante felter (Tabel 2).
    BEMÆRK: Et flowforhold på 3:1 og strømningshastighed på 4-12 mL/min anbefales27,31 . Dette har vist sig at være optimalt i de undersøgelser, der præsenteres her, såvel som af producenten. Dette kan varieres, hvis det er af interesse for ansøgningen.
  2. Åbn instrumentlåget, og sæt en mikrofluidisk patron i den roterende blok.
  3. Træk mindst 0,5 mL ethanol i en 1 mL sprøjte, hvilket sikrer, at der ikke er bobler eller lufthuller ved sprøjtespidsen. Læg sprøjten i patronens højre indløb.
  4. Fyld en 3 mL sprøjte med 1,5 mL vandig buffer (citrat for RNA og æblesyre til DNA), hvilket sikrer, at der ikke er luftbobler eller huller. Læg sprøjten i patronens venstre indløb.
  5. Sæt to 15 ML koniske rør i klipholderne for at fungere som affaldsbeholdere.
  6. Klik på Kør i instrumentsoftwaren for at starte blandingen, så parametrene er input korrekt.
  7. Når instrumentet holder op med at være priming, angivet med det nederste blå lys, der slukker, skal låget åbnes og bortskaffes de koniske rør og sprøjter korrekt.

5. LNP dannelse

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra instrumentproducentens retningslinjer.

  1. Opdater softwaren med formuleringsparametrene ved at klikke på de relevante felter (Tabel 2).
  2. Fyld en 1 mL sprøjte med lipidblandingen (tilberedt i trin 2). Fjern eventuelle lufthuller eller bobler ved sprøjtespidsen, og sæt sprøjten i højre side af patronen.
  3. Træk nukleinsyreopløsningen (fremstillet i trin 3) i en 3 mL-sprøjte, så der ikke er bobler eller lufthuller i sprøjtespidsen. Sæt sprøjten i patronens venstre indløb.
    BEMÆRK: Der leveres mængder til at lave en 1 mL-løsning af LNPs. Dette instrument kan indeholde sprøjtestørrelser på op til 10 mL, og mængderne kan skaleres i overensstemmelse hermed uden indflydelse på resultatet. Den maksimale mængde LNPs, der kan fremstilles i et præparat, er 12 mL.
  4. Mærk et 15 mL RNase-fri konisk rør med prøvenavnet, og sæt det i venstre rørclips. Placer en 15 mL affald koniske i højre rør klip.
  5. Luk instrumentlåget, og klik på Kør, når du har bekræftet korrekt input af parametre.
  6. Når instrumentet er færdigt med at køre, skal affaldsbeholderen og patronen kasseres korrekt. Bevar det koniske rør med LNP-prøven.
  7. Fortynd LNP 5x med PBS for at minimere ethanolen til <5% (v/v).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at fortynde LNPs i PBS så hurtigt som muligt efter mikrofluidisk blanding for at forhindre nedbrydning. Udfør altid fortyndingen i et biosikkerhedskab og fortsætter med at arbejde i biosikkerhedsskabet under hele bufferudvekslingerne.

6. Bufferudveksling

BEMÆRK: Der findes protokol til brug af ultracentrifugefiltre. Mens denne metode resulterer i en mere tidseffektiv udveksling af buffere, kan dialyse erstattes her.

  1. Forvask et ultracentrifugfilter (100 kDa porestørrelse) med 2 mL PBS ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min. Tøm PBS'en fra det nederste rum.
    BEMÆRK: PBS er valgt til at øge pH til 7,4 ± 0,2, hvilket er fysiologisk relevant og vil resultere i, at den ioniserbare lipid har en neutral ladning.
  2. Tilsæt fortyndede LNPs til det øverste rum i det forvaskede ultracentrifugefilter og centrifuge ved 1000 x g i 12 min.
  3. Kassér gennemstrømningen fra det nederste rum. Udfør yderligere to vaske ved at tilføje 5 mL PBS til ultracentrifugefilteret hver gang. Centrifuge på samme parametre. Der er ingen maksimal lydstyrke, der skal opretholdes.
    BEMÆRK: Hvis der blev udarbejdet en opskaleret mængde LNPs, skal du øge mængden af PBS for hver vask i overensstemmelse hermed. For eksempel, hvis 2 mL lnps blev udarbejdet i en enkelt køre, derefter 10 mL PBS per vask foreslås.
  4. Pipette LNP opløsning mod væggene i ultra-centrifuge filter et par gange for at minimere LNP tab. Fjern LNP-opløsningen fra ultracentrifugfilteret, og opbevar det i et nukleasefrit hætteglas. Tilføj PBS, hvis det er nødvendigt for at opnå en endelig mængde lnp-opløsning på 1 mL.
  5. Filtrer det i forvingsfilteret på 0,2 μm, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

7. Mål indkapslingseffektivitet

  1. Forbered en standardkurve ved at lave 2 gange serielle fortyndinger af fungerende nukleinsyreopløsning i PBS, begyndende med en højeste koncentration på 500 ng/mL og fremstilling af mindst fem fortyndinger. Brug PBS som tom.
  2. Forbered LNP-prøvefortyndingerne. Fortynd LNP prøver med PBS, for at opnå en omtrentlig teoretisk koncentration, der ligger omkring midten af standardkurven (f.eks ~ 250 ng/mL af nukleinsyre anslået fra den oprindelige koncentration).
  3. Forbered en opløsning af RNA kvantificering reagens (for mRNA målinger) med TritonX-100 at forstyrre LNPs og måle den samlede mængde af nukleinsyre i og uden for LNP. Denne løsning indeholder 0,5% (v/v) RNA reagens, 0,4% (v/v) TritonX-100 og 99,1% (v/v) PBS.
  4. Forbered en opløsning af reagenset uden TritonX-100 for at måle mængden af nukleinsyre, der ikke er indkapslet i LNPs. Denne løsning indeholder 0,5% (v/v) RNA reagens og 99,5% (v/v) PBS.
    BEMÆRK: Hvis LNPs indkapsler dobbeltstrenget DNA (dsDNA), såsom plasmid DNA, skal du bruge dsDNA reagenset i 7.3 og 7.4 i stedet efter samme procedure.
  5. I en 96-brønd sort fluorescens stand plade, indlæse mindst fire gentagelser af hver af LNP og nukleinsyre standardopløsninger fremstillet i 7,1 og 7,2.
  6. Til halvdelen af kopierne af standarder og prøver tilsættes et tilsvarende volumen af reagenset, der indeholder TritonX-100. Dette vil kvantificere den samlede mængde nukleinsyre.
  7. Til de resterende brønde af standarder og prøver, tilsæt en lige stor mængde af reagenset uden TritonX-100. Dette vil kvantificere mængden af nukleinsyre, der ikke er indkapslet inde i LNP.
  8. Ryst pladen i 5 min ved stuetemperatur for at sikre grundig blanding af standarder og prøver med det tilsatte reagens, idet der træffes forholdsregler for at undgå lyseksponering.
  9. Mål fluorescensen ved hjælp af en mikropladelæser med en excitationsbølgelængde på 480 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm.
  10. Koncentrationen af nukleinsyre uden for LNP beregnes ved hjælp af standardkurven, der er lavet med tilsætning af reagenset uden TritonX-100. Multiplicer med den fortyndingsfaktor, der anvendes i 7,2.
  11. Koncentrationen af nukleinsyre både i og uden for LNP beregnes ved hjælp af standardkurven, der er lavet med tilsætning af reagenset, der indeholder TritonX-100. Multiplicer med den fortyndingsfaktor, der anvendes i 7,2.
  12. Koncentrationen af nukleinsyre indeni beregnes ved at trække koncentrationen af nukleinsyre udenfor (beregnet fra trin 7.10) fra den samlede koncentration af nukleinsyre både inde og ude (beregnet fra trin 7.11)
  13. Kvantificer indkapslingseffektiviteten fra forholdet mellem koncentrationen af nukleinsyre inde i LNP (beregnet fra trin 7.12) og den samlede koncentration af nukleinsyre (beregnet fra trin 7.11).
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

8. Koncentrationsjusteringer

  1. Hvis det er nødvendigt, justeres nukleinsyrekoncentrationen i LNP-opløsningen ved hjælp af resultaterne fra indkapslingseffektiviteten.
  2. Hvis der ønskes en mindre koncentreret opløsning, fortyndes opløsningen med PBS for at opnå den ønskede koncentration.
  3. Hvis der ønskes en mere koncentreret opløsning, skal du udføre ekstra centrifugeringskørsler ved hjælp af et ultracentrifugfilter.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

9. Mål LNP hydrodynamisk størrelse og polydispersitet

  1. Fortynd en aliquot af LNP-opløsningen 40x med PBS for at opnå et endeligt volumen på 1 mL.
    BEMÆRK: Denne fortynding kan ændres, hvis det er nødvendigt. Denne fortyndingsværdi foreslås, da den bruger en lille mængde lnp-lagerløsning, samtidig med at den giver kvalitetsresultater.
  2. Ved hjælp af en semi-mikro cuvette, måle den hydrodynamiske diameter og polydispersitet indeks. Tilsæt LNP-opløsningen i cuvette og sæt ind i instrumentet. Konfigurer en betjeningsprocedure i instrumentsoftwaren til at omfatte måletypen, prøvedetaljer (materiale, dispergeringsmiddel, temperatur og celletype) og måleinstruktioner (antal kørsler). Klik på Start, når du er klar til at starte målingsopsamlingen.

10. Mål LNP zeta potentiale

  1. Fortynd en aliquot af LNP-opløsningen 40x med nukleasefrit vand for at opnå et endeligt volumen på 1 mL.
    BEMÆRK: Nukleasefrit vand anvendes som opløsningsmiddel til zeta potentielle målinger for at minimere påvirkningen af høje saltbuffere på ledningsevnen.
  2. Ved hjælp af en foldet kapillær zeta celle, måle zeta potentiale.
    1. Tilsæt LNP-opløsningen i cuvette op til påfyldningslinjen. Sæt ind i instrumentet for at sikre, at elektroderne kommer i kontakt med instrumentet.
    2. Konfigurer en betjeningsprocedure i instrumentsoftwaren til at omfatte måletypen, prøvedetaljer (materiale, dispergeringsmiddel, temperatur og celletype) og måleinstruktioner (antal kørsler). Klik på Start, når du er klar til at starte målingsopsamlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere partier lnps med samme lipidformulering og N/P-forhold på 6 blev udviklet på separate dage for at demonstrere reproducerbarhed af teknikken. Parti 1 og 2 resulterede i overlappende størrelsesfordelinger med tilsvarende polydispersitet (figur 2A) Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i størrelsen eller indkapslingseffektiviteten mellem de to forskellige partier (figur 2B). Indkapslingseffektiviteten var høj for hvert parti (>98,5%), og størrelserne var ens med en 77 nm LNP diameter. Partiklerne var ensartede med et gennemsnitligt polydispersitetsindeks (PDI) på 0,15 for parti 1 og 0,18 for parti 2.

Ændringer i formuleringsparametre viste nogle små, men statistisk signifikante forskelle med hensyn til N /P-forholdet, ioniserbar lipid, der blev brugt, og nukleinsyre indkapslet. Mens forskelle diskuteres, er det vigtigt at bemærke, at alle LNPs dannet resulterede i indkapsling større end 80%, med de fleste formuleringer større end 95%, og partikelstørrelser mindre end 110 nm, hvilket gør alle formuleringer udviklet her ønskeligt for genlevering. For det første blev ionizable lipid A brugt til at udvikle LNPs på en N / P på 10 og 36. En reduktion af N/P-forholdet resulterede i et fald på 4 % i indkapslingseffektiviteten og en forøgelse af lnps hydrodynamiske diameter fra 98 nm ved N/P = 36 til 109 nm ved N/P = 10 (Figur 3A). Sammenligning af LNPs med ioniserbar lipid A til en anden ioniserbar lipid B og opretholdelse af N / P på 36 resulterede i en betydelig ændring i indkapslingseffektiviteten, hvor 100% af pDNA blev indkapslet med LNPs dannet ved hjælp af ioniserbare lipid A og 81% af pDNA blev indkapslet med LNPs dannet ved hjælp af ionizable lipid B (Figur 3B). Ioniserbare lipid B LNPs resulterede også i lidt mindre partikler med en hydrodynamisk diameter på 95 nm. Endelig blev LNPs dannet ved hjælp af ionizable lipid A med både mRNA og pDNA. LNPs indkapsling pDNA resulterede i større partikler med en diameter på 119 nm sammenlignet med mRNA LNPs med en diameter på 91 nm (Figur 3C). Både pDNA og mRNA LNPs resulterede i lignende indkapsling effektivitet på ~ 91-94%.

Endelig påvirkede ændringer i flowhastighedsprocesparameteren ikke de LNP'er, der blev udviklet ved de strømningshastigheder, der blev testet her. Ved både 4 mL/min og 12 mL/min blev LNPs udviklet og karakteriseret ved at have indkapslet 96 % af pDNA og har en diameter på 110 nm (figur 4). Alle LNPs uanset procesparameter eller formuleringsparameter resulterede i ladeneutrale zeta potentielle målinger.

Figure 1
Figur 1: Lnp-udviklings- og karakteriseringsarbejdsgang. For det første fremstilles lipidblanding og nukleinsyreopløsninger (1 og 2). Lipidblandingen indeholder den ioniserbare lipid, hjælper lipid, kolesterol og PEG i ethanol, mens nukleinsyreopløsningen indeholder enten mRNA eller DNA i buffer. Opløsningerne blandes ved hjælp af en mikrofluidisk patron (3), som danner LNPs (4). Dernæst kræves der en bufferudveksling for at fjerne ethanolen og øge opløsningen pH til neutral (5). Karakterisering af LNPs udføres for at bestemme indkapsling effektivitet og partikelstørrelse, polydispersitet, og zeta potentiale ved hjælp af en fluorescens mikroplade assay og zetasizer, henholdsvis (6 og 7). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Batch til batch reproducerbarhed af LNPs dannet på separate dage. (A) Størrelsesfordelinger for batch 1 vs. batch 2 (B) Indkapslingseffektivitet (%) og hydrodynamisk diameter (nm) for hvert parti med mRNA og N/P = 6. Fejllinjer bemærk standardafvigelse. Statistisk analyse ved hjælp af tovejs ANOVA med α = 0,05 viser ingen betydning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Variationer af formuleringsparametre. (A) LNPs dannet ved N/P = 10 og 36 begge ved hjælp af ioniserbar lipid A med pDNA. (B) LNPs dannet med ionizable lipid A og ionizable lipid B både ved N / P = 36 med pDNA. (C) LNPs dannet med enten mRNA eller pDNA begge ved hjælp af ioniserbare lipid C ved N / P = 6. Fejllinjer bemærk standardafvigelse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af tovejs ANOVA med α = 0,05; *s<0.05; **p<0.01; s<0.001; s<0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Variationer af procesparametre. LNPs dannet med en strømningshastighed på 4 og 12 mL/min ved hjælp af ioniserbar lipid A med pDNA ved N/P = 10. Fejllinjer bemærk standardafvigelse. Statistisk analyse ved hjælp af tovejs ANOVA med α = 0,05 viser ingen betydning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Lipid Molar-forhold Stock lipid koncentration (mM) Koncentration i ethanol til lipidblanding (mM) Volumen (μL)
Ionizable lipid 50 38.9 5 68.5
Helper lipid 10 10 1 53.3
Kolesterol 39 20 3.9 103.9
C-14 PIND 1 1 0.1 53.3
EtOH 254
Total 533

Tabel 1: Eksempel lipid mix til at forberede 1 mL lnps. Lipid lagerkoncentrationer i ethanol forudsat har vist sig at give mulighed for lipider til at opløses i ethanol, men andre bestand koncentrationer kan udnyttes og vil ikke påvirke resultatet, så længe lipid er solubilized. Der er også eksempler på koncentrationer af lipider i ethanol til mikrofluidisk blanding. Disse koncentrationer er baseret på molarforholdet, som kan varieres baseret på det ønskede LNP-præparat.

Priming Formulering
Lydstyrke (mL) 2 1.37
Flowhastighedsforhold (vandig:etOH) 3:1 3:1
Samlet flowhastighed (minut/min) 12 4
Venstre sprøjtestørrelse (mL) 3 3
Højre sprøjtestørrelse (mL) 1 1
Start affaldsvolumen (mL) 0.35 0.25
Slutspildvolumen (mL) 0.05 0.05

Tabel 2: Mikrofluidisk blanding benchtop instrument software priming og LNP formulering eksempel parametre

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Reproducerbarhed, hastighed og lavvolumenscreening er betydelige fordele ved at bruge mikrofluidisk blanding til at danne LNPs sammenlignet med andre eksisterende metoder (f.eks. lipidfilmhydrering og ethanolinjektion). Vi har vist reproducerbarheden af denne metode uden indvirkning på indkapslingseffektivitet eller partikelstørrelse observeret med forskellige LNP-partier. Dette er et væsentligt kriterium for, at alle terapeutiske, herunder LNP'er, bliver klinisk tilgængelige.

Den teknik, der er beskrevet her beskæftiger forskudt sildeben mikrofluidisk blanding, hvilket resulterer i LNP dannelse på tidsskalaen på kun et par minutter. Denne blanding bruger kaotiske udsættelse, som er fordelagtigt for blanding kontrol og forkortet tid27. Denne mixer gør det muligt for vandige og organiske faser til effektivt wrap omkring hinanden27. Ved hjælp af den forskudte sildebensblanding har tidligere undersøgelser vist, at partiklerne dannes ved den mindste termodynamisk stabile størrelse32, hvilket betyder, at sammensætningen har tendens til at påvirke størrelsen og polydispersiteten af LNPs27,32,33. Dette blev observeret i de repræsentative resultater, hvor N/P-forholdet, den ioniserbare lipid, og nukleinsyre indkapslet, var de påvirker faktorer på ændringer i indkapslingseffektivitet og partikelstørrelse. Driftsparametre, såsom strømningshastighed og blandingsforhold, kan også påvirke størrelsen over en bestemt tærskel, hvor partikelstørrelsen bagefter er på sin mindste stabile størrelse27,33. Der blev ikke observeret nogen ændring i indkapslingseffektiviteten eller partikelstørrelsen, når der blev anvendt en strømningshastighed på 4 mL/min vs. 12 mL/min. Det er således sandsynligt, at begge flowhastigheder ligger over den tærskel, der vil påvirke LNP-resultatet. Eksemplet eksperiment, og resultater beskrevet ovenfor, anvendes lipid A og pDNA. Det er muligt, at forskellige ioniserbare lipider og nukleinsyrer kan have større indflydelse på LNP-egenskaber med hensyn til strømningshastighed. Andre typer af mikrofluidisk blanding omfatter T-junction, som bruger turbulent flow og mikrofluidisk hydrodynamisk fokuseringsmetode, der er baseret på sammenvævende-diffusiv blanding27. Sammenlignet med disse andre typer af mikrofluidiske blanding teknikker til LNP udvikling, den forskudte sildeben blanding muliggør kombinationen af tre vigtige kriterier: hurtig blanding, minimere batch til batch variabilitet, og er kommercielt tilgængelig27. Alle tre mikrofluidiske blandingsmetoder giver mulighed for højere indkapslingseffektivitet og kontrolleret størrelse sammenlignet med konventionel lipidfilmhydrering eller ethanolindsprøjtningsmetoder27.

Endelig er evnen til at producere lave mængder af forskellige LNP formuleringer på forsknings- og udviklingsfasen en betydelig fordel. En udfordring ved at udvikle LNPs er antallet af variabler, der kan testes og optimeres pr formulering for at opnå det ønskede resultat og effektivitet. Lipider og nukleinsyrer kan være omkostningsoverkommelige for at screene, fejlfinde og ændre mange formuleringsparametre (f.eks. molarforhold, N/P-nøgletal, procesparametre osv.) for at finde den mest egnede LNP til en given applikation. Mens lave mængder kan være en begrænsning for at producere en endelig formulering i stor skala, er evnen til at skalere teknikken op med større mikrofluidiske blandingsinstrumenter kommercielt tilgængelig.

Kritiske trin i protokollen starter med korrekt opbevaring af lipid lagerløsninger på producentens anbefaling. LNPs skal derefter opbevares ved 2-8 °C, indtil de anvendes yderligere. For nukleinsyrepræparatet viser de fremlagte resultater, at citratbuffer og æblesyrebuffer er effektive til at danne LNPs med høj nukleinsyreindkapsling34,35. Andre buffere kan i stedet anvendes, hvis det ønskes. Hvis der vælges en anden buffer, er det vigtigt at opretholde pH under pKa af den ionizable lipid for at sikre, at lipiden er kationisk og kan kompleks med nukleinsyren. Når du bruger det mikrofluidiske blandingsinstrument, er det vigtigt at prime patronen før LNP-formationen, ikke at overskride patronens brug som anbefalet af producenten og at ændre patronen mellem forskellige formuleringssammensætninger. Det mest almindelige flowforhold for dannelse af vandige: organisk opløsning er 3:1; Dette kan dog ændres, hvis det er nødvendigt. Strømningshastigheden kan også justeres efter behov. Endelig er det vigtigt, når du arbejder med mRNA for at sikre et RNase-frit miljø gennem hele processen. Hvis den ønskede størrelse eller indkapsling effektivitet ikke opnås, nogle steder at begynde fejlfinding omfatter at ændre N / P forholdet brugt eller lipid molar procenter. Instrumentprocessen, der er beskrevet her, bruger en bordplademodel, der har en maksimal volumengrænse på 12 mL, selvom denne proces kan skaleres til større mængder ved hjælp af forskellige mikrofluidiske blandingsmodeller. Denne proces kan tilpasses ændringer i lipidblandinger og nukleinsyrer til brug i udviklingen af LNPs til forskellige kliniske indikationer. Med denne fleksibilitet kan der opnås mange fremtidige anvendelser med LNP'er til at producere forskellige ønskede formuleringer. Denne teknik er også blevet brugt til at udvikle andre typer nanopartikler, herunder liposomer og polymere nanopartikler. Med nogle parameterændringer kan denne metode bruges til en række nanopartikler formuleringer.

Protokollen detaljeret her beskriver en reproducerbar metode til at opnå mRNA eller DNA indkapslet LNPs. Ud over procesparametre kan yderligere overvejelser påvirke LNP-resultatet. Tidligere arbejde har også brugt lignende metoder til at producere LNPs med forskellige nukleinsyrer, ioniserbare lipider, N / P nøgletal, PEG linker længde, osv. Disse parametre kan påvirke indkapslingseffektiviteten, størrelsen og ladningen af partiklerne. Instrumentproducenten har også bemærket lignende ændringer afhængigt af disse parametre, der kan optimeres18,36. Disse parametre kan yderligere påvirke biodistributionen og effekten af nukleinsyren. For eksempel har undersøgelser undersøgt kulbrintekædelængder (C14, C16 og C18), der er bøjet til PEG, og fundet ud af, at den kortere acylkæde af C14 resulterede i højere niveauer af leveroptagelse sammenlignet med den længere acylkæde, som forblev i omløb i en længere periode28. Denne protokol giver mulighed for dannelse, optimering og test af LNPs med varierede kompositioner, hvilket gør dette til en alsidig proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er ansatte i Sanofi. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt eller konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Tak til Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger og Philip Zakas for deres vejledning og bidrag til LNP udvikling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Tags

Bioengineering Udgave 168 lipid nanopartikler nukleinsyre messenger RNA DNA mikrofluidisk forskudt sildeben mixer
Formulering og karakterisering lipid nanopartikler til genlevering ved hjælp af en mikrofluidisk blandingsplatform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P.,… More

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter