Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formulera och karakterisera Lipid Nanopartiklar för genleverans med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

Lipidnanopartiklar utvecklas med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform för mRNA- och DNA-inkapsling.

Abstract

Lipidbaserade läkemedelsbärare har använts för kliniskt och kommersiellt tillgängliga leveranssystem på grund av deras lilla storlek, biokompatibilitet och höga inkapslingseffektivitet. Användning av lipidnanopartiklar (LNPs) för att kapsla in nukleinsyror är fördelaktigt för att skydda RNA eller DNA från nedbrytning, samtidigt som cellulärt upptag främjas. LNPs innehåller ofta flera lipidkomponenter inklusive en joniserbar lipid, hjälpare lipid, kolesterol och polyetylenglykol (PEG) konjugerad lipid. LNPs kan lätt kapsla in nukleinsyror på grund av den joniserbara lipidförekomsten, som vid lågt pH-upphetsningsmedel och möjliggör hy med negativt laddat RNA eller DNA. Här bildas LNPs genom att kapsla in budbärar-RNA (mRNA) eller plasmid-DNA (pDNA) med snabb blandning av lipidkomponenterna i en organisk fas och nukleinsyrakomponenten i en vattenfas. Denna blandning utförs med hjälp av en exakt mikrofluidisk blandningsplattform, vilket möjliggör självmontering av nanopartiklar samtidigt som laminärt flöde bibehålls. Den hydrodynamiska storleken och polydispersiteten mäts med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS). Den effektiva ytladdningen på LNP bestäms genom att mäta zetapotentialen. Inkapslingseffektiviteten kännetecknas av ett fluorescerande färgämne för att kvantifiera inspädd nukleinsyra. Representativa resultat visar reproducerbarheten av denna metod och det inflytande som olika formulerings- och processparametrar har på de utvecklade LNP: erna.

Introduction

Läkemedelsbärare används för att skydda och leverera en terapeutisk med typiska gynnsamma egenskaper inklusive låg cytotoxicitet, ökad biotillgänglighet och förbättrad stabilitet1,2,3. Polymera nanopartiklar, micelles och lipidbaserade partiklar har tidigare undersökts för nukleinsyrainkapsling ochleverans 4,5,6,7. Lipider har använts i olika typer av nanokarriersystem, inklusive liposomer, och lipidnanopartiklar, eftersom de är biokompatierbara medhög stabilitet 8. LNPs kan lätt kapsla in nukleinsyror för genleverans9,10. De skyddar nukleinsyran från nedbrytning genom serumproteaser undersystemcirkulationen 11 och kan förbättra leveransen till specifika platser, eftersom LNPs yttopografi och fysiska egenskaper påverkar deras biodistribution12. LNPs förbättrar också vävnad penetration och cellulär upptag9. Tidigare studier har visat framgången för siRNA-inkapsling inom en LNP13, inklusive den första kommersiellt tillgängliga LNP som innehåller siRNA terapeutisk för behandling polyneuropati av ärftlig transthyretin-medierad amyloidos14-behandling som godkändes av United States Food and Drug Administration (FDA) och European Medicines Agency 2018. På senare tid studeras LNPs för leverans av större nukleinsyramoieties, nämligen mRNA och DNA9. Från och med 2018 fanns det ~ 22 lipidbaserade nukleinsyraleveranssystem som genomgår kliniska prövningar14. Dessutom är mRNA som innehåller LNPs för närvarande ledande kandidater och har varit anställda för ett COVID-19-vaccin15,16. Den potentiella framgången för dessa icke-virala genterapier kräver att man bildar små (~ 100 nm), stabila och enhetliga partiklar med hög inkapsling av nukleinsyran.

Användning av en joniserbar lipid som huvudkomponent i LNP-formuleringen har visat fördelar för hy, inkapsling och leveranseffektivitet14. Joniserbara lipider har vanligtvis en syra dissociation konstant (pKa) < 7; till exempel har dilinoleylmetyl-4-dimetyllaminobutyrat (D-Lin-MC3-DMA), den joniserbara lipid som används i den FDA-godkända LNP-formuleringen, en pKa på 6,4417. Vid lågt pH blir aminegrupperna på joniserbara lipid protonerade och positivt laddade, vilket möjliggör montering med negativt laddade fosfatgrupper på mRNA och DNA. Förhållandet mellan amin, "N", grupper till fosfat, "P", grupper används för att optimera enheten. N/P-förhållandet är beroende av de lipider och nukleinsyror som används, vilket varierar beroende på formuleringen18. Efter bildandet kan pH-h justeras till ett neutralt eller fysiologiskt pH för att möjliggöra terapeutisk administrering. Vid dessa pH-värden avprotoneras också den joniserbara lipiden som ger neutral ytladdning till LNP.

Den joniserbara lipiden hjälper också till i endosomal flykt19,20. LNPs genomgår endocytos under cellulärt upptag och måste släppas ut från endomen för att leverera mRNA-lasten till cellcytoplasman eller DNA-lasten till kärnan21. Inuti endosomen är vanligtvis en surare miljö än det extracellulära mediet, vilket gör den joniserbara lipiden positivt laddad22,23. Den positivt laddade joniserbara lipiden kan interagera med negativa laddningar på det endosomala lipidmembranet, vilket kan orsaka destabilisering av endosomen som möjliggör frisättning av LNP och nukleinsyra. Olika joniserbara lipider studeras för närvarande för att förbättra effektiviteten av både LNP-distribution, liksom endosomal escape14.

Andra typiska komponenter i en LNP inkluderar hjälpare lipider, såsom en fosfatidylkolin (PC) eller fosfoethanolamine (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn -glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) används ofta hjälpare lipider24,25. DOPE har visat sig bilda en inverterad sexkantig II (HII) fas och förbättra transfection av membran fusion26, medan DSPC har tänkts stabilisera LNPs med sin cylindriska geometri27. Kolesterol ingår också i formuleringen för att öka membranstelheten och därefter bidra till LNP: s stabilitet. Slutligen ingår lipidkonjugerad polyetylenglykol (PEG) i formuleringen för att ge den nödvändiga steriska barriären för att underlätta partikelns självmontering27. PEG förbättrar också lagringsstabiliteten hos LNP:er genom att förhindra aggregering. Dessutom används PEG ofta som en stealth-komponent och kan öka cirkulationstiden för LNPs. Detta attribut kan dock också innebära utmaningar för rekrytering av ache-adresser till hepatocyter genom en endogen målmekanism som drivs av apolipoprotein E (ApoE)28. Studier har således undersökt alamylkedjelängden för diffusion av PEG från LNP och funnit att korta längder (C8-14) avviker från LNP och är mer mottagliga för ApoE-rekrytering jämfört med längre ayllängder28. Vidare har graden av mättnad av lipidsvansen som PEG är konjugerad till visat sig påverka vävnadsfördelningen av LNPs29. Nyligen visade sig Tween 20, som är ett vanligt tensid i biologiska läkemedelsformuleringar och har en lång omättad lipidsvans, ha hög transfektion i dränerande lymfkörtlar jämfört med PEG-DSPE, som till stor del transfekterade muskeln vid injektionsstället29. Denna parameter kan optimeras för att uppnå önskad LNP-biodistribution.

Konventionella metoder för att bilda LNPs inkluderar tunnfilmshydreringsmetoden och etanolinjektionsmetoden27. Även om dessa är lättillgängliga tekniker, är de också arbetsintensiva, kan resultera i låg inkapslingseffektivitet och är utmanande att skala upp27. Framsteg inom blandningsteknik har resulterat i metoder som är mer mottagliga för att skala upp, samtidigt som mer enhetliga partiklar27. Dessa metoder inkluderar T-junction blandning, förskjutna fiskben blandning och mikrofluidic hydrodynamiskafokusering 27. Varje metod har en unik struktur, men alla möjliggör snabb blandning av en vattenfas som innehåller nukleinsyran med en organisk fas som innehåller lipidkomponenterna, vilket resulterar i hög inkapsling av nukleinsyran27. I detta protokoll används snabb och kontrollerad blandning genom en mikrofluidisk patron, som använder den förskjutna fiskbensblandningsdesignen. Det här protokollet beskriver förberedelse, sammansättning och karakterisering av nukleinsyra som innehåller LNPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett schema över den övergripande processen finns i figur 1.

1. Utarbetande av buffertar

OBS: Steril filtrering av buffertarna föreslås här starkt för att ta bort eventuella partiklar som kan påverka nukleinsyran och LNP-kvaliteten.

  1. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
    1. Förbered 1x PBS med 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl och 2,7 mM KCl i nukleasfritt vatten och justera pH till 7,4.
    2. Sterilisera genom vakuumfiltrering med ett filter i 0,22 μm porstorlek.
  2. Citratbuffert
    1. Förbered citratbuffert med 5 mM natriumcitrat, 5 mM citronsyra och 150 mM natriumklorid i nukleasfritt vatten och justera till pH 4,5.
    2. Sterilisera genom vakuumfiltrering med ett filter i 0,22 μm porstorlek.
      OBS: Citratbuffert behöver endast beredas om mRNA är den nukleinsyra som kommer att kapslas in i LNP. Om DNA kommer att kapslas in, hoppa över 1,2 och fortsätt till 1,3.
  3. Malinsyrabuffert
    1. Förbered äppelsyrabuffert med 20 mM äppelsyra och 30 mM natriumklorid i nukleasfritt vatten och justera till pH 3.0.
    2. Sterilisera genom vakuumfiltrering med ett filter i 0,22 μm porstorlek.
      OBS: Malinsyrabuffert behöver endast beredas om DNA är den nukleinsyra som ska kapslas in i LNP. Hoppa över 1,3 om mRNA ska kapslas in. Citratbuffert används för mRNA-inkapsling, eftersom det nedre pH-talet på 3, 0 med malinsyrabuffert kan leda till en ökad sannolikhet för mRNA-nedbrytning. Protokollet kan pausas här.

2. Beredning av lipidblandning

  1. Om lagerfetter är i pulverform, löslig i ren 200-korrekt etanol.
  2. Beräkna den önskade blandningen av lipidkomponenter baserat på önskat molarförhållande. Ett molarförhållande på 50:10:39:1 (joniserbar lipid:helper lipid:kolesterol:PEG) kommer att användas här som ett exempel för en total lipidkoncentration på 10 mM. Tabell 1 visar de koncentrationer och volymer som behövs för var och en av dessa komponenter.
    OBS: Vid beräkning av den volym som behövs för att uppnå lipidblandningskoncentrationen i etanol (EtOH) för den mikrofluidiska blandaren, redovisas den totala volymen för att säkerställa att tillsatsen av EtOH inte påverkar lipidkoncentrationerna. Till exempel beräknas en joniserbar lipidvolym på 68,5 μL genom att multiplicera 5 mM-koncentrationen i etanol med en total lipidblandningsvolym på 533 μL och sedan dividera med stockfettkoncentrationen på 38,9 mM.
  3. Tillsätt lämplig mängd av varje lipidbuljonglösning i en glasflaska så att komponenterna kan blandas med intermittent virvel. Tillsätt 200 korrekt etanol för en total blandning av 533 μL. Till exempel i tabell 1är detta 254 μL etanol.
    OBS: För en enda körning för att producera 1 ml LNPs behövs 342,5 μL lipidlösning. Detta beror på en 3:1 blandning av vattenhaltig nukleinsyra till organisk lipidlösning med viss volym kasserad före och efter provsamling. En blandning på 533 μL görs för att kompensera som överhet.

3. Beredning av nukleinsyralösning

OBS: Beredning och hantering av lösningar för nukleinsyra ska utföras i en steril och RNase-fri miljö där så är möjligt. Arbeta i ett biosäkerhetsskåp när det är möjligt med nukleinsyran.

  1. Beräkna N/P-förhållande. N/P-förhållandet är det totala antalet joniserbara lipidamingrupper (N) till det totala antalet negativt laddade fosfatgrupper för nukleinsyra (P). N/P-förhållande är ofta en parameter som kan optimeras under LNP-bildandet. Följ stegen nedan.
    1. Beräkna antalet N-enheter med hjälp av formeln nedan:
      Equation 1
      OBS: Den joniserbara lipidkoncentrationen(tabell 1)är 5 mM, vilket motsvarar 5 x 10-6 mol/ml. Den erforderliga lipidinjektionsvolymen är 0,3425 ml. Om till exempel antalet N-enheter per molekyl är 1, med hjälp av ovanstående ekvation, finns det 1,03 x 1018 N enheter i lipidblandningen.
    2. Beräkna P-enheterna för önskat N/P-förhållande. Här används till exempel ett N/P = 36.
      Equation 2
  2. Beräkna den er behövande nukleinsyrakoncentrationen för att erhålla 2,86 x 1016 P enheter med hjälp av nedanstående ekvation.
    Equation 3
    Där antalet P-enheter per baspar för mRNA är 1 och DNA är 2. För ett mRNA med 1 200 baser är den mängd mRNA som krävs för en N/P = 36 3,96 x 10-11 mol.
  3. Beräkna den masskoncentration av mRNA som krävs för N/P = 36 med hjälp av nedanstående ekvation.
    Equation 4
    Den genomsnittliga molekylvikten för en ribonukleotid monofosfatenhet är 322 g/mol30. Med 1 200-bas mRNA är mRNA: s molekylvikt 386 400 g / mol. Den erforderliga injektionsvolymen av nukleinsyralösning är 1,028 ml. Således är koncentrationen av mRNA som behövs 1,488x10-5 g/ml, vilket är 14,88 μg/ml.
  4. Utgör 1,5 ml 14,88 μg/ml mRNA i citratbuffert.
    OBS: När DNA kommer att vara nukleinsyran inkapslad, använd äppelsyrabuffert för att göra upp nukleinsyralösningen.

4. Priming av mikrofluidiska kanaler

OBS: Detta protokoll är anpassat från instrumenttillverkarens riktlinjer.

  1. Mata in primingparametrarna i instrumentprogramvaran genom att klicka på lämpliga fält (tabell 2).
    OBS: Ett flödesförhållande på 3:1 och flödeshastigheten 4-12 ml/min rekommenderas27,31 . Detta har visat sig vara optimalt i de studier som presenteras här, liksom av tillverkaren. Detta kan varieras om det är av intresse för ansökan.
  2. Öppna instrumentlocket och placera en mikrofluidpatron i det roterande blocket.
  3. Dra in minst 0,5 ml etanol i en 1 ml spruta, så att det inte finns några bubblor eller luftspalter vid sprutspetsen. Ladda sprutan i patronens högra inlopp.
  4. Fyll en 3 ml spruta med 1,5 ml vattenbuffert (citrat för RNA och äppelsyra för DNA), vilket säkerställer att det inte finns några luftbubblor eller luckor. Ladda sprutan i patronens vänstra inlopp.
  5. Sätt i två 15 ml koniska rör i klämhållarna för att fungera som avfallsbehållare.
  6. Klicka på Kör i instrumentprogramvaran för att påbörja blandningen och se till att parametrarna matas in korrekt.
  7. När instrumentet slutar priming, indikeras av bottenblå lampan stängs av, öppna locket och kassera koniska rör och sprutor ordentligt.

5. LNP-formation

OBS: Detta protokoll är anpassat från instrumenttillverkarens riktlinjer.

  1. Uppdatera programvaran med formuleringsparametrarna genom att klicka på lämpliga fält (tabell 2).
  2. Fyll en 1 ml spruta med lipidblandningen (beredd i steg 2). Ta bort eventuella luftspalter eller bubblor vid sprutspetsen och för in sprutan i patronens högra sida.
  3. Dra nukleinsyralösningen (beredd i steg 3) i en 3 ml spruta, så att det inte finns några bubblor eller luftspalter i sprutspetsen. För in sprutan i patronens vänstra inlopp.
    OBS: Volymer tillhandahålls för att göra en 1 ml lösning av LNPs. Detta instrument kan innehålla sprutstorlekar upp till 10 ml, och volymerna kan skalas i enlighet därmed utan påverkan på resultatet. Den maximala volymen LNPs som kan förberedas i en förberedelse är 12 ml.
  4. Märk ett 15 ml RNase-fritt koniskt rör med provnamnet och sätt in i det vänstra rörklämman. Placera en 15 ml avfallskonisk i rätt rörklämma.
  5. Stäng instrumentlocket och klicka på Kör, efter att ha bekräftat korrekt inmatning av parametrar.
  6. När instrumentet är klart kasserar du avfallsbehållaren och patronen ordentligt. Behåll koniskt rör med LNP-provet.
  7. Späd LNP 5x med PBS för att minimera etanolen till <5% (v/v).
    OBS: Det är viktigt att späda ut LNP:erna i PBS så snart som möjligt efter mikrofluidisk blandning för att förhindra nedbrytning. Utför alltid utspädningen i ett biosäkerhetsskåp och fortsätt att arbeta i biosäkerhetsskåpet under hela buffertutbytena.

6. Buffertutbyte

OBS: Protokoll för användning av ultracentrifugfilter tillhandahålls. Även om denna metod resulterar i ett mer tidseffektivt utbyte av buffertar, kan dialys ersättas här.

  1. Förtvätta ett ultracentrifugfilter (100 kDa porstorlek) med 2 ml PBS genom att centrifugera vid 1000 x g i 5 min. Töm PBS från det nedre facket.
    PBS väljs för att öka pH till 7,4 ± 0,2, vilket är fysiologiskt relevant och resulterar i att joniserbara lipider har en neutral laddning.
  2. Tillsätt utspädda LNPs i det övre facket på det förtvättade ultracentrifugfiltret och centrifugera vid 1000 x g i 12 min.
  3. Kassera genomflödet från det nedre facket. Utför ytterligare två tvättar genom att lägga till 5 ml PBS till ultracentrifugfiltret varje gång. Centrifug vid samma parametrar. Det finns ingen maximal volym som behöver upprätthållas.
    OBS: Om en skalad volym LNP:er har förberetts, öka volymen pbs för varje tvätt i enlighet därmed. Om till exempel 2 ml LNPs förbereddes i en enda körning, föreslås 10 ml PBS per tvätt.
  4. Pipett LNP-lösningen mot väggarna i ultracentrifugfiltret några gånger för att minimera LNP-förlusten. Ta bort LNP-lösningen från ultracentrifugfiltret och förvara i en nukleasfri flaska. Tillsätt PBS om det behövs för att uppnå en slutlig volym av LNP-lösningen på 1 ml.
  5. Filtrera genom ett förtrutt 0,2 μm sprutfilter vid behov.
    Protokollet kan pausas här.

7. Mät inkapslingseffektiviteten

  1. Förbered en standardkurva genom att göra 2-faldiga seriella utspädningar av arbetskärnans syralösning i PBS, börja med en högsta koncentration på 500 ng/mL och göra minst fem utspädningar. Använd PBS som ett tomt.
  2. Förbered LNP-provutspädningarna. Späd LNP-prover med PBS för att uppnå en ungefärlig teoretisk koncentration som ligger runt mitten av standardkurvan (t.ex. ~ 250 ng/ml nukleinsyra uppskattad från den ursprungliga koncentrationen).
  3. Förbered en lösning av RNA-kvantifieringsreagenset (för mRNA-mätningar) med TritonX-100 för att störa LNPs och mäta den totala mängden nukleinsyra inuti och utanför LNP. Denna lösning innehåller 0,5% (v/v) RNA-reagens, 0,4% (v/v) TritonX-100 och 99,1% (v/v) PBS.
  4. Förbered en lösning av reagenset utan TritonX-100 för att mäta mängden nukleinsyra som inte är inkapslad i LNPs. Denna lösning innehåller 0,5% (v/v) RNA-reagens och 99,5% (v/v) PBS.
    OBS: Om LNPs kapslar in dubbelsträngat DNA (dsDNA), såsom plasmid-DNA, använd dsDNA-reagenset i 7.3 och 7.4 istället, enligt samma förfarande.
  5. I en 96-brunns svart fluorescens kapabel platta, ladda minst fyra replikat av var och en av LNP och nukleinsyra standardlösningar beredda i 7.1 och 7.2.
  6. Lägg till en lika stor volym reagens som innehåller TritonX-100 till hälften av replikaten av standarder och prover. Detta kommer att kvantifiera den totala mängden nukleinsyra.
  7. Lägg till en lika stor volym reagens utan TritonX-100 till de återstående brunnarna av standarder och prover. Detta kommer att kvantifiera mängden nukleinsyra som inte är inkapslad inuti LNP.
  8. Skaka plattan i 5 minuter vid rumstemperatur för att säkerställa noggrann blandning av standarder och prover med det tillsatta reagenset och vidta försiktighetsåtgärder för att undvika ljusexponering.
  9. Mät fluorescensen med hjälp av en mikroplåtläsare, med en excitationsvåglängd på 480 nm och en utsläppsvåglängd på 520 nm.
  10. Beräkna koncentrationen av nukleinsyra utanför LNP med hjälp av standardkurvan som görs med tillsats av reagenset utan TritonX-100. Multiplicera med utspädningsfaktorn som används i 7.2.
  11. Beräkna koncentrationen av nukleinsyra både inom och utanför LNP med hjälp av standardkurvan som görs med tillsats av reagenset som innehåller TritonX-100. Multiplicera med utspädningsfaktorn som används i 7.2.
  12. Beräkna koncentrationen av nukleinsyra inuti genom att subtrahera koncentrationen av nukleinsyra utanför (beräknad från steg 7.10) från den totala koncentrationen av nukleinsyra både inuti och utanför (beräknad från steg 7.11)
  13. Kvantifiera inkapslingseffektiviteten från förhållandet mellan koncentrationen av nukleinsyra inuti LNP (beräknat från steg 7.12) och den totala koncentrationen av nukleinsyra (beräknad från steg 7.11).
    Protokollet kan pausas här.

8. Koncentrationsjusteringar

  1. Vid behov justerar du nukleinsyrakoncentrationen i LNP-lösningen med hjälp av resultaten från inkapslingseffektiviteten.
  2. Om en mindre koncentrerad lösning önskas, späd lösningen med PBS för att uppnå önskad koncentration.
  3. Om en mer koncentrerad lösning önskas, utför ytterligare centrifugeringskörningar med hjälp av ett ultracentrifugfilter.
    Protokollet kan pausas här.

9. Mät LNP hydrodynamisk storlek och polydispersitet

  1. Späd ut en alikvot av LNP-lösningen 40x med PBS för att erhålla en slutlig volym på 1 ml.
    OBS: Denna utspädning kan ändras vid behov. Detta utspädningsvärde föreslås eftersom det använder en liten volym av LNP-lagerlösningen samtidigt som det ger kvalitetsresultat.
  2. Mät hydrodynamisk diameter och polydispersitetsindex med hjälp av en halvmikro cuvette. Tillsätt LNP-lösningen i cuvette och sätt in i instrumentet. Ställ in en procedur i instrumentprogramvaran så att den omfattar mättyp, provdetaljer (material, dispergeringsmedel, temperatur och celltyp) och mätinstruktioner (antal körningar). Klicka på Start när du är redo att påbörja mätförvärvet.

10. Mät LNP zeta potential

  1. Späd ut en alikvot av LNP-lösningen 40x med nukleasfritt vatten för att få en slutlig volym på 1 ml.
    OBS: Nukleasfritt vatten används som lösningsmedel för zetapotentialmätningar för att minimera påverkan av höga saltbuffertar på konduktivitet.
  2. Mät zetapotentialen med hjälp av en vikt kapillär zetacell.
    1. Lägg till LNP-lösningen i cuvette upp till fyllningsraden. Sätt in i instrumentet så att elektroderna kommer i kontakt med instrumentet.
    2. Ställ in en procedur i instrumentprogramvaran så att den omfattar mättyp, provdetaljer (material, dispergeringsmedel, temperatur och celltyp) och mätinstruktioner (antal körningar). Klicka på Start när du är redo att påbörja mätförvärvet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flera partier av LNPs med samma lipid formulering och N/P förhållandet 6 utvecklades på separata dagar för att visa reproducerbarhet av tekniken. Parti 1 och 2 resulterade i överlappande storleksfördelningar med liknande polydispersitet(figur 2A)Ingen signifikant skillnad observerades i storleks- eller inkapslingseffektiviteten mellan de två olika partier(figur 2B). Inkapslingseffektiviteten var hög för varje sats (>98,5%) och storlekarna var likartade med en 77 nm LNP-diameter. Partiklarna var enhetliga med ett genomsnittligt polydispersitetsindex (PDI) på 0,15 för parti 1 och 0,18 för parti 2.

Förändringar i formuleringsparametrarna visade några små, men statistiskt signifikanta skillnader med avseende på N/P-förhållandet, joniserbar lipid som används och nukleinsyra inkapslad. Medan skillnader diskuteras, är det viktigt att notera att alla LNPs bildas resulterade i inkapsling större än 80%, med de flesta formuleringar större än 95%, och partikelstorlekar mindre än 110 nm, vilket gör alla formuleringar utvecklade här önskvärda för gen leverans. Först användes joniserbara lipid A för att utveckla LNPs vid en N/P av 10 och 36. En minskning av N/P-förhållandet resulterade i en 4% minskning av inkapslingseffektiviteten och en ökning av LNP:s hydrodynamiska diameter från 98 nm vid N/P = 36 till 109 nm vid N/P = 10 (Figur 3A). Att jämföra LNPs med joniserbar lipid A med en annan joniserbar lipid B och upprätthålla N/P av 36 resulterade i en betydande förändring i inkapsling effektivitet, där 100% av pDNA var inkapslade med LNPs bildas med joniserbara lipid B (Figur 3B). Joniserbara lipid B LNPs resulterade också i något mindre partiklar med en hydrodynamisk diameter på 95 nm. Slutligen bildades LNPs med hjälp av joniserbara lipid A med både mRNA och pDNA. LNPs inkapsla pDNA resulterade i större partiklar med en diameter på 119 nm jämfört med mRNA LNPs med en diameter på 91 nm (Figur 3C). Både pDNA och mRNA LNPs resulterade i liknande inkapsling effektivitet på ~91-94%.

Slutligen påverkade inte ändringar i flödeshastighetsprocessen parametern de LNPs som utvecklats vid de flödeshastigheter som testades här. Vid både 4 ml/min och 12 ml/min utvecklades och karakteriserades LNPs för att ha kapslat in 96% av pDNA och har en diameter på 110 nm (figur 4). Alla LNPs oavsett process parameter eller formulering parameter resulterade i laddning neutral zeta potentiella mätningar.

Figure 1
Bild 1: ARBETSFLÖDE FÖR UTVECKLING OCH KARakterisering av LNP. Först görs lipidblandning och nukleinsyralösningar (1 och 2). Lipidblandningen innehåller joniserbar lipid, helper lipid, kolesterol och PEG i etanol, medan nukleinsyralösningen innehåller antingen mRNA eller DNA i buffert. Lösningar blandas med en mikrofluidpatron (3), som bildar LNPs (4). Därefter krävs ett buffertutbyte för att ta bort etanolen och öka lösningens pH till neutral (5). Karakterisering av LNPs utförs för att bestämma inkapsling effektivitet och partikel storlek, polydispersitet och zeta potential med hjälp av en fluorescens microplate analys och zetasizer, respektive (6 och 7). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:Sats tillparti reproducerbarhet för LNP:er som bildaspåseparata dagar. ( A ) Storleksfördelningar för parti 1 jämfört med parti 2B) Inkapslingseffektivitet (%) och hydrodynamisk diameter (nm) för varje parti med mRNA och N/P = 6. Felstaplar noterar standardavvikelse. Statistisk analys med tvåvägs ANOVA med α = 0,05 visar ingen betydelse. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Variationer av formuleringsparametrar. (A) LNPs bildade vid N/P = 10 och 36 båda med joniserbar lipid A med pDNA. (B) LNPs bildas med joniserbara lipid A och joniserbara lipid B båda vid N/P = 36 med pDNA. C)LNPs bildas med antingen mRNA eller pDNA båda med joniserbara lipid C vid N/P = 6. Felstaplar noterar standardavvikelse. Statistisk analys utfördes med tvåvägs ANOVA med α = 0,05; *p<0,05; **p<0,01; s<0.001, s<0.0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Variationer av processparametrar. LNPs bildas med en flödeshastighet av 4 och 12 mL/min med joniserbara lipid A med pDNA vid N/P = 10. Felstaplar noterar standardavvikelse. Statistisk analys med tvåvägs ANOVA med α = 0,05 visar ingen betydelse. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Lipid Molar-förhållande Fettkoncentration i lager (mM) Koncentration i etanol för lipidblandning (mM) Volym (μL)
Joniserbar lipid 50 38.9 5 68.5
Hjälpare lipid 10 10 1 53.3
Kolesterol 39 20 3.9 103.9
C-14 PEG 1 1 0.1 53.3
EtOH (etoh) 254
Total 533

Tabell 1: Exempel lipidblandning för att förbereda 1 ml LNPs. De lipidlagerkoncentrationer i etanol som tillhandahålls har visat sig göra det möjligt för lipiderna att lösliga i etanol, men andra lagerkoncentrationer kan användas och kommer inte att påverka resultatet så länge lipiden lösligs. Exempel på koncentrationer av lipider i etanol för mikrofluidblandning tillhandahålls också. Dessa koncentrationer är baserade på molarförhållandet, som kan varieras baserat på önskad LNP-beredning.

Priming Formulering
Volym (ml) 2 1.37
Flödeshastighetsförhållande (vattenhaltigt:EtOH) 3:1 3:1
Total flödeshastighet (ml/min) 12 4
Vänster sprutstorlek (ml) 3 3
Höger sprutstorlek (ml) 1 1
Starta avfallsvolym (ml) 0.35 0.25
Slutavfallsvolym (ml) 0.05 0.05

Tabell 2: Mikrofluidisk blandning bänkskiva instrument programvara Priming och LNP formulering exempel parametrar

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Reproducerbarhet, hastighet och lågvolymscreening är betydande fördelar med att använda mikrofluidblandning för att bilda LNPs jämfört med andra befintliga metoder (t.ex. lipidfilmhydrering och etanolinjektion). Vi har visat reproducerbarheten av denna metod utan inverkan på inkapsling effektivitet eller partikel storlek observeras med olika LNP partier. Detta är ett viktigt kriterium för att alla terapeutiska, inklusive LNPs, ska bli kliniskt tillgängliga.

Tekniken som beskrivs här använder förskjuten fiskbensmikrofluidisk blandning, vilket resulterar i LNP-formation på tidsskalan på bara några minuter. Denna blandning använder kaotisk advektion som är fördelaktig för att blanda kontroll och förkortad tid27. Denna mixer gör det möjligt för vattenhaltiga och organiska faser att effektivt linda runt varandra27. Med hjälp av den förskjutna fiskbensblandningen har tidigare studier visat att partiklarna bildas vid den minsta termodynamiskt stabilastorleken 32, vilket innebär att kompositionen tenderar att påverka storleken och polydispersiteten hos LNPs27,32,33. Detta observerades i de representativa resultaten, där N/P-förhållandet, joniserbar lipid som användes och nukleinsyra inkapslade var de faktorer som påverkade förändringar i inkapslingseffektivitet och partikelstorlek. Driftsparametrar, såsom flödeshastighet och blandningsförhållande, kan också påverka storleken över ett visst tröskelvärde, där partikelstorleken därefter är på sin minsta stabila storlek27,33. Ingen förändring i inkapslingseffektivitet eller partikelstorlek observerades när ett flöde på 4 ml/min jämfört med 12 ml/min användes. Således är sannolikt båda flödeshastigheterna över tröskelvärdet som skulle påverka LNP-resultatet. Exempelexperimentet, och resultaten som beskrivs ovan, använde lipid A och pDNA. Det är möjligt att olika joniserbara lipider och nukleinsyror kan ha större inverkan på LNP:s egenskaper när det gäller flödeshastighet. Andra typer av mikrofluidisk blandning inkluderar T-korsningen, som använder turbulent flöde och den mikrofluidiska hydrodynamiska fokuseringsmetoden som bygger på konvektiv-diffusiv blandning27. Jämfört med dessa andra typer av mikrofluidiska blandningsmetoder för LNP-utveckling möjliggör den förskjutna fiskbensblandningen kombinationen av tre viktiga kriterier: snabb blandning, minimering av batch till batchvariation och är kommersiellt tillgänglig27. Alla tre mikrofluidblandningsmetoderna möjliggör högre inkapslingseffektivitet och kontrollerad storlek jämfört med konventionella lipidfilmhydrerings- eller etanolinjektionsmetoder27.

Slutligen är förmågan att producera låga volymer av olika LNP-formuleringar på forsknings- och utvecklingsstadiet en betydande fördel. En utmaning med att utveckla LNPs är antalet variabler som kan testas och optimeras per formulering för att uppnå önskat resultat och effekt. Lipider och nukleinsyror kan vara kostnadsöverkomliga för att screena, felsöka och modifiera många formuleringsparametrar (t.ex. molarförhållanden, N/P-förhållanden, processparametrar etc.) för att hitta den lämpligaste LNP för en viss applikation. Även om låga volymer kan vara en begränsning för att producera en slutlig formulering i stor skala, är förmågan att skala upp tekniken med större mikrofluidiska blandningsinstrument kommersiellt tillgänglig.

Kritiska steg i protokollet börjar med korrekt lagring av lipidlagerlösningar på tillverkarens rekommendation. LNPs ska sedan förvaras vid 2-8 °C tills vidare användning. För nukleinsyrapreparatet visar de resultat som presenteras att citratbuffert och äppelsyrabuffert är effektiva för att framgångsrikt bilda LNPs med hög nukleinsyra inkapsling34,35. Andra buffertar kan användas i stället om så önskas. Om en annan buffert väljs är det viktigt att hålla pH under pKa av joniserbara lipid för att säkerställa att lipiden är katjonisk och kan komplexiseras med nukleinsyran. När du använder det mikrofluidiska blandningsinstrumentet är det viktigt att primepatronen före LNP-bildandet, inte att överskrida patronanvändningen som rekommenderas av tillverkaren och att byta patron mellan olika formuleringssammansättningar. Det vanligaste flödesförhållandet för bildandet av vattenhaltiga: organisk lösning är 3:1; Detta kan dock ändras vid behov. Flödeshastigheten kan också justeras efter önskemål. Slutligen är det viktigt när du arbetar med mRNA för att säkerställa en RNase-fri miljö under hela processen. Om önskad storlek eller inkapslingseffektivitet inte uppnås, inkluderar vissa platser att börja felsöka att ändra det N / P-förhållande som används eller lipidmolarprocenten. Instrumentprocessen som beskrivs här använder en bänkskiva modell som har en maximal volym gräns på 12 ml, även om denna process är skalbar för större volymer med hjälp av olika mikrofluidiska blandningsmodeller. Denna process kan anpassas till förändringar i lipidblandningar och nukleinsyror för användning vid utveckling av LNPs för olika kliniska indikationer. Med denna flexibilitet kan många framtida applikationer uppnås med LNPs för att producera olika önskade formuleringar. Denna teknik har också använts för att utveckla andra typer av nanopartiklar, inklusive liposomer och polymera nanopartiklar. Med vissa parameterförändringar kan denna metod användas för en mängd olika nanopartiklar.

Protokollet som beskrivs här beskriver en reproducerbar metod för att uppnå mRNA eller DNA inkapslade LNPs. Förutom processparametrar kan ytterligare överväganden påverka LNP-resultatet. Tidigare arbete har också använt liknande metoder för att producera LNPs med olika nukleinsyror, joniserbara lipider, N/P-förhållanden, PEG-länkarlängd etc. Dessa parametrar kan påverka inkapslingens effektivitet, storlek och laddning av partiklarna. Instrumenttillverkaren har också noterat liknande förändringar beroende på dessa parametrar som kan optimeras18,36. Dessa parametrar kan ytterligare påverka nukleinsyrans biodistribution och effekt. Studier har till exempel undersökt kolvätekedjans längder (C14, C16 och C18) konjugerade med PEG och funnit att den kortare akrylkedjan av C14 resulterade i högre nivåer av leverupptag jämfört med den längre akrylkedjan, som förblev i omlopp under en längre tid28. Detta protokoll möjliggör bildning, optimering och testning av LNPs med olika kompositioner, vilket gör detta till en mångsidig process.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare är anställda av Sanofi. Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt eller konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Tack till Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger och Philip Zakas för deras vägledning och bidrag till LNP:s utveckling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Tags

Bioengineering nummer 168 lipidnanopartiklar nukleinsyra budbärar-RNA DNA mikrofluidisk förskjuten fiskbensblandare
Formulera och karakterisera Lipid Nanopartiklar för genleverans med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P.,… More

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter