Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formulere og karakterisere Lipid nanopartikler for genlevering ved hjelp av en mikrofluidisk blandeplattform

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

Lipid nanopartikler er utviklet ved hjelp av en mikrofluidisk blandeplattformtilnærming for mRNA og DNA-innkapsling.

Abstract

Lipidbaserte legemiddelbærere har blitt brukt til klinisk og kommersielt tilgjengelige leveringssystemer på grunn av deres lille størrelse, biokompatibilitet og høy innkapslingseffektivitet. Bruk av lipid nanopartikler (LNPer) for å innkapsle nukleinsyrer er fordelaktig for å beskytte RNA eller DNA mot nedbrytning, samtidig som det fremmer cellulært opptak. LNPer inneholder ofte flere lipidkomponenter, inkludert en ionizabel lipid, hjelperlipid, kolesterol og polyetylenglykol (PEG) konjugert lipid. LP-er kan lett innkapsle nukleinsyrer på grunn av den irizable lipidtilstedeværelsen, som ved lav pH er kationisk og muliggjør kompleksasjon med negativt ladet RNA eller DNA. Her dannes LNPer ved å innkapsle budbringeren RNA (mRNA) eller plasmid DNA (pDNA) ved hjelp av rask blanding av lipidkomponentene i en organisk fase og nukleinsyrekomponenten i en vandig fase. Denne blandingen utføres ved hjelp av en presis mikrofluidisk blandeplattform, noe som muliggjør nanopartikkel selvmontering samtidig som laminær strømning opprettholdes. Den hydrodynamiske størrelsen og polydispersiteten måles ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). Den effektive overflateladningen på LNP bestemmes ved å måle zetapotensialet. Innkapslingseffektiviteten er preget av et fluorescerende fargestoff for å kvantifisere fanget nukleinsyre. Representative resultater viser reproduserbarheten av denne metoden og innflytelsen som forskjellige formulerings- og prosessparametere har på de utviklede LNP-ene.

Introduction

Legemiddelbærere brukes til å beskytte og levere en terapeutisk med typiske gunstige egenskaper, inkludert lav cytotoksisitet, økt biotilgjengelighet og forbedret stabilitet1,2,3. Polymere nanopartikler, micelles og lipidbaserte partikler har tidligere blitt utforsket for nukleinsyreinnkapsling og levering4,5,6,7. Lipider har blitt brukt i forskjellige typer nanocarrier-systemer, inkludert liposomer og lipid nanopartikler, da de er biokompatible med høy stabilitet8. LNPer kan lett innkapsle nukleinsyrer for genlevering9,10. De beskytter nukleinsyren mot nedbrytning av serumproteaser under systemisksirkulasjon 11 og kan forbedre leveringen til bestemte steder, da overflatetopografien og de fysiske egenskapene til LNPer påvirker deres biodistribusjon12. LP-er forbedrer også vevsinntrengning og cellulært opptak9. Tidligere studier har vist suksessen med siRNA-innkapsling i en LNP13, inkludert den første kommersielt tilgjengelige LNP som inneholder siRNA-terapeutisk for behandling av polyneuropati av arvelig transthyretinmediert amyloidose14-behandling som ble godkjent av United States Food and Drug Administration (FDA) og European Medicines Agency i 2018. Mer nylig blir LNPer studert for levering av større nukleinsyremoieties, nemlig mRNA og DNA9. Fra og med 2018 var det ~ 22 lipidbaserte nukleinsyreleveringssystemer som gjennomgikk kliniske studier14. I tillegg er mRNA som inneholder LNPer for tiden ledende kandidater og har blitt ansatt for en COVID-19-vaksine15,16. Den potensielle suksessen for disse ikke-virale genterapiene krever å danne små (~ 100 nm), stabile og ensartede partikler med høy innkapsling av nukleinsyren.

Bruk av en ioniserbar lipid som hovedkomponent i LNP-formuleringen har vist fordeler for hudfarge, innkapsling og levering effciciency14. Iioniserbare lipider har vanligvis en syredissosiasjonskonstant (pKa) < 7; for eksempel har dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), den irizable lipiden som brukes i FDA-godkjent LNP-formulering, en pKa på 6,4417. Ved lav pH blir amingruppene på den iioniserbare lipiden protonert og positivt ladet, noe som muliggjør montering med negativt ladede fosfatgrupper på mRNA og DNA. Forholdet mellom amin, "N", grupper til fosfat, "P", grupper brukes til å optimalisere samlingen. N / P-forholdet er avhengig av lipider og nukleinsyrer som brukes, som varierer avhengig av formuleringen18. Etter dannelsen kan pH justeres til en nøytral eller fysiologisk pH for å tillate terapeutisk administrering. Ved disse pH-verdiene er den iionizable lipiden også deprotonert som gir nøytral overflateladning til LNP.

Den irizable lipid hjelper også i endosomal flukt19,20. LP-er gjennomgår endokytose under cellulært opptak og må frigjøres fra endosomet for å levere mRNA-lasten inn i cellecytoplasma eller DNA-last til kjernen21. Inne i endosomet er vanligvis et surere miljø enn det ekstracellulære mediet, noe som gjør den irizable lipid positivt ladet22,23. Den positivt ladede ionizable lipiden kan samhandle med negative ladninger på endosom lipidmembranen, noe som kan forårsake destabilisering av endosomet som tillater frigjøring av LNP og nukleinsyre. Ulike ioniserbare lipider studeres for tiden for å forbedre effekten av både LNP-distribusjon, samt endosomal flukt14.

Andre typiske komponenter i en LNP inkluderer hjelper lipider, for eksempel en fosfatidylkolin (PC) eller fosfoetanolamin (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphocholine (DSPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfocholine (DOPC) er ofte brukt hjelper lipider24,25. DOPE har vist seg å danne en omvendt sekskantet II (HII) fase og forbedre transfeksjon vedmembranfusjon 26, mens DSPC har blitt antatt å stabilisere LP-er med sin sylindriske geometri27. Kolesterol er også innlemmet i formuleringen for å øke membranstivheten, og deretter hjelpe til med stabiliteten til LNP. Til slutt er lipidkonjugert polyetylenglykol (PEG) inkludert i formuleringen for å gi den nødvendige steriske barrieren for å hjelpe til med partikkel selvmontering27. PEG forbedrer også lagringsstabiliteten til LNPer ved å forhindre aggregering. Videre brukes PEG ofte som en stealth-komponent og kan øke sirkulasjonstiden for LP-ene. Denne egenskapen kan imidlertid også by på utfordringer for rekruttering av LNPer til hepatocytter gjennom en endogen målrettingsmekanisme drevet av apolipoprotein E (ApoE)28. Studier har derfor undersøkt acylkjedelengden for diffusjon av PEG fra LNP, og funnet at korte lengder (C8-14) tar avstand fra LNP og er mer mottagelige for ApoE-rekruttering sammenlignet med lengre acyllengder28. Videre har graden av metning av lipidhalen som PEG er konjugert til vist seg å påvirke vevsfordelingen av LNPer29. Nylig ble Tween 20, som er et ofte brukt overflateaktivt middel i biologiske legemiddelproduktformuleringer og har en lang umettet lipidhale, vist seg å ha høy transfeksjon i drenering av lymfeknuter sammenlignet med PEG-DSPE, som i stor grad transfekterte muskelen på injeksjonsstedet29. Denne parameteren kan optimaliseres for å oppnå ønsket LNP biodistribusjon.

Konvensjonelle metoder for å danne LNPer inkluderer tynnfilmhydreringsmetoden og etanolinjeksjonsmetoden27. Selv om dette er lett tilgjengelige teknikker, er de også arbeidskrevende, kan resultere i lav innkapslingseffektivitet, og er utfordrende å skalere opp27. Fremskritt innen blandingsteknikker har resultert i metoder som er mer egnet til å skalere opp, samtidig som de utvikler mer ensartede partikler27. Disse metodene inkluderer T-kryssblanding, forskjøvet sildbeinblanding og mikrofluidisk hydrodynamisk fokus27. Hver metode har en unik struktur, men alle tillater rask blanding av en vandig fase som inneholder nukleinsyren med en organisk fase som inneholder lipidkomponentene, noe som resulterer i høy innkapsling av nukleinsyren27. I denne protokollen benyttes rask og kontrollert blanding gjennom en mikrofluidisk patron, som bruker den forskjøvede sildbeinblandingsdesignen. Denne protokollen skisserer fremstilling, montering og karakterisering av nukleinsyre som inneholder LNPer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Et skjema av den overordnede prosessen finnes i figur 1.

1. Utarbeidelse av buffere

MERK: Steril filtrering av bufferne anbefales her på det sterkeste å fjerne partikler som kan påvirke nukleinsyren og LNP-kvaliteten.

  1. Fosfatbufret saltvann (PBS)
    1. Forbered 1x PBS ved hjelp av 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl i nukleasefritt vann og juster pH til 7,4.
    2. Steriliser ved vakuumfiltrering ved hjelp av et filter på 0,22 μm porestørrelse.
  2. Citrate-buffer
    1. Forbered sitratbuffer ved hjelp av 5 mM natriumsitrat, 5 mM sitronsyre og 150 mM natriumklorid i nukleasefritt vann og juster til pH 4,5.
    2. Steriliser ved vakuumfiltrering ved hjelp av et filter på 0,22 μm porestørrelse.
      MERK: Sitratbufferen trenger bare å fremstilles hvis mRNA er nukleinsyren som skal innkapsles i LNP. Hvis DNA skal innkapsles, hopp over 1.2 og fortsett til 1.3.
  3. Malinsyrebuffer
    1. Forbered malinsyrebuffer ved hjelp av 20 mM malinsyre og 30 mM natriumklorid i nukleasefritt vann og juster til pH 3.0.
    2. Steriliser ved vakuumfiltrering ved hjelp av et filter på 0,22 μm porestørrelse.
      MERK: Malinsyrebuffer trenger bare å fremstilles hvis DNA er nukleinsyren som skal innkapsles i LNP. Hopp over 1,3 hvis mRNA skal innkapsles. Citratbuffer brukes til mRNA-innkapsling, da den nedre pH på 3,0 med malinsyrebuffer kan føre til økt sannsynlighet for mRNA-nedbrytning. Protokollen kan settes på pause her.

2. Fremstilling av lipidblanding

  1. Hvis lager lipider er i pulverform, solubilize i ren 200 bevis etanol.
  2. Beregn den nødvendige blandingen av lipidkomponenter basert på ønsket molarforhold. Et molarforhold på 50:10:39:1 (ionizable lipid:helper lipid:cholesterol:PEG) vil bli brukt her som et eksempel for en total lipidkonsentrasjon på 10 mM. Tabell 1 viser konsentrasjonene og volumene som trengs for hver av disse komponentene.
    MERK: Ved beregning av volumet som trengs for å oppnå lipidblandingskonsentrasjonen i etanol (EtOH) for den mikrofluidiske mikseren, er det totale volumet gjort rede for for å sikre at tilsetningen av EtOH ikke påvirker lipidkonsentrasjonene. For eksempel beregnes et ioniserbart lipidvolum på 68,5 μL ved å multiplisere 5 mM-konsentrasjonen i etanol med et totalt lipidblandingsvolum på 533 μL og deretter dele seg med lager lipidkonsentrasjonen på 38,9 mM.
  3. Tilsett riktig mengde av hver lipid lagerløsning til et hetteglass i glass for å la komponentene blandes med periodisk virvel. Tilsett 200 bevis etanol for en total blanding på 533 μL. For eksemplet i tabell 1er dette 254 μL etanol.
    MERK: For en enkelt kjøring for å produsere 1 ml LNPer, er det nødvendig med 342,5 μL lipidoppløsning. Dette skyldes en 3:1 blanding av vandig nukleinsyre til organisk lipidoppløsning med noe volum kassert før og etter prøvetaking. En blanding på 533 μL er laget for å kompensere som overage.

3. Fremstilling av nukleinsyreoppløsning

MERK: Tilberedning og håndtering av nukleinsyreløsninger skal utføres i et sterilt og RNasefritt miljø der det er mulig. Arbeid i et biosikkerhetsskap når det er mulig med nukleinsyren.

  1. Beregn I/T-forhold. N/P-forholdet er det totale antallet iioniserbare lipidamingrupper (N) til totalt antall negativt ladede nukleinsyrefosfatgrupper (P). I/T-forhold er ofte en parameter som kan optimaliseres under LNP-dannelse. Følg trinnene nedenfor.
    1. Beregn antall N-enheter ved hjelp av formelen nedenfor:
      Equation 1
      MERK: Den iionizable lipidkonsentrasjonen (Tabell 1) er 5 mM, som tilsvarer 5 x 10-6 mol/ml. Det nødvendige lipidinjeksjonsvolumet er 0,3425 ml. For eksempel, hvis antall N-enheter per molekyl er 1, ved hjelp av ligningen ovenfor, er det 1,03 x 1018 N enheter i lipidblandingen.
    2. Beregn P-enhetene for ønsket I/T-forhold. Her brukes for eksempel en I/P = 36.
      Equation 2
  2. Beregn den nødvendige nukleinsyrekonsentrasjonen for å oppnå 2,86 x10 16 P-enheter ved hjelp av ligningen nedenfor.
    Equation 3
    Hvor, antall P-enheter per basepar for mRNA er 1 og DNA er 2. For en mRNA med 1200 baser er mengden mRNA som kreves for en N / P = 36 3,96 x10-11 mol.
  3. Beregn massekonsentrasjonen av mRNA som kreves for N/P = 36 ved hjelp av ligningen nedenfor.
    Equation 4
    Den gjennomsnittlige molekylvekten til en ribonukleotidmonofosfatenhet er 322 g / mol30. Med 1200-base mRNA er molekylvekten til mRNA 386 400 g/m. Det nødvendige injeksjonsvolumet av nukleinsyreoppløsning er 1,028 ml. Dermed er konsentrasjonen av mRNA nødvendig 1,488x10-5 g / ml, som er 14,88 μg / ml.
  4. Utgjør 1,5 ml 14,88 μg/ml mRNA i sitratbuffer.
    MERK: Når DNA skal være nukleinsyren innkapslet, bruk malinsyrebufferen til å lage nukleinsyreoppløsningen.

4. Grunning av mikrofluidiske kanaler

MERK: Denne protokollen er tilpasset instrumentprodusentens retningslinjer.

  1. Skriv inn grunnparameterne i instrumentprogramvaren ved å klikke på de aktuelle feltene (Tabell 2).
    MERK: Et strømningsforhold på 3:1 og en strømningshastighet på 4-12 ml/min anbefales27,31 . Dette har vist seg å være optimalt i studiene som presenteres her, så vel som av produsenten. Dette kan varieres hvis det er av interesse for søknaden.
  2. Åpne instrumentlokket og plasser en mikrofluidisk patron i den roterende blokken.
  3. Trekk minst 0,5 ml etanol inn i en 1 ml sprøyte, og sørg for at det ikke er bobler eller lufthull på sprøytespissen. Legg denne sprøyten i høyre innløp på sylinderampullen.
  4. Fyll en 3 ml sprøyte med 1,5 ml vandig buffer (sitrat for RNA og malinsyre for DNA), og sørg for at det ikke er luftbobler eller hull. Legg denne sprøyten i venstre innløp på sylinderampullen.
  5. Sett inn to koniske rør på 15 ml i klipsholderne for å fungere som avfallsbeholdere.
  6. Klikk på Kjør i instrumentprogramvaren for å starte blandingen, og sørg for at parametrene er riktig lagt inn.
  7. Når instrumentet slutter å grunne, indikert av det nederste blå lyset som slår seg av, åpner du lokket og kaster koniske rør og sprøyter på riktig måte.

5. LNP-formasjon

MERK: Denne protokollen er tilpasset instrumentprodusentens retningslinjer.

  1. Oppdater programvaren med formuleringsparameterne ved å klikke på de aktuelle feltene (Tabell 2).
  2. Fyll en 1 ml sprøyte med lipidblandingen (fremstilt i trinn 2). Fjern eventuelle lufthull eller bobler på sprøytespissen og sett sprøyten inn på høyre side av sylinderampullen.
  3. Trekk nukleinsyreoppløsningen (fremstilt i trinn 3) inn i en 3 ml sprøyte, og sørg for at det ikke er bobler eller lufthull i sprøytespissen. Sett sprøyten inn i venstre innløp på sylinderampullen.
    MERK: Volumer leveres for å lage en 1 ml løsning av LNPer. Dette instrumentet kan inkorporere sprøytestørrelser opp til 10 ml, og volumer kan skaleres tilsvarende uten påvirkning på utfallet. Maksimalt volum av LNPer som kan tilberedes i ett preparat er 12 ml.
  4. Merk et 15 ml RNase-fritt konisk rør med prøvenavnet og sett det inn i venstre rørklemme. Plasser et 15 ml avfall konisk i høyre rørklemme.
  5. Lukk instrumentlokket og klikk Kjøretter at du har bekreftet riktig inngang av parametere.
  6. Når instrumentet er ferdig, må avfallsbeholderen og sylinderampullen kastes riktig. Behold det koniske røret med LNP-prøven.
  7. Fortynn LNP 5x med PBS for å minimere etanol til <5% (v / v).
    MERK: Det er viktig å fortynne LNP-ene i PBS så snart som mulig etter mikrofluidblanding for å forhindre nedbrytning. Utfør alltid fortynning i et biosikkerhetsskap og fortsett å jobbe i biosikkerhetsskapet gjennom bufferutvekslingene.

6. Bufferutveksling

MERK: Protokoll for bruk av ultra-sentrifugefiltre er gitt. Selv om denne metoden resulterer i en mer tidseffektiv utveksling av buffere, kan dialyse erstattes her.

  1. Forvask et ultra-sentrifugefilter (100 kDa porestørrelse) med 2 ml PBS ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 minutter. Tøm PBS fra det nederste rommet.
    MERK: PBS er valgt for å øke pH til 7,4 ± 0,2, som er fysiologisk relevant og vil resultere i at den iioniserbare lipiden har en nøytral ladning.
  2. Tilsett fortynnede LNPer i det øverste rommet i det forhåndsvaskede ultrasentrifugefilteret og sentrifugen ved 1000 x g i 12 minutter.
  3. Kast gjennomstrømningen fra det nederste rommet. Utfør to vasker til ved å legge til 5 ml PBS i ultrasentrifugefilteret hver gang. Sentrifuge ved de samme parametrene. Det er ikke noe maksimalt volum som må vedlikeholdes.
    MERK: Hvis det ble utarbeidet et oppskalert volum av LNPer, øker du volumet av PBS for hver vask tilsvarende. For eksempel, hvis 2 ml LNPer ble forberedt i en enkelt kjøring, foreslås 10 ml PBS per vask.
  4. Pipette LNP-løsningen mot veggene i ultra-sentrifugefilteret noen ganger for å minimere LNP-tap. Fjern LNP-løsningen fra ultrasentrifugefilteret og oppbevar den i et nukleasefritt hetteglass. Tilsett PBS om nødvendig for å oppnå et endelig volum av LNP-løsningen på 1 ml.
  5. Filtrer gjennom et for-vått 0,2 μm sprøytefilter, om nødvendig.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

7. Måle innkapslingseffektivitet

  1. Forbered en standardkurve ved å lage 2 ganger seriell fortynning av arbeidskjernesyreoppløsning i PBS, som starter med en høyeste konsentrasjon på 500 ng / ml, og gjør minst fem fortynninger. Bruk PBS som et tomt felt.
  2. Forbered LNP-prøvefortynning. Fortynn LNP-prøver med PBS, for å oppnå en omtrentlig teoretisk konsentrasjon som ligger rundt midtpunktet i standardkurven (f.eks. ~ 250 ng/ml nukleinsyre estimert fra den opprinnelige konsentrasjonen).
  3. Forbered en løsning av RNA-kvantifiseringsreagenset (for mRNA-målinger) med TritonX-100 for å forstyrre LNP-ene og måle den totale mengden nukleinsyre i og utenfor LNP. Denne løsningen inneholder 0,5 % (v/v) RNA-reagens, 0,4 % (v/v) TritonX-100 og 99,1 % (v/v) PBS.
  4. Forbered en løsning av reagenset uten TritonX-100 for å måle mengden nukleinsyre som ikke er innkapslet i LP-ene. Denne løsningen inneholder 0,5 % (v/v) RNA-reagens og 99,5 % (v/v) PBS.
    MERK: Hvis LNPer innkapsler dobbeltstrenget DNA (dsDNA), for eksempel plasmid-DNA, bruker du dsDNA-reagenset i 7,3 og 7,4 i stedet, etter samme prosedyre.
  5. I en 96-brønns svart fluorescens-kapabel plate, last minst fire repliker av hver av LNP- og nukleinsyrestandardløsningene som er tilberedt i 7,1 og 7,2.
  6. Til halvparten av replikeringene av standarder og prøver, legg til et likt volum av reagenset som inneholder TritonX-100. Dette vil kvantifisere den totale mengden nukleinsyre.
  7. Til de resterende brønnene av standarder og prøver, legg til et likt volum av reagenset uten TritonX-100. Dette vil kvantifisere mengden nukleinsyre som ikke er innkapslet inne i LNP.
  8. Rist platen i 5 minutter ved romtemperatur for å sikre grundig blanding av standarder og prøver med det tilsatte reagenset, og ta forholdsregler for å unngå lyseksponering.
  9. Mål fluorescensen ved hjelp av en mikroplateleser, med en eksitasjonsbølgelengde på 480 nm og en utslippsbølgelengde på 520 nm.
  10. Beregn konsentrasjonen av nukleinsyre utenfor LNP ved hjelp av standardkurven laget med tilsetning av reagenset uten TritonX-100. Multipliser med fortynningsfaktoren som brukes i 7,2.
  11. Beregn konsentrasjonen av nukleinsyre både i og utenfor LNP ved hjelp av standardkurven laget med tilsetning av reagenset som inneholder TritonX-100. Multipliser med fortynningsfaktoren som brukes i 7,2.
  12. Beregn konsentrasjonen av nukleinsyre inni ved å trekke konsentrasjonen av nukleinsyre utenfor (beregnet fra trinn 7.10) fra den totale konsentrasjonen av nukleinsyre både inne og ute (beregnet fra trinn 7.11)
  13. Kvantifisere innkapslingseffektiviteten fra forholdet mellom konsentrasjonen av nukleinsyre inne i LNP (beregnet fra trinn 7.12) og den totale konsentrasjonen av nukleinsyre (beregnet fra trinn 7.11).
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

8. Konsentrasjonsjusteringer

  1. Juster om nødvendig nukleinsyrekonsentrasjonen i LNP-løsningen ved hjelp av resultatene fra innkapslingseffektiviteten.
  2. Hvis en mindre konsentrert løsning er ønsket, fortynn løsningen med PBS for å oppnå ønsket konsentrasjon.
  3. Hvis en mer konsentrert løsning ønskes, utfør ekstra sentrifugeringskjøringer ved hjelp av et ultra-sentrifugefilter.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

9. Mål LNP hydrodynamisk størrelse og polydispersitet

  1. Fortynn en aliquot av LNP-løsningen 40x med PBS for å oppnå et endelig volum på 1 ml.
    MERK: Denne fortynning kan endres om nødvendig. Denne fortynningsverdien foreslås da den bruker et lite volum av LNP-lagerløsningen samtidig som den gir kvalitetsresultater.
  2. Bruk en halvmikro-cuvette til å måle den hydrodynamiske diameteren og polydispersitetsindeksen. Tilsett LNP-løsningen i cuvette og sett den inn i instrumentet. Sett opp en driftsprosedyre i instrumentprogramvaren for å inkludere måletype, prøvedetaljer (materiale, dispergeringsmiddel, temperatur og celletype) og måleinstruksjoner (antall løp). Klikk Start når du er klar til å starte målanskaffelsen.

10. Mål LNP zeta potensial

  1. Fortynn en aliquot av LNP-løsningen 40x med nukleasefritt vann for å oppnå et endelig volum på 1 ml.
    MERK: Nukleasefritt vann brukes som løsningsmiddel for zeta potensielle målinger for å minimere påvirkningen av høye saltbuffere på konduktivitet.
  2. Bruk en foldet kapillær zetacelle, mål zetapotensialet.
    1. Legg LNP-løsningen i cuvette opp til fylllinjen. Sett inn i instrumentet og påse at elektrodene kommer i kontakt med instrumentet.
    2. Sett opp en driftsprosedyre i instrumentprogramvaren for å inkludere måletype, prøvedetaljer (materiale, dispergeringsmiddel, temperatur og celletype) og måleinstruksjoner (antall løp). Klikk Start når du er klar til å starte målanskaffelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere partier med LP-er med samme lipidformulering og N/P-forhold på 6 ble utviklet på separate dager for å demonstrere reproduserbarhet av teknikken. Parti 1 og 2 resulterte i overlappende størrelsesfordelinger med lignende polydispersitet (figur 2A) Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i størrelsen eller innkapslingseffektiviteten mellom de to forskjellige partiene (Figur 2B). Innkapslingseffektiviteten var høy for hvert parti (>98,5%) og størrelsene var like med en 77 nm LNP-diameter. Partiklene var ensartede med en gjennomsnittlig polydispersitetsindeks (PDI) på 0,15 for parti 1 og 0,18 for batch 2.

Endringer i formuleringsparametere viste noen små, men statistisk signifikante forskjeller med hensyn til N/P-forholdet, ionizerbar lipid som ble brukt og nukleinsyre innkapslet. Mens forskjeller diskuteres, er det viktig å merke seg at alle LNPer dannet resulterte i innkapsling større enn 80%, med de fleste formuleringer større enn 95%, og partikkelstørrelser mindre enn 110 nm, noe som gjør alle formuleringer utviklet her ønskelig for genlevering. For det første ble ionizable lipid A brukt til å utvikle LP-er ved en N/P på 10 og 36. Reduksjon av N/P-forholdet resulterte i en 4 % reduksjon i innkapslingseffektiviteten og en økning i LNPs hydrodynamiske diameter fra 98 nm ved N/P = 36 til 109 nm ved N/P = 10 (figur 3A). Sammenligning av LNPer med ioniserbar lipid A med en annen ioniserbar lipid B og vedlikehold av N/P på 36 resulterte i en betydelig endring i innkapslingseffektivitet, hvor 100% av pDNA ble innkapslet med LNPer dannet ved hjelp av ionizable lipid A og 81% av pDNA ble innkapslet med LNPs dannet ved hjelp av ionizable lipid B (Figur 3B ). Iionizable lipid B LNPer resulterte også i litt mindre partikler med en hydrodynamisk diameter på 95 nm. Til slutt ble LNPer dannet ved hjelp av ionizable lipid A med både mRNA og pDNA. LNPs innkapsling pDNA resulterte i større partikler med en diameter på 119 nm sammenlignet med mRNA LNPer med en diameter på 91 nm (figur 3C). Både pDNA og mRNA LNPs resulterte i lignende innkapslingseffektivitet på ~ 91-94%.

Til slutt påvirket ikke endringer i prosessparameteren for strømningshastighet LNPene som ble utviklet med strømningshastighetene som ble testet her. Ved både 4 ml/min og 12 ml/min ble LNPer utviklet og karakterisert for å ha innkapslet 96 % av pDNA og hatt en diameter på 110 nm (figur 4). Alle LNPer uavhengig av prosessparameter eller formuleringsparameter resulterte i ladenøytrale zeta-potensielle målinger.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for utvikling og karakterisering av LNP. For det første er lipidblanding og nukleinsyreløsninger laget (1 og 2). Lipidblandingen inneholder den ionizable lipiden, hjelperlipiden, kolesterolet og PEG i etanol, mens nukleinsyreoppløsningen inneholder enten mRNA eller DNA i buffer. Løsningene blandes ved hjelp av en mikrofluidisk patron (3), som danner LNPer (4). Deretter kreves en bufferutveksling for å fjerne etanol og øke løsningen pH til nøytral (5). Karakterisering av LP-er utføres for å bestemme innkapslingseffektivitet og partikkelstørrelse, polydispersitet og zetapotensial ved hjelp av en fluorescensmikroplateanalyse og zetasizer, henholdsvis (6 og 7). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Batch til batch reproduserbarhet av LNPer dannet på separate dager. (A) Størrelsesfordelinger for parti 1 vs. batch 2 (B) Innkapslingseffektivitet (%) og hydrodynamisk diameter (nm) for hvert parti med mRNA og N/P = 6. Feilfelt noterer seg standardavvik. Statistisk analyse med toveis ANOVA med α = 0,05 viser ingen betydning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Variasjoner av formuleringsparametere. (A) LNPer dannet ved N/P = 10 og 36, begge ved hjelp av ionizable lipid A med pDNA. (B) LNPer dannet med ionizable lipid A og iionizable lipid B både ved N/P = 36 med pDNA. (C) LNPer dannet med enten mRNA eller pDNA begge ved hjelp av ionizable lipid C ved N /P = 6. Feilfelt noterer seg standardavvik. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av toveis ANOVA med α = 0,05; *p<0,05; **p<0,01; p<0.001; p<0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Variasjoner av prosessparametere. LNPer dannet med en strømningshastighet på 4 og 12 ml/min ved bruk av ioniserbar lipid A med pDNA ved N/P = 10. Feilfelt noterer seg standardavvik. Statistisk analyse med toveis ANOVA med α = 0,05 viser ingen betydning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lipid Molar-forholdet Lager lipid konsentrasjon (mM) Konsentrasjon i etanol for lipidblanding (mM) Volum (μL)
Iioniserbar lipid 50 38.9 5 68.5
Lipid for hjelper 10 10 1 53.3
Kolesterol 39 20 3.9 103.9
C-14 PEG 1 1 0.1 53.3
EtOH 254
Total 533

Tabell 1: Eksempel lipidblanding for å klargjøre 1 ml LNPer. Lipidbestandskonsentrasjonene i etanol som følger med har vist seg å tillate lipidene å løse seg i etanol, men andre lagerkonsentrasjoner kan brukes og vil ikke påvirke utfallet så lenge lipiden er solubilisert. Eksempelkonsentrasjoner av lipider i etanol for mikrofluidisk blanding er også gitt. Disse konsentrasjonene er basert på molarforholdet, som kan varieres basert på ønsket LNP-forberedelse.

Grunning Formulering
Volum (ml) 2 1.37
Strømningshastighetsforhold (vandig:EtOH) 3:1 3:1
Total strømningshastighet (ml/min) 12 4
Venstre sprøytestørrelse (ml) 3 3
Riktig sprøytestørrelse (ml) 1 1
Start avfallsvolum (ml) 0.35 0.25
Slutt på avfallsvolum (ml) 0.05 0.05

Tabell 2: Mikrofluidisk blanding Benk topp instrument programvare grunning og LNP formulering eksempel parametere

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Reproduserbarhet, hastighet og lavvolumscreening er betydelige fordeler ved å bruke mikrofluidisk blanding til å danne LNPer sammenlignet med andre eksisterende metoder (f.eks. lipidfilmhydrering og etanolinjeksjon). Vi har demonstrert reproduserbarheten av denne metoden uten innvirkning på innkapslingseffektivitet eller partikkelstørrelse observert med forskjellige LNP-partier. Dette er et viktig kriterium for enhver terapeutisk, inkludert LNPer, å bli klinisk tilgjengelig.

Teknikken beskrevet her bruker forskjøvet sildbein mikrofluidisk blanding, noe som resulterer i LNP-dannelse på tidsskalaen på bare noen få minutter. Denne blandingen bruker kaotisk adveksjon som er fordelaktig for blanding av kontroll og forkortet tid27. Denne mikseren gjør det mulig for de vandige og organiske fasene å effektivt vikle seg rundt hverandre27. Ved hjelp av forskjøvet sildbeinblanding har tidligere studier vist at partiklene dannes i den minste termodynamisk stabile størrelsen32, noe som betyr at sammensetningen har en tendens til å påvirke størrelsen og polydispersiteten til LNPs27,32,33. Dette ble observert i de representative resultatene, hvor N / P-forholdet, ionizabel lipid som ble brukt og nukleinsyre innkapslet var de påvirkende faktorene på endringer i innkapslingseffektivitet og partikkelstørrelse. Driftsparametere, for eksempel strømningshastighet og blandingsforhold, kan også påvirke størrelsen over en bestemt terskel, der partikkelstørrelsen etterpå er på sin minste stabile størrelse27,33. Det ble ikke observert noen endring i innkapslingseffektivitet eller partikkelstørrelse ved bruk av en strømningshastighet på 4 ml/min i forhold til 12 ml/min. Dermed er sannsynligvis begge strømningshastighetene over terskelen som vil påvirke LNP-utfallet. Eksempeleksperimentet, og resultatene beskrevet ovenfor, brukte lipid A og pDNA. Det er mulig at forskjellige ioniserbare lipider og nukleinsyrer kan ha større innflytelse på LNP-egenskaper med hensyn til strømningshastighet. Andre typer mikrofluidisk blanding inkluderer T-krysset, som bruker turbulent strømning og den mikrofluidiske hydrodynamiske fokuseringsmetoden som er basert på konvektiv-diffusiv blanding27. Sammenlignet med disse andre typer mikrofluidiske blandingsteknikker for LNP-utvikling, muliggjør den forskjøvede sildbeinblandingen kombinasjonen av tre viktige kriterier: rask blanding, minimere batch til batchvariabilitet, og er kommersielt tilgjengelig27. Alle de tre mikrofluidiske blandingsmetodene gir mulighet for høyere innkapslingseffektivitet og kontrollert størrelse sammenlignet med konvensjonell lipidfilmhydrering eller etanolinjeksjonsmetoder27.

Endelig er evnen til å produsere lave volumer av ulike LNP-formuleringer på forsknings- og utviklingsstadiet en betydelig fordel. En utfordring med å utvikle LP-er er antall variabler som kan testes og optimaliseres per formulering for å oppnå ønsket resultat og effekt. Lipider og nukleinsyrer kan være kostnadsbesparende å screene, feilsøke og modifisere mange formuleringsparametere (f.eks. molarforhold, N / P-forhold, prosessparametere, etc.) for å finne den mest passende LNP for en gitt søknad. Selv om lave volumer kan være en begrensning for å produsere en endelig formulering i stor skala, er evnen til å skalere opp teknikken med større mikrofluidiske blandeinstrumenter kommersielt tilgjengelig.

Kritiske trinn i protokollen starter med riktig lagring av lipid lagerløsninger etter produsentens anbefaling. LNPer skal deretter oppbevares ved 2-8 °C inntil videre bruk. For nukleinsyrepreparatet viser resultatene som presenteres at citratbuffer og malinsyrebuffer er effektive til å danne LP-er med høy nukleinsyreinnkapsling34,35. Andre buffere kan brukes i stedet hvis ønskelig. Hvis en annen buffer er valgt, er det viktig å opprettholde pH under pKa av den ionizable lipiden for å sikre at lipiden er kationisk og kan komplekse med nukleinsyren. Ved bruk av det mikrofluidiske blandeinstrumentet er det viktig å klargjøre patronen før LNP-dannelse, ikke å overskride patronbruken som anbefalt av produsenten, og å bytte patronen mellom forskjellige formuleringssammensetninger. Det vanligste strømningsforholdet for dannelse av vandig: organisk løsning er 3: 1; Dette kan imidlertid endres om nødvendig. Strømningshastigheten kan også justeres etter ønske. Til slutt er det viktig når du arbeider med mRNA for å sikre et RNase-fritt miljø gjennom hele prosessen. Hvis ønsket størrelse eller innkapslingseffektivitet ikke oppnås, inkluderer noen steder å begynne feilsøkingen å endre N / P-forholdet som brukes eller lipidmolarprosentene. Instrumentprosessen som er beskrevet her, bruker en stasjonær modell som har en maksimal volumgrense på 12 ml, selv om denne prosessen er skalerbar for større volumer ved hjelp av forskjellige mikrofluidiske blandemodeller. Denne prosessen kan tilpasses endringer i lipidblandinger og nukleinsyrer til bruk i utvikling av LNPer for ulike kliniske indikasjoner. Med denne fleksibiliteten kan mange fremtidige applikasjoner oppnås med LNPer for å produsere forskjellige ønskede formuleringer. Denne teknikken har også blitt brukt til å utvikle andre typer nanopartikler, inkludert liposomer og polymere nanopartikler. Med noen parameterendringer kan denne metoden brukes til en rekke nanopartikkelformuleringer.

Protokollen som er beskrevet her beskriver en reproduserbar metode for å oppnå mRNA- eller DNA-innkapslede LNPer. I tillegg til prosessparametere kan ytterligere hensyn påvirke LNP-utfallet. Tidligere arbeid har også brukt lignende metoder for å produsere LNPer med ulike nukleinsyrer, iioniserbare lipider, N / P-forhold, PEG-koblingslengde, etc. Disse parametrene kan påvirke innkapslingseffektiviteten, størrelsen og ladningen til partiklene. Instrumentprodusenten har også notert lignende endringer avhengig av disse parametrene som kan optimaliseres18,36. Disse parametrene kan ytterligere påvirke biodistribusjon og effekt av nukleinsyren. For eksempel har studier undersøkt hydrokarbonkjedelengder (C14, C16 og C18) konjugert til PEG og funnet ut at den kortere akrylkjeden av C14 resulterte i høyere nivåer av leveropptak sammenlignet med den lengre acylkjeden, som forble i omløp i en lengre periode28. Denne protokollen muliggjør dannelse, optimalisering og testing av LNPer med varierte komposisjoner, noe som gjør dette til en allsidig prosess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er ansatte i Sanofi. Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt eller konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Takk til Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger og Philip Zakas for deres veiledning og bidrag til LNP-utvikling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Tags

Bioengineering Utgave 168 lipid nanopartikkel nukleinsyre messenger RNA DNA mikrofluidisk forskjøvet sildbeinblander
Formulere og karakterisere Lipid nanopartikler for genlevering ved hjelp av en mikrofluidisk blandeplattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P.,… More

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter