Summary
De gepresenteerde protocollen kunnen worden gebruikt om de respons van fluorescerend gelabelde microbubbels te karakteriseren die zijn ontworpen voor toepassingen met echografie-geactiveerde medicijnafgifte, inclusief hun activeringsmechanismen en hun bio-effecten. Dit artikel behandelt een reeks in vitro en in vivo microscopietechnieken die worden uitgevoerd om de relevante lengte en tijdschalen vast te leggen.
Abstract
Microbubbelcontrastmiddelen zijn veelbelovend voor medicijnafgiftetoepassingen met echografie. Het inkapselen van geneesmiddelen in nanodeeltjes vermindert de systemische toxiciteit en verhoogt de circulatietijd van de geneesmiddelen. In een nieuwe benadering van microbubbel-geassisteerde medicijnafgifte worden nanodeeltjes opgenomen in of op microbubbelschalen, waardoor lokale en geactiveerde afgifte van de nanodeeltjeslading met echografie mogelijk is. Een grondig begrip van de afgiftemechanismen binnen de enorme ultrasone parameterruimte is cruciaal voor een efficiënte en gecontroleerde afgifte. Deze set gepresenteerde protocollen is van toepassing op microbubbels met een schaal met een fluorescerend label. Hier ligt de focus op microbubbels geladen met poly (2-ethyl-butylcyanoacrylaat) polymere nanodeeltjes, gedopeerd met een gemodificeerde Nijlrode kleurstof. De deeltjes worden gefixeerd in een gedenatureerde caseïneschil. De microbubbels worden geproduceerd door krachtig roeren, waardoor een dispersie van perfluorpropaangas in de vloeibare fase wordt gevormd die caseïne en nanodeeltjes bevat, waarna de microbubbelschaal zichzelf assembleert. Een verscheidenheid aan microscopietechnieken zijn nodig om de nanodeeltjesgestabiliseerde microbubbels te karakteriseren op alle relevante tijdschalen van het nanodeeltjesafgifteproces. Fluorescentie van de nanodeeltjes maakt confocale beeldvorming van enkele microbubbels mogelijk, waardoor de deeltjesverdeling in de schaal wordt onthuld. In vitro ultrasnelle beeldvorming met behulp van bright-field microscopie met 10 miljoen frames per seconde geeft inzicht in de beldynamiek in reactie op ultrasone insonatie. Ten slotte kan het vrijkomen van nanodeeltjes uit de bellenschil het best worden gevisualiseerd door middel van fluorescentiemicroscopie, uitgevoerd met 500.000 frames per seconde. Om de toediening van geneesmiddelen in vivo te karakteriseren, wordt de geactiveerde afgifte van nanodeeltjes in de vasculatuur en hun extravasatie buiten de endotheellaag bestudeerd met behulp van intravitale microscopie in tumoren die zijn geïmplanteerd in dorsale huidplooivensterkamers, over een tijdschaal van enkele minuten. De combinatie van deze complementaire karakteriseringstechnieken biedt uniek inzicht in het gedrag van microbubbels en hun payload-afgifte op een reeks tijd- en lengteschalen, zowel in vitro als in vivo.
Introduction
Echografie is de meest gebruikte medische beeldvormingstechniek. Het is niet-invasief, snel, veilig, kosteneffectief en draagbaar1,2,3. Bloed is echter een slechte ultrasone verstrooier en het contrast van de bloedpool kan worden versterkt door een intraveneuze injectie van ultrasone contrastmiddelen3. Dit verbeterde bloedpoolcontrast maakt de kwantificering van orgaanperfusie voor diagnostische doeleinden mogelijk, bijvoorbeeld bij de detectie van coronaire hartziekte4 en gemetastaseerde leverziekte5. Inderdaad, tumor vasculatuur bleek een belangrijke prognostische factor te zijn6. Een grote onderzoeksinspanning is nu gericht op microbubbel-geassisteerde, gerichte moleculaire beeldvorming en het op maat maken van contrastmiddelen voor therapeutisch gebruik.
In de handel verkrijgbare ultrasone contrastmiddelen bestaan meestal uit een suspensie van gecoate microbubbels7,8 met diameters variërend van 1 μm tot 10 μm9. Omdat microbubbels van ultrasoon contrastmiddel iets kleiner zijn dan rode bloedcellen7, kunnen de microbubbels zelfs de kleinste haarvaten veilig bereiken zonder een occlusie te creëren3. Microbubbels hebben een dramatisch verhoogde ultrasone backscatteringscoëfficiënt in vergelijking met weefsel10, vanwege hun samendrukbare gaskern11. Bovendien is de microbubbelecho zeer niet-lineair, d.w.z. het spectrum bevat harmonischen en subharmonieën van de aandrijffrequentie. Daarnaast is de echosterkte sterk afhankelijk van de resonantierespons van de bubble12. Hoewel weefsel slechts lineair verstrooit, is een klein aantal microbubbels voldoende om een hoge detectiegevoeligheid te bereiken in harmonische beeldvorming13,14. Deze niet-lineaire contrastgeneratie kan zelfs sterk genoeg zijn om enkele bellen in het lichaam te volgen15.
De schil van het ultrasone contrastmiddel stabiliseert de bellen tegen ontbinding en coalescentie, waardoor hun circulatietijd in de bloedpool toeneemt16. De schil kan bestaan uit lipiden, polymeren of gedenatureerde eiwitten3,8. Het vermindert de interfaciale spanning, waardoor het effect van Laplace drukgestuurde oplossing17 wordt beperkt en een resistieve barrière tegen gasdiffusie wordt gecreëerd18. Om de stabiliteit verder te verhogen, worden de contrastmicrobubbels meestal gevuld met een gas met een hoog molecuulgewicht en een lage oplosbaarheid in bloed11. De microbubbelschaal verandert de reactie van de microbubbels op ultrasone insonatie drastisch11. Ongecoate gasbellen hebben een karakteristieke resonantiefrequentie die omgekeerd evenredig is met hun grootte en de toevoeging van een lipidecoating verhoogt de resonantiefrequentie ten opzichte van die van een ongecoate buble vanwege de intrinsieke stijfheid van de schaal3. Bovendien dissipeert de schaal energie door dilatatieviscositeit, die de dominante bron van demping vormt voor gecoate bellen3. De stabiliserende schaal heeft als bijkomend voordeel dat deze kan worden gefunctionaliseerd, bijvoorbeeld door gerichte liganden aan het oppervlak van microbubbels te binden. Deze targeting maakt vele toepassingen voor deze bubbels mogelijk en in het bijzonder moleculaire beeldvorming met echografie14,19.
Microbubbelcontrastmiddelen zijn veelbelovend voor medicijnafgiftetoepassingen met echografie. Microbubbels die oscilleren in de opsluiting van een bloedvat kunnen microstreaming veroorzaken, evenals lokale normale en schuifspanningen op de capillaire wand3. Bij hoge akoestische druk kunnen grote amplitude-oscillaties leiden tot microbubbelinstorting in een gewelddadig proces dat traagheidsholtatie wordt genoemd, wat op zijn beurt kan leiden tot breuk of invaginatie van het bloedvat20. Deze gewelddadige verschijnselen kunnen bio-effecten veroorzaken zoals sonopermeatie21, waardoor de extravasatie van therapeutische geneesmiddelen in het interstitium over de endotheelwand wordt verbeterd, paracellulair of transcellulair. Het kan ook de penetratie van therapeutische middelen verbeteren via de extracellulaire matrix van stromarijke tumoren21,22 en biofilms23,24, hoewel dit mechanisme nog steeds slecht wordt begrepen26.
Echografie-gemedieerde medicijnafgifte heeft veelbelovende resultaten laten zien, zowel preklinisch27,28 als in klinische onderzoeken22. Bovendien is gemeld dat microbubbels bij gebruik met relatief laagfrequente echografie (~ 1 MHz) lokaal en tijdelijk de bloed-hersenbarrièredoorlaatbaarheid verhogen, waardoor geneesmiddelen het hersenparenchym kunnen binnendringen, zowel in preklinische als klinische studies29,30,31,32,33,34.
Er zijn over het algemeen twee benaderingen voor echografie-gemedieerde medicijnafgifte: het therapeutische materiaal kan gelijktijdig met de bubbels worden toegediend, of het kan worden bevestigd aan of geladen in de bubbelschaal28,35,36. De tweede benadering is efficiënter gebleken in termen van medicijnafgifte37. Microbubbels kunnen worden geladen met geneesmiddelen of genetisch materiaal ingekapseld in nanodeeltjes (liposomen of polymere nanoconstructen) die aan de schaal zijn bevestigd of direct in de microbubbelschaal zijn opgenomen35,36. Microbubbels met nanodeeltjes kunnen worden geactiveerd door (gerichte) echografie om de nanodeeltjeslading lokaal vrij te geven28,33,38,39,40. Als zo'n microbubbel in direct contact staat met een cel, is in vitro aangetoond dat de lading zelfs op het cytoplasmatische membraan van de cel kan worden afgezet in een proces dat sonoprinting wordt genoemd34,35.
De ultrasone parameterruimte voor microbubbelinsonatie is uitgebreid en de in vivo biologische omstandigheden voegen de complexiteit verder toe. De combinatie van gerichte echografie en microbubbels met nanodeeltjes vormt dus een uitdaging op het gebied van gerichte therapieën.
Het doel van dit werk is om protocollen te bieden die kunnen worden gebruikt om de respons van microbubbels in detail in beeld te brengen als een functie van de ultrasone parameters en om de mechanismen te bestuderen die leiden tot shell-ruptuur en daaropvolgende afgifte van het fluorescerend gelabelde shell-materiaal. Deze set protocollen is van toepassing op microbubbels met schelpen die een fluorescerende kleurstof bevatten. Figuur 1 toont een schematische weergave van de polymere-nanodeeltjes-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbels ontwikkeld bij SINTEF (Trondheim, Noorwegen). Deze bellen zijn gevuld met perfluorpropaangas (C3F8) en de nanodeeltjes die de schaal stabiliseren bevatten NR668, een lipofiel derivaat van Nijlrood fluorescerende kleurstof38,43. De nanodeeltjes bestaan uit poly(2-ethyl-butylcyanoacrylaat) (PEBCA) en zijn PEGylated. Functionalisatie met polyethyleenglycol (PEG) vermindert opsonisatie en fagocytose door het mononucleaire fagocytensysteem, waardoor de circulatietijd wordt verlengd14,44. Als gevolg hiervan verhoogt PEGylation de hoeveelheid nanodeeltjes die de doellocatie bereiken, waardoor de werkzaamheid van de behandeling wordt verbeterd16. Figuur 2 illustreert hoe het gebruik van vier microscopiemethoden onderzoekers in staat stelt om alle relevante tijd- en lengteschalen te bestrijken. Opgemerkt moet worden dat de ruimtelijke resolutie die haalbaar is in optische microscopie wordt bepaald door de diffractielimiet, die afhankelijk is van de golflengte van het licht en het numerieke diafragma (NA) van het objectief en die van de objectverlichtingsbron45. Voor de systemen bij de hand is de optische resolutielimiet meestal 200 nm. Bovendien kan intravitale microscopie worden gebruikt om op subcellulair niveau in beeld te brengen46. Voor de nanodeeltjes-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbels die in dit werk worden gebruikt, is de minimale lengteschaal die relevant is voor intravitale microscopie de grootte van kleine haarvaten (≥10 μm). In vitro high-speed optische beeldvorming (10 miljoen frames per seconde) en high-speed fluorescentie beeldvorming (500.000 frames per seconde) experimenten worden beschreven voor enkele microbubbels. High-speed bright-field imaging op nanoseconde tijdschalen is geschikt om de tijd-opgeloste radiale dynamiek van de trillende bellen te bestuderen. Daarentegen maakt snelle fluorescentiemicroscopie directe visualisatie mogelijk van de afgifte van de fluorescerend gelabelde nanodeeltjes. Bovendien kan de structuur van de microbubbelschaal worden onderzocht met behulp van Z-stack driedimensionale (3D) confocale microscopie en scanning elektronenmicroscopie (het protocol voor de laatste is niet opgenomen in het huidige werk). Intravitale microscopie bestaat uit het gebruik van multifotonenmicroscopie om tumoren die groeien in dorsale vensterkamers in beeld te brengen om real-time informatie te verstrekken over de lokale bloedstroom en over het lot van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes in vivo47. De combinatie van deze microscopiemethoden geeft uiteindelijk gedetailleerd inzicht in het gedrag van therapeutische microbubbelmiddelen in reactie op echografie, zowel in vitro als in vivo.
Protocol
OPMERKING: Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Noorse autoriteiten voor dieronderzoek. Details van materialen die in het protocol zijn gebruikt, zijn te vinden in de tabel met materialen.
1. Productie van microbubbels
OPMERKING: In dit werk zijn de microbubbels van belang eiwit- en nanodeeltjesgestabiliseerde microbubbels, waarvoor het productieprotocol eerder is beschreven28,33,48. Daarom is het fabricageprotocol hier kort samengevat.
- Meng eerst met behulp van een pipet ultrapuur water met 0,5 wt% caseïne in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 wt% van de nanodeeltjes gelabeld met 0,21 wt% van de fluorescerende kleurstof, NR668 (gemodificeerd Nile Red), in een steriele glazen krimp topflacon (10 ml, diameter van 2 cm). De polymere nanodeeltjes worden bereid met behulp van de mini-emulsiepolymerisatiemethode zoals beschreven door Mørch et al. 38.
OPMERKING: Hier functioneert de kleurstof als een modelgeneesmiddel om visualisatie van de afgifte van nanodeeltjes mogelijk te maken. Draag bij het werken met de nanodeeltjesoplossing een laboratoriumjas, een bril en handschoenen. Veeg eventuele morsen van de nanodeeltjesoplossing onmiddellijk weg met 100% aceton. - Dop de injectieflacon met de rubberen dop, meng licht en plaats de injectieflacon gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in een ultrasoon bad om mogelijke aggregaten te elimineren. Plaats een dispersiegereedschap met de punt van de roerder op ~ 0,5 cm van de bodem van de glazen injectieflacon. Voeg met behulp van een glazen pipet die op de gascontainer is aangesloten, het perfluorpropaangas toe aan de kopruimte van de injectieflacon met de oplossing totdat de oplossing licht begint te borrelen.
OPMERKING: Wikkel zelfdichtende film rond de basis van het dispersiegereedschap om te voorkomen dat de glazen injectieflacon wegglijdt tijdens het roeren. - Roer de oplossing krachtig bij 1935 × g (24.000 tpm met een rotatiestraal van 3 mm) gedurende 4 minuten met behulp van het dispersiegereedschap. Sluit de injectieflacon met de rubberen dop en sluit de injectieflacon af voor verder gebruik.
OPMERKING: Het roeren vangt het gas op in de vloeistof. De microbubbelschaal assembleert zichzelf vervolgens zonder dat er een actieve stap nodig is. - Bewaar de overtollige caseïne- en nanodeeltjesoplossing bij 4 °C en reinig het dispersiegereedschap met 100% aceton.
2. Het in beeld brengen van enkele bubbels
- Confocale microscopie
- Monstervoorbereiding
- Verdun de bubbeloplossing om enkele microbubbels als volgt af te beelden. Plaats een ontluchtingsnaald (19 G-21 G) in een glazen injectieflacon met krimptop die de geproduceerde microbubbels bevat door de in rubriek 1 beschreven procedure te volgen. Draai de injectieflacon ondersteboven zodat grote bubbels zich van de verzegeling van de injectieflacon kunnen verwijderen.
- Steek nog een naaldpunt (19 G) van een kleine (~ 1 ml) spuit in de injectieflacon, terwijl de injectieflacon nog steeds ondersteboven is. Verwijder een kleine hoeveelheid van de bubbelsuspensie en breng de inhoud van de spuit over in een klein buisje voor gemakkelijker pipetteren in de volgende stap.
OPMERKING: Het volume van de te extraheren suspensie is direct afhankelijk van het type en de concentratie van de bellensuspensie. In dit geval werd 0,2 ml geëxtraheerd. - Verdun met behulp van een pipet de microbubbelsuspensie (uit sectie 1) in gefilterd PBS om een concentratie van ongeveer 2 × 105 tot 6 × 105 microbubbels/ml te bereiken om beeldvorming met één bubbel mogelijk te maken.
OPMERKING: Afhankelijk van het type bubbel wordt aanbevolen om de bubbelsuspensie te wassen om vrije fluorescerende kleurstof te verwijderen. Dit is vooral belangrijk bij bubbels waarvoor de fluorescerende kleurstof in de schaal wordt toegediend. Om bubbels te wassen, verdunt u de bellensuspensie (bijvoorbeeld door 100 μL van de bubbeloplossing in 10 ml PBS te nemen) en centrifugeert u deze (meestal met snelheden in de orde van grootte van 100 × g). Verwijder ten slotte het supernatant met de microbubbels met een pipet voor verdere analyse. De resterende oplossing bevat de vrije fluorescerende deeltjes en kan worden weggegooid. De wasstap moet indien nodig worden herhaald. - Voeg glycerol toe aan het mengsel om de viscositeit van het medium te verhogen en elimineer de beweging geïnduceerd door Brownse beweging die anders de vrij langzame confocale Z-stack beeldvorming zou verstoren.
OPMERKING: De hoeveelheid glycerol is afhankelijk van het type bubbel dat wordt afgebeeld (hier, ~ 50%). Voor sommige soorten bubbels kan glycerol een nadelig effect hebben op de stabiliteit49. Er werd echter geen merkbare verandering waargenomen in de bellen gedurende ongeveer 30 minuten onder confocale beeldvorming. Bovendien kan glycerol de akoestische respons van microbubbels veranderen en kan daarom alleen worden gebruikt met beeldvormingsmethoden waarbij de microbubbels niet worden geïnsoneerd. - Plaats de microbubbelsuspensie in een kamer met dunne wanden voor een optimale beeldvorming, zoals een kanaalschuif.
- Beeldprotocol
- Schakel de confocale microscoop in en selecteer een geschikt objectief en de gewenste laser en scanner om te gebruiken tijdens confocale microscopie.
OPMERKING: Gebruik hier een 60x waterdompelingsobjectief voor een resolutie van 0,08 μm / pixel en afhankelijk van de belgrootte, beeld een gebied van 256 x 256 pixels of 128 x 128 pixels in. Gebruik in deze specifieke experimenten een 488 nm laser en een Galvano scanner. De emissiegolflengte is afhankelijk van de fluorescerende kleurstof en is meestal breedbandig. - Zoek een microbubbel in bright-field en schakel over op confocale microscopie. Stel de gewenste boven- en ondervlakken in waartussen de confocale microscoop zal scannen. Verkrijg een Z-stack om de 3D-structuur te observeren; gebruik een stapgrootte van 100 nm in de Z-richting.
- Schakel de confocale microscoop in en selecteer een geschikt objectief en de gewenste laser en scanner om te gebruiken tijdens confocale microscopie.
- Monstervoorbereiding
- Bright-field microscopie
- Montage van het optische systeem
OPMERKING: Een schematische weergave van de bright-field microscopie-opstelling wordt weergegeven in figuur 3A. Om ongestoorde ultrasone voortplanting te garanderen, bevat het waterbad twee openingen: een voor een lichtbron en een voor een ultrasone transducer. Het optische systeem bestaat uit een (modulaire) microscoop, een hogesnelheidscamera en bijpassende optiek. Aangezien de periode van microbubbeloscillaties meestal in de orde van 1 μs is (met behulp van 1 MHz ultrageluid), moet de camera worden ingesteld om op te nemen met een framerate van ten minste 5 miljoen frames per seconde. Hier moet de camera worden ingesteld om op te nemen met 10 miljoen frames per seconde (256 x 400 pixels) voor 256 frames (25,6 μs) om alle details van de bellendynamiek vast te leggen, inclusief hogere harmonischen.- Bevestig een water-immersie objectief met een geschikte vergroting, werkafstand en NA aan de microscoop.
OPMERKING: Een waterafzinkingsdoelstelling werd gebruikt om een stabiele werkafstand te bieden ondanks geleidelijke verdamping van het water. Hier werd gekozen voor een waterafzinkingsobjectief met een vergroting van 60x, een werkafstand van 2 mm en een NA van 1. - Gebruik een stroboscooplamp met een piekvermogen van ten minste 1 kW voor verlichting en een buislens tussen de microscoop en de camera om ervoor te zorgen dat zo min mogelijk omgevingslicht de sensor van de hogesnelheidscamera bereikt.
- Gebruik een dimbare halogeenlichtbron voor het scherpstellen op enkele microbubbels en uitlijning van het optische en akoestische systeem voor real-time beeldvorming.
- Bevestig een water-immersie objectief met een geschikte vergroting, werkafstand en NA aan de microscoop.
- Montage van het akoestische systeem
- Gebruik een programmeerbare willekeurige golfvormgenerator en een eindversterker (56 dB versterking) om de transducer aan te drijven met een gladde omhulling en golfvorm. Sluit een oscilloscoop aan op de willekeurige golfvormgenerator om het signaal te controleren. Sluit een personal computer aan op de willekeurige golfvormgenerator om de inkomende akoestische drukgolf te programmeren, met behulp van een script dat in eigen huis is geschreven.
- Gebruik een puls-/vertragingsgenerator als hoofdtrigger om de optische en akoestische systemen te synchroniseren. Stel de triggervertragingen op de puls-/vertragingsgenerator en de camerasoftware zo in dat de opname 16 μs na ultrasone transmissie start om de ultrasone golf de bellen te laten bereiken. Activeer de lichtbron 1,5 μs voor het begin van de opname om te zorgen voor een goede verlichting tijdens de bellenoscillaties (zie figuur 3B voor het timingdiagram).
- Kies een geschikte transducer met een geschikte middenfrequentie. Plaats het in een opening van het waterbad, zodat het zich onder een hoek ten opzichte van de optische as bevindt om reflecties van de membranen van de monsterhouder te minimaliseren en de vorming van staande golven te verminderen.
OPMERKING: Hier werd een op één element gerichte dompeltransducer geplaatst met een middenfrequentie van 2,25 MHz, een brandpuntsafstand van 1" en een elementdiameter van 0,75" onder een hoek van 35° ten opzichte van de optische as. De kalibratie van de overdrachtsfunctie moet worden uitgevoerd met dezelfde versterker die wordt gebruikt in het akoestische systeem. Kalibreer de overdrachtsfunctie van spanningsamplitude naar drukamplitude van de transducer met behulp van een glasvezelhydrofoon als functie van de ultrasone zendfrequentie.
- De monsterhouder kiezen
- Gebruik een monsterhouder met optisch en akoestisch transparante membranen en een volume dat groot genoeg is om verschillende afzonderlijke microbubbels binnen hetzelfde monster in beeld te brengen.
OPMERKING: Hier werd een celkweekcassette gebruikt met een volume van 10 ml, membraanoppervlakken van 25 cm2 en membraandikte van 175 μm. Door akoestische reflecties op het onderste membraan en interferentie van golven die worden gereflecteerd door het microscoopobjectief en het bovenste membraan, kan de in situ akoestische druk verschillen van die op de willekeurige golfvormgenerator. Door de transducer onder een hoek ten opzichte van de membranen van de monsterhouder te plaatsen, wordt de vorming van staande golven verminderd, maar kan de reflecties van de membranen toenemen. - Zorg ervoor dat het monster volledig kan worden ondergedompeld en binnen de focus van zowel de transducer als het microscoopobjectief kan worden gebracht. Gebruik een aluminium ondersteuning die is bevestigd aan een 3D-micropositioneringsfase om de monsterhouder onafhankelijk te verplaatsen.
- Gebruik een monsterhouder met optisch en akoestisch transparante membranen en een volume dat groot genoeg is om verschillende afzonderlijke microbubbels binnen hetzelfde monster in beeld te brengen.
- Uitlijning van de optische en akoestische systemen
- Voor 3D-vertaling om de opstelling uit te lijnen, bevestigt u het waterbad aan een XY-translatiefase en bevestigt u het werkgebied aan een optische tabel om ervoor te zorgen dat het niet beweegt tijdens experimenten. Vul vervolgens het waterbad met water en schakel de dimbare halogeenlichtbron in. Beweeg tijdens het uitlijnen het microscoopobjectief naar de zijkant om ultrasone reflecties te voorkomen.
- Bevestig een naaldhydrofoon (0,2 mm) aan de monsterhouderarm en plaats de naaldhydrofoon in het waterbad, met de punt in het gezichtsveld van het objectief. Schakel de versterker en de willekeurige golfvormgenerator in; gebruik enkele pulsen van 5 tot 10 ultrasone cycli en een pulsherhalingsfrequentie van 15 Hz. Zorg ervoor dat de hydrofoonpunt gecentreerd is en scherp is op het microscoopbeeld. Beweeg de tank in de XY-richting en de naald in de Z-richting totdat de maximale drukamplitude is bereikt.
- Pas de focus van de microscoop aan om opnieuw scherp te stellen op de punt van de hydrofoon.
OPMERKING: Dit protocol zorgt voor de uitlijning tussen de microscoopfocus en de transducerfocus. Verander de positie van de microscoop en de transducer niet na uitlijning.
- Monstervoorbereiding
- Herhaal stap 2.1.1.1 tot en met 2.1.1.3 om de monsteroplossing te bereiden. Verdun de bubbeloplossing om beeldvorming met één bubbel mogelijk te maken en akoestische interacties van naburige bellen uit te sluiten.
- Open de uitlaat van de monsterhouder. Injecteer de monsteroplossing met behulp van een spuit in de andere opening van de monsterhouder totdat deze volledig is gevuld. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de monsterhouder zitten om ongewenste interacties met het ultrasone veld te voorkomen.
- Sluit beide kleppen van de monsterhouder en plaats de monsterhouder loodrecht op de optische as.
OPMERKING: Houd de gevulde monsterhouder waterpas om te voorkomen dat de bellen tijdens het verplaatsen naar één kant van de monsterhouder verschuiven.
- Beeldprotocol
- Programmeer de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische druk in de willekeurige golfvormgenerator via het bovengenoemde in-house geschreven script.
OPMERKING: Hier was de akoestische drukgolf een enkele uitbarsting van 40 cycli, met een 8-cyclus Gauss-taps toelopende puls. Ultrasone frequenties die in deze experimenten werden gebruikt, waren 1 MHz, 2 MHz of 3 MHz, met akoestische drukamplitudes variërend van 81 kPa tot 1200 kPa. - Verplaats de monsterhouder met de monsteroplossing met behulp van de XYZ-trap om enkele microbubbels in de focus van de microscoop te lokaliseren. Begin met een gezichtsveld in een hoek van de monsterhouder en zorg ervoor dat de rand van de microbubbels duidelijk zichtbaar en scherp is (zie figuur 3C voor een ideaal camerabeeld).
- Bevestig het uiteinde van een optische vezel die eerder was aangesloten op het halogeenlicht aan een stroboscooplamp, zodat het andere uiteinde nog steeds verbonden is met het waterbad. Activeer de opname.
- Herhaal stap 2.2.6.2 tot en met 2.2.6.3 zo vaak als gewenst per ultrasone instelling (frequentie en akoestische druk), waarbij de celkweekcassette met de microbubbels ten minste 2 mm (in het brandpuntsvlak) van de vorige locatie wordt verplaatst om ervoor te zorgen dat de microbubbels in het gezichtsveld niet in eerdere experimenten worden geïnsoneerd.
OPMERKING: Hier werd elk experiment ~ 20 keer herhaald. Wanneer de hele monsterhouder is geïnsoneerd, leegt u de monsterhouder en vult u deze opnieuw met een nieuwe monsteroplossing voor volgende experimenten.
- Programmeer de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische druk in de willekeurige golfvormgenerator via het bovengenoemde in-house geschreven script.
- Data-analyse
- Adopteer een programmeeromgeving om gegevensanalyse uit te voeren volgens de onderzoeksvraag en voer randdetectie uit na het verwerken van de afbeeldingen. Gebruik een functie die eigenschappen van afbeeldingsgebieden meet, zoek de middelpunten van een bel en de afgeleide van het intensiteitsprofiel rond elke bel om de contour van de bel (en dus de belradius R) te detecteren. Extraheer relevante parameters uit de straal in de loop van de tijd voor enkele microbubbels.
OPMERKING: In deze studie werd een programmeeromgeving gebruikt voor beeldverwerking om opnames van afzonderlijke microbubbels te binariseren en te filteren. Een intern script werd gebruikt om de afgeleide van het intensiteitsprofiel rond elke bubbel te vinden.
- Adopteer een programmeeromgeving om gegevensanalyse uit te voeren volgens de onderzoeksvraag en voer randdetectie uit na het verwerken van de afbeeldingen. Gebruik een functie die eigenschappen van afbeeldingsgebieden meet, zoek de middelpunten van een bel en de afgeleide van het intensiteitsprofiel rond elke bel om de contour van de bel (en dus de belradius R) te detecteren. Extraheer relevante parameters uit de straal in de loop van de tijd voor enkele microbubbels.
- Montage van het optische systeem
- Fluorescentiemicroscopie
- Montage van het optische systeem
- Bouw de opstelling voor fluorescentiemicroscopie (figuur 4A), met dezelfde basis die wordt gebruikt in de helderveldmicroscopie die wordt beschreven in paragraaf 2.2.
OPMERKING: De in punt 2.3 beschreven opstelling kan worden gecombineerd met de opstelling die in rubriek 2.2 wordt beschreven voor bright-field microscopie. De combinatie van zowel fluorescentiemicroscopie als bright-field microscopie maakt visualisatie van de microbubbelgaskern mogelijk terwijl de afgifte van nanodeeltjes in beeld wordt gebracht. - Stel de hogesnelheidscamera in op opnemen op 500.000 frames per seconde (400 x 250 pixels) voor 128 frames (256 μs).
OPMERKING: De beeldvormingstijd is langer dan in de heldere veldexperimenten omdat de lichtintensiteit beperkt is in fluorescentie en omdat de tijdschaal waarover deeltjesafgifte plaatsvindt langer is dan die van de beldynamiek. - Selecteer een laser met een vermogen dat hoog genoeg is om voldoende licht te leveren en dat een geschikte excitatiegolflengte heeft, en zorg ervoor dat deze is gekoppeld aan een acousto-optische modulator om te voorkomen dat het monster wordt gebleekt.
OPMERKING: In deze studie werd een 5 W continue golflaser met een excitatiegolflengte van 532 nm gebruikt om de fluorescentie van de nanodeeltjes te prikkelen. - Plaats een bundelsplitser, dichroïsche spiegel en inkepingsfilter tussen de laser en het microscoopobjectief om het excitatielicht naar het monster te richten terwijl de fluorescentie-emissie de camera kan bereiken.
- Bouw de opstelling voor fluorescentiemicroscopie (figuur 4A), met dezelfde basis die wordt gebruikt in de helderveldmicroscopie die wordt beschreven in paragraaf 2.2.
- Montage van het akoestische systeem
- Om de microbubbels te insoneren, gebruikt u dezelfde akoestische opstelling als in paragraaf 2.2.2. Verander de transducer in deze specifieke experimenten in een enkel-element, gerichte onderdompelingstransducer met een middenfrequentie van 2,25 MHz, een brandpuntsafstand van 1,88 "en een elementdiameter van 1". Plaats het onder een hoek van 35° ten opzichte van de optische as om reflecties van de membranen van de monsterhouder te minimaliseren en staande golfformaties te verminderen.
- Uitlijning van de optische en akoestische systemen
- Herhaal de stappen die worden beschreven in punt 2.2.4.
- Monstervoorbereiding
- Bereid de monsteroplossing zoals beschreven in rubriek 2.2.5.
- Beeldprotocol
- Stel de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische drukamplitude in op de willekeurige golfvormgenerator via het bovengenoemde in-house geschreven script.
OPMERKING: Hier werd de akoestische drukgolf geprogrammeerd als een enkele uitbarsting van echografie van 140 cycli, met een 10-cyclus Gaussisch-taps toelopende puls. Langere pulsduur is over het algemeen nodig om bio-effecten te induceren in vergelijking met die welke nodig zijn om de bubbeldynamiek te bestuderen. Ultrasone frequenties die in deze experimenten werden gebruikt, waren 1 MHz, 2 MHz of 3 MHz, met akoestische drukamplitudes variërend van 81 kPa tot 1200 kPa. - Stel op de puls-/vertragingsgenerator de triggervertraging voor de laser in voor fluorescerende excitatie van de nanodeeltjes van de microbubbels tijdens de opname.
OPMERKING: Voor deze specifieke experimenten lag de triggervertraging tussen 20 μs en 170 μs voor een totale duur van 150 μs. Het timingdiagram is weergegeven in figuur 4B. - Verplaats de monsterhouder met de monsteroplossing met behulp van de XYZ-trap om enkele microbubbels in de focus van de microscoop te lokaliseren. Begin met een gezichtsveld van een hoek van de monsterhouder; zie figuur 4C voor een ideaal camerabeeld waarbij de interface van de microbubbels duidelijk zichtbaar en scherp is. Activeer de opname.
- Herhaal stap 2.3.5.3 zo vaak als gewenst per ultrasone instelling (frequentie en akoestische druk), waarbij de celkweekcassette met de microbubbels ten minste 2 mm (in het optische vlak) van de vorige locatie wordt verplaatst om ervoor te zorgen dat microbubbels in het gezichtsveld niet worden gesoniseerd in eerdere experimenten.
OPMERKING: In deze studie werd elk experiment ~ 10-20x herhaald. Wanneer de hele monsterhouder is geïnsoneerd, leegt u de monsterhouder en vult u deze opnieuw met een nieuwe monsteroplossing voor volgende experimenten. Welke afstand de monsterhouder tussen experimenten moet verplaatsen, hangt af van de grootte van de akoestische bundel.
- Stel de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische drukamplitude in op de willekeurige golfvormgenerator via het bovengenoemde in-house geschreven script.
- Data-analyse
- Analyseer de fluorescentiemicroscopie-opnames volgens de onderzoeksvraag. Bepaal voor elke microbubbel visueel of de levering van de nanodeeltjes in de fluorescentiemicroscopie-experimenten plaatsvond. Als loslating en afzetting van de nanodeeltjes van de gaskern op het monsterhoudermembraan wordt waargenomen voor een enkele microbubbel, voert u handmatig in dat de levering plaatsvond in de programmeeromgeving.
- Montage van het optische systeem
3. Intravitale microscopie
- Dorsale huidplooi raamkamerchirurgie (eerder beschreven26,47,50)
- Acclimatiseer de dieren gedurende een week voordat u de raamkamers plaatst. Hoewel zowel vrouwelijke als mannelijke muizen kunnen worden gebruikt en de leeftijd onbelangrijk is, moet u ervoor zorgen dat het gewicht van de muizen ten minste 22-24 g is, zodat de huid voldoende flexibel is.
- Voer de operatie uit onder algemene anesthesie met intraoperatieve en postoperatieve analgetische behandeling. Verdoof het dier door een subcutane injectie van fentanyl (0,05 mg/kg)/medetomidine (0,5 mg/kg)/midazolam (5 mg/kg)/water (2:1:2:5) in een dosis van 0,1 ml per gewicht van 10 g. Gebruik een verwarmingskussen of een verwarmingslamp om de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven.
- Trek zachtjes aan de dubbele huidlaag op de rug van het dier, zodat de huid wordt ingeklemd tussen twee symmetrische polyoxymethyleenframes van de raamkamer. Bevestig de kamer door twee schroeven te plaatsen die zich door de dubbele huidlaag uitstrekken en langs de bovenrand van de kamer hechten.
- Verwijder de huid in het ronde frame van de kamer aan één kant van de huidplooi. Plaats een afdekglas met een diameter van 11,8 mm in het frame waar de huid wordt verwijderd om een venster in het weefsel te vormen.
- Gebruik een subcutane injectie van atipemazol (2,5 mg /kg), flumazenil (0,5 mg / kg) en water (1:1: 8) in een dosis van 0,1 ml per 10 g als tegengif om de anesthesie te beëindigen. Plaats het dier een nacht in een verwarmd herstelrek. Vul het water voor de dieren aan met 25 mg / ml enrofloxacine om infectie op de operatieplaats te voorkomen.
- Tumormodel creatie
- Houd kankercellen op 37 °C en in een 5% CO2-atmosfeer in een geschikt kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine.
OPMERKING: De menselijke osteosarcoom (OHS) cellijn werd gebruikt in dit protocol, maar andere cellijnen kunnen ook worden gebruikt. - Verdoof het dier op de dag na stap 3.1.5 gedurende een paar minuten door isofluraan (5% tijdens inductie en 1-2% tijdens onderhoud). Verwijder het afdekglas, breng 5 × 106 kankercellen aan in 30 μL celkweekmedium en vervang het afdekglas.
- Laat de tumoren 2 weken groeien voordat u zich afbeeldt en controleer het gewicht en de gezondheidstoestand van de dieren ten minste 3 keer per week gedurende deze periode.
- Houd kankercellen op 37 °C en in een 5% CO2-atmosfeer in een geschikt kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine.
- Montage van het optische systeem
- Voer intravitale beeldvorming uit tijdens echografie (zoals beschreven in eerder werk26) met een geschikte microscoop en objectief, afhankelijk van de onderzoeksvraag die op het spel staat. Zie figuur 5A voor een schematische weergave van de experimentele opstelling.
OPMERKING: Voor dit specifieke experiment werd een multifotonenmicroscoop gebruikt, uitgerust met een 20x waterdippend objectief (NA van 1,0 en werkafstand van 2 mm) en een gepulseerde laser. Beelden werden verkregen in resonantie scanmodus met 31 frames per seconde (512 x 512 pixels) met een gezichtsveld van 400 x 400 μm2. De excitatiegolflengte was 790 nm. De filters voor de twee galliumarsenidefosfidedetectoren waren long-pass 590 nm en band-pass 525/50 nm voor de detectie van fluorescentie.
- Voer intravitale beeldvorming uit tijdens echografie (zoals beschreven in eerder werk26) met een geschikte microscoop en objectief, afhankelijk van de onderzoeksvraag die op het spel staat. Zie figuur 5A voor een schematische weergave van de experimentele opstelling.
- Montage van het akoestische systeem
- Monteer een geschikte ultrasone transducer in een golfgeleider (op maat gemaakt) die onder het objectief is geplaatst onder een hoek van 45 ° ten opzichte van de optische as om reflecties van het afdekglas van de dorsale huidplooivensterkamer te minimaliseren en staande golfformaties te verminderen. Vul de golfgeleider met gedestilleerd en ontgast water. Breng ultrasone koppelingsgel aan op de golfgeleider.
- Uitlijning van de optische en akoestische systemen
- Lijn de optische as uit met de focus van de echografie. Plaats een glasvezel hydrofoon in de focus van het doel. Schakel vervolgens de versterker en de willekeurige golfvormgenerator in om de transducer te prikkelen met korte uitbarstingen (5-10 cycli) met een pulsherhalingsfrequentie van 100 Hz en verplaats de ultrasone transducer naar de positie waar de hoogste druk wordt gedetecteerd met het hydrofoonsignaal op de oscilloscoop.
OPMERKING: Verander de positie van de transducer niet na uitlijning.
- Lijn de optische as uit met de focus van de echografie. Plaats een glasvezel hydrofoon in de focus van het doel. Schakel vervolgens de versterker en de willekeurige golfvormgenerator in om de transducer te prikkelen met korte uitbarstingen (5-10 cycli) met een pulsherhalingsfrequentie van 100 Hz en verplaats de ultrasone transducer naar de positie waar de hoogste druk wordt gedetecteerd met het hydrofoonsignaal op de oscilloscoop.
- Beeldprotocol
- Plaats de verwarmde dierhouder (speciaal ontworpen) aangesloten op een XY-positioneringstrap tussen de golfgeleider en het objectief en voeg meer koppelingsgel toe. Verdoof het dier en plaats een staartaderkatheter. Plaats de muis in de verwarmde houder en bevestig de raamkamer in de houder. Voeg een waterdruppel toe bovenop de afdekplaat in de raamkamer en beweeg het objectief op zijn plaats om het tumorweefsel in beeld te brengen.
-
Figuur 5B toont het timingdiagram van de experimenten die de volgorde van gebeurtenissen weergeven. Injecteer fluorescerend gelabeld 2 MDa dextran intraveneus (30 μL, 4 mg / ml verdund in zoutoplossing) om de vasculatuur te visualiseren en beweeg de muis met behulp van de XY-translatiefase om een positie te vinden met geschikte bloedvaten. Neem baselinebeelden op vóór de ultrasone behandeling. Pas de framesnelheid, het gezichtsveld en de lengte van de opname aan, afhankelijk van de onderzoeksvraag en de specifieke kenmerken van de microscoop en kleurstoffen die moeten worden afgebeeld.
OPMERKING: In deze experimenten werden 31 frames per seconde opgenomen met een gezichtsveld van 400 x 400 μm2 en werd gedurende 5 minuten continu beeldmateriaal gemaakt. - Stel de gewenste ultrasone rijfrequentie, pulslengte en akoestische drukamplitude in op de willekeurige golfvormgenerator.
OPMERKING: Voor deze experimenten werd een frequentie van 1 MHz gebruikt met een pulslengte van 10 ms en pieknegatieve drukamplitudes tussen 0,2 MPa en 0,8 MPa. Een pulsherhalingsfrequentie van 0,5 Hz of 0,1 Hz werd gebruikt om nieuwe microbubbels te laten reperfuseren in het behandelde gebied tussen ultrasone pulsen. - Injecteer 50 μL microbubbels (2 × 108 tot 5 × 108 microbubbels / ml) intraveneus en pas echografie toe tijdens beeldvorming, zoals beschreven in26.
- Data-analyse
- Analyseer, afhankelijk van de onderzoeksvraag, beelden met (open source) beeldverwerkingssoftware en een programmeeromgeving, zoals beschreven in26, om bloedvatparameters (diameter, vertakking, stroomsnelheid en richting), accumulatie van nanodeeltjes in de bloedvaten en kinetiek en penetratiediepte van extravasatie van dextran en nanodeeltjes in tumorweefsel te bepalen.
Representative Results
De microbubbels, geproduceerd zoals beschreven in het protocol, werden geanalyseerd met behulp van verschillende microscopiemethoden en op verschillende tijdschalen.
De fluorescentie van de nanodeeltjes in confocale microscopie (figuur 6A) geeft aan dat de schil een niet-uniforme deeltjesverdeling heeft. Andere microscopiemethoden kunnen worden gebruikt voor bubbelkarakterisering. Figuur 6B toont bijvoorbeeld de algemene structuur van de microbubbel met behulp van scanning elektronenmicroscopie, zoals gepresenteerd in eerder werk34.
Radiale dynamica en fenomenologisch bellengedrag kunnen worden bestudeerd met behulp van de beschreven in vitro bright-field microscopiemethode waarbij microbubbels werden afgebeeld met 10 miljoen frames per seconde. De straal van enkele microbubbels werd in de loop van de tijd geëxtraheerd met behulp van een intern geschreven script. Een voorbeeld van een dergelijke radiale respons is weergegeven in figuur 7.
Een beeldreeks van typische succesvolle toediening van nanodeeltjes, zoals beschreven in punt 2.3.6, is weergegeven in figuur 8A. De nanodeeltjes die in de microbubbelschaal zijn ingebed, kunnen worden gezien om op te lichten als gevolg van fluorescentie wanneer het laserlicht de bel bereikt. Aangedreven door ultrasone insonatie komen de fluorescerende nanodeeltjes los van de gaskern van de microbubbels en worden ze afgezet op het membraan van de monsterhouder. Ten slotte wordt de laser uitgeschakeld en worden de fluorescerende nanodeeltjes niet meer opgewonden. Mislukte levering van de fluorescerend gelabelde lading van de microbubbels ziet er meestal uit als de beeldsequentie in figuur 8B, waar de fluorescerende nanodeeltjes oplichten op de schaal van de microbubbel die intact blijft tijdens ultrasone blootstelling.
Real-time intravitale multifotonenmicroscopie tijdens echografie werd gebruikt om de effecten van echografie en microbubbels op het gedrag van nanodeeltjes in het bloed, verbetering van de permeabiliteit van tumorbloedvaten en verbetering van de afgifte van nanodeeltjes te onderzoeken. De mate en kinetiek van penetratie in de extracellulaire matrix als functie van akoestische druk, frequentie en pulslengtes kan worden gekarakteriseerd. Het effect van de ultrasone behandeling kan variëren met betrekking tot de grootte en morfologie van de bloedvaten en de daaruit voortvloeiende opsluiting van de bel. Hoe de ultrasone behandeling de bloedstroom en -richting beïnvloedt, kan worden bepaald. Een voorbeeldexperiment dat de extravasatie van nanodeeltjes in de loop van de tijd laat zien, is weergegeven in figuur 9 met een mechanische index (MI) van 0,826. Resultaten van intravitale multifotonenmicroscopie verduidelijken de ruimtelijke en temporele extravasatie van nanodeeltjes tijdens ultrasone blootstelling, wat zeer gunstig is voor het volledige begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan echogeleide toediening van nanodeeltjes en om dergelijke technologieën te optimaliseren26.
Figuur 1: Schematische weergave van een microbubbel met een schil van fluorescerend gelabelde polymere nanodeeltjes in gedenatureerde caseïne. De microbubbels zijn meestal tussen 1 μm en 10 μm in diameter. De nanodeeltjes hebben een diameter meestal tussen 100 nm en 200 nm38. Afkorting: C3F8 = perfluorpropaangas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch overzicht met de relevante tijd- en lengteschalen voor bright-field, fluorescentie, confocale en intravitale microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische weergave van experimenten met bright-field microscopie. (A) Experimentele opstelling, (B) het timingdiagram en (C) een typisch opgenomen frame. Schaalbalk in (C) = 10 μm. Afkorting: fps = frames per seconde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische weergave van fluorescentiemicroscopie-experimenten. (A) Experimentele opstelling, (B) het timingdiagram en (C) een typisch opgenomen frame. Schaalbalk in (C) = 10 μm. Afkorting: fps = frames per seconde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schematische weergave van intravitale microscopie-experimenten. (A) Experimentele opstelling, (B) het timingdiagram en (C) een typisch opgenomen frame. Schaalbalk in (C) = 50 μm. Groen komt overeen met dextran-FITC en rood met nanodeeltjes. Afkorting: GaAsP = galliumarsenide fosfide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: 3D-structuur van een enkele nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbel. (A) Confocale microscopie gebruiken om de nanodeeltjes te tonen en (B) een scanning-elektronenmicroscoop gebruiken om de 3D-structuur te tonen. (B) is gereproduceerd met toestemming van34. Schaalbalk in (A) = 5 μm; schaalbalk in (B) = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Typische bolvormige oscillaties van een nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbel met een straal van 2,89 μm met een ultrasone frequentie van 1 MHz en een akoestische drukamplitude van 142 kPa. (A-D) Beelden van de opname met hoge snelheid en de bijbehorende belstraal over de tijdcurve (onder). Schaalbalken = 5 μm en de rode lijn geeft de beginradius aan. Het verlichtingsprofiel (willekeurige eenheden) wordt geel aangegeven. De vergroting is 120x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Beeldsequentie van snelle fluorescentiemicroscopie. (A) Succesvolle levering van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes van een nanodeeltje-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbel geïnsoneerd bij een ultrasone frequentie van 2 MHz en een akoestische drukamplitude van 600 kPa. (B) Mislukte levering van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes van een nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbel geïnsoneerd bij een ultrasone frequentie van 2 MHz en een akoestische drukamplitude van 210 kPa. Schaalbalken = 10 μm. De vergroting is 120x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Intravitale microscopie na insonatie van nanodeeltjes- en eiwitgestabiliseerde microbubbels bij een ultrasone frequentie van 1 MHz en een akoestische drukamplitude van 800 kPa. (A) Nanodeeltjes in het vat, en (B) een beeldsequentie van het gebied aangegeven door het witte streepjesvierkant in (A) met de extravasatie van dextran (groen) en nanodeeltjes (rood). Schaalbalken = 50 μm. De vergroting is 20x. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Verschillende optische microscopiemethoden werden gecombineerd om informatie te verkrijgen over de verschillende stappen in de afgifte van nanodeeltjes van het oppervlak van microbubbels naar het omringende medium. Beeldvorming van de bellenoscillaties werd uitgevoerd, evenals beeldvorming van de afgifte van de nanodeeltjes uit de bellenschil, de extravasatie en de penetratie door de extracellulaire matrix van tumoren in vivo. In vitro beeldvorming maakt screening van veel ultrasone parameters mogelijk in vergelijking met de meer complexe in vivo opstellingen. Het voordeel van het combineren van deze reeks beeldvormingsmodaliteiten is de aanvullende informatie die op verschillende tijdschalen kan worden verkregen - een functie die cruciaal is om de microbubbels te karakteriseren en te optimaliseren voor een succesvolle bevalling en om therapeutische werkzaamheid te verkrijgen. Deze aanpak is nuttig om de afgiftemechanismen voor alle microbubbels te begrijpen, inclusief constructies met fluorescerend gelabelde nanodeeltjes en medicijnen.
De meest kritieke stappen in de microscopiemethoden die worden gebruikt om enkele microbubbels te bestuderen, zijn als volgt. Voor fluorescentiemicroscopie moeten de nanodeeltjes fluorescerend worden gelabeld om visualisatie van de deeltjesafgifte mogelijk te maken. Bovendien moet de monsteroplossing voldoende worden verdund om afzonderlijke microbubbels te isoleren voor analyse in confocale, helderveld- en fluorescentiemicroscopiemethoden. Daarnaast is het belangrijk om een ultrasone rijfrequentie en akoestische druk te kiezen om de bellen het meest efficiënt te prikkelen, namelijk bij hun resonantie. Als de onderzoeksvraag betrekking heeft op de levering van de nanodeeltjeslading, moeten de juiste ultrasone parameters deel uitmaken van het onderzoek. Naast resonantie moeten deze bellen ook op of boven hun drempel voor het vrijkomen van nanodeeltjes worden aangedreven, meestal bij relatief hoge akoestische drukamplitudes (MI > 0,3)51. Voor bright-field microscopiebeelden is het van cruciaal belang om een hogesnelheidscamera te kiezen met een voldoende hoge framerate om bewegingsonscherpte te minimaliseren en aliasing te voorkomen.
Bright-field microscopie wordt voornamelijk beperkt door de beeldframerate en intensiteit van beschikbare lichtbronnen, omdat een hogere framerate een gedetailleerder tijdsgeoploeteerd inzicht in de beldynamiek zou geven, maar een intensere verlichting vereist vanwege kortere belichtingstijden. Om de afgifte van deeltjes in meer detail te bestuderen, kan de framerate voor fluorescentiebeeldvorming in principe worden verhoogd door de intensiteit van het laserlicht te verhogen. Absorptie van het laserlicht met hoge intensiteit door de fluorescerend gelabelde microbubbels genereert echter warmte, zelfs met kleurstoffen met een hoge kwantumopbrengst. Deze hitte kan de experimenten die op het spel staan verstoren en in extreme gevallen fotothermische cavitatie veroorzaken52. In de praktijk is er dus een limiet aan de toegepaste laserfluence. Intense laserverlichting kan echter ook opzettelijk worden gebruikt om deeltjesafgifte van liposomen te induceren53. Temperatuur beïnvloedt de bubbeldynamiek en ultrasone respons, afhankelijk van het type bubbel54. Als in vitro en intravitale methoden objectief moeten worden vergeleken, moeten de in het protocol besproken in vitro methoden daarom bij 37 °C worden uitgevoerd. Een andere beperking van de in vitro methoden die in het huidige artikel worden besproken, is dat de bellen zich niet in een vrije veldomgeving bevinden, omdat microbubbels onder het membraan van de monsterhouder zullen zweven. Bovendien is er een selectiebias bij het afbeelden van enkele microbubbels. Het uitvoeren van herhaalde experimenten op enkele bellen maakt het echter mogelijk om het effect van grootte en verwijdering van de verstorende factor - de grootteverdeling - te onderzoeken. Als de belrespons als functie van grootte kan worden begrepen terwijl de concentratie niet te hoog is om bubbel-bubbelinteracties te voorkomen, kan de respons van een willekeurige bubbelpopulatie worden berekend. Ten slotte geven zowel bright-field- als fluorescentiemicroscopiemethoden inzicht in microbubbels die ingewikkeld zijn in een tweedimensionaal (2D) beeld. Als de onderzoeksvraag meer dan 2D-beeldvorming vereist, kan het 3D-gedrag van de bellen worden opgelost door de in het protocol beschreven opstelling te combineren met een zijaanzichtopstelling voor multiplane imaging55.
Een alternatieve methode om microbubbels te bestuderen is akoestische karakterisering56. Het meten van de echo van een enkele microbubbel vereist echter het lokaliseren en isoleren van een enkele microbubbel in de ultrasone straal56, wat een uitdaging vormt die meestal wordt aangepakt door het gebruik van een smalle buis of een optisch of akoestisch pincet57,58. Om bubbels akoestisch te dimensioneren, kunnen de microbubbels worden geïnsoneerd in het geometrische verstrooiingsregime op frequenties die veel hoger zijn dan hun resonantiefrequentie, wat geen volumetrische microbubbeloscillaties induceert59. Het gebruik van een "akoestische camera" is zo'n methode om de radiale dynamiek van enkele microbubbels in beeld te brengen als reactie op echografie, waarbij een hoogfrequente ultrasone sonde wordt gebruikt om de radiale respons van de bel op een laagfrequente aandrijfgolf te bepalen60. Het nadeel van deze methode is dat deze alleen kan worden gebruikt om de relatieve verandering van de microbubbelradius te bepalen; daarom is een andere methode nodig om de absolute belstraal te bepalen, bijvoorbeeld door middel van optische beeldvorming61,62. Het nadeel van methoden waarbij microbubbels worden blootgesteld aan echografie bij frequenties hoger dan hun resonantiefrequentie is dat bij dergelijke hoge frequenties de penetratiediepte wordt verminderd59, waardoor de bruikbaarheid voor in vivo toepassingen wordt beperkt. Andere vormen van microscopie kunnen ook worden gebruikt om microbubbels te bestuderen, zoals scanning elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie63. De haalbare spatio-temporele resolutie van deze alternatieve microscopietechnieken is echter over het algemeen beperkter en deze technieken hebben het nadeel dat beeldvorming vóór of na ultrasone blootstelling wordt uitgevoerd door middel van offline analyse en meestal een lage doorvoer vertoont63. Een ander alternatief is om een lichtverstrooiingsmethode te gebruiken, die kan worden gebruikt om de radiale dynamica van enkele microbubbels in realtime te bestuderen, maar een lage signaal-ruisverhouding heeft in vergelijking met akoestische verstrooiingsmethoden64.
Real-time intravitale microscopie tijdens ultrasone blootstelling is een krachtige methode om nieuw inzicht te krijgen in de vasculatuur, het gedrag van microbubbels, nanodeeltjes of andere moleculen (zoals dextran in dit geval) tijdens ultrasone blootstelling. Een algemene beperking bij het uitvoeren van real-time intravitale microscopie is dat slechts een klein deel van het weefsel in beeld wordt gebracht en de penetratiediepte van het licht in het weefsel beperkt is. Als de afgebeelde vaten zeer weinig microbubbels en/of nanodeeltjes binnen het gezichtsveld bevatten, kan weinig of geen informatie over het gedrag en de extravasatie van de nanodeeltjes worden verkregen. Daarnaast is vanwege het beperkte gezichtsveld een goede uitlijning tussen de licht- en echografiepaden cruciaal. Als de ultrasone druk hoog genoeg is om bellenvernietiging te induceren, is het ook belangrijk om een pulsherhalingsfrequentie te kiezen waarmee verse bellen tussen ultrasone pulsen in het gezichtsveld kunnen komen. Bovendien, omdat de echografie wordt gereflecteerd door het afdekglas in de raamkamer en het objectief, is het belangrijk om de transducer onder een hoek te plaatsen om reflecties te verminderen om de vorming van staande golven te voorkomen, die het gekalibreerde drukveld vervormen. Een ander praktisch probleem is dat de opstelling voldoende ruimte moet hebben om de ultrasone transducer en golfgeleider boven of onder het objectief in de microscoopopstelling te monteren. De tumoren in de dorsale vensterkamer hebben een beperkte dikte vanwege de beperkende kamer en de afdekplaat; indien nodig kunnen echter andere modellen worden gebruikt. Voorbeelden zijn huidplooitumoren, bijvoorbeeld in het borstvetkussen65 of abdominale intravitale beeldvorming van tumoren in de verschillende organen66. Dergelijke tumoren kunnen orthotopisch worden gekweekt in de juiste micro-omgeving en als zodanig een meer klinisch relevant geval presenteren.
De methoden die in dit werk worden beschreven, verlichten het potentieel van fluorescerend gelabelde microbubbels om de fundamenten van medicijnafgiftetoepassingen te bestuderen met behulp van bubbels en echografie. Deze combinatie van microscopiemethoden biedt waardevol inzicht in de microbubbelrespons op ultrasone insonatie en de bijbehorende akoestische parameterruimte en geeft een duidelijk beeld van het microbubbel- en payloadgedrag over een relevant bereik van tijd- en lengteschalen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 | Tabor Electronics | Arbitrary waveform generator (programmable) | |
| 2100 L | ENI | Amplifier, used in window chamber setup | |
| 2 MDa dextran | Sigma-Aldrich | ||
| 33522 A | Agilent Technologies | Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup | |
| A1R | Nikon Instruments | Confocal microscope | |
| ACE I | SCHOTT | Dimmable AC halogen light source | |
| Atipemazol | Orion Pharma | Antidote to wake animal | |
| Baytril | Bayer | Enrofloxacin | |
| BD Neoflon 24 G | Becton Dickinson & Company | Tail vein catheter | |
| BNC model 575 | Berkely Nucleonics Corporation | Pulse/delay generator | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Branson | Ultrasonic bath | |
| Channel slide | Ibidi | ||
| CLINIcell 25 | Laboratoires Mabio International | Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm) | |
| Cohlibri | Lightline | Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm) | |
| DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | Oscilloscope | |
| Fentanyl | Actavis Group HF | Anaesthesia of mouse | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | Supplement for cell culture medium | |
| Fiber-optic hydrophone | Precision Acoustics | Used for alignment | |
| Flumanezil | Fresenius Kabi | Antidote to wake animal | |
| Heated animal holder | Custom design | A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber | |
| Hyper Vision HPV-X2 | Shimadzu | High-speed camera | |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin | open source image processing program | |
| In vivo SliceScope | Scientifica | Multiphoton microscope | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| ISOTON | Beckman Coulter | Filtered, phosphate-buffered saline solution | |
| LUMPLFLN60XW | Olympus | Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm) | |
| MaiTai DeepSee | Spectra-Physics | Pulsed laser | |
| MATLAB | Mathworks | Programming environment | |
| Medetomidine | Orion Pharma | Anesthesia of mouse | |
| Midazolam | Accord Healthcare Limited | Anesthesia of mouse | |
| Milli-Q | Merck | Ultrapure water | |
| MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe | PerkinElmer | Strobe light | |
| Panametrics-NDT C305 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1") | |
| Panametrics-NDT V304 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25") | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
| Perfluoropropane gas | F2 Chemicals | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 | Gibco Thermo-Fisher | Cell culture medium | |
| Safe-Lock tube | Eppendorf | ||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
| T 25 basic ULTRA-TURRAX | IKA laboratory technology | Dispersion tool | |
| TDS 210 | Tektronix | Oscilloscope, used in window chamber setup | |
| Transducer | Precision Acoustics Ltd | Used in window chamber setup | |
| U-TLU | Olympus | Tube lens | |
| VBA100-200 | Vectawave | Amplifier | |
| Window chambers | Custom made | Used in window chamber setup | |
| XLUMPLFLN20 XW | Olympus | 20x water dipping objective | |
| XY(Z) translation stages | Thorlabs |
References
- Szabo, T. L. Diagnostic ultrasound imaging: inside out. , Academic Press. (2004).
- Paefgen, V., Doleschel, D., Kiessling, F. Evolution of contrast agents for ultrasound imaging and ultrasound-mediated drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 197 (2015).
- Versluis, M., Stride, E., Lajoinie, G., Dollet, B., Segers, T. Ultrasound contrast agents modeling. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (9), 2117-2144 (2020).
- Coelho-Filho, O. R., Rickers, C., Kwong, R. Y., Jerosch-Herold, M. MR myocardial perfusion imaging. Radiology. 266 (3), 701-715 (2013).
- Pandharipande, P. V., Krinsky, G. A., Rusinek, H., Lee, V. S. Perfusion imaging of the liver: current challenges and future goals. Radiology. 234 (3), 661-673 (2005).
- Weidner, N., Carroll, P. R., Flax, J., Blumenfeld, W., Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. The American Journal of Pathology. 143 (2), 401-409 (1993).
- Quaia, E. Classification and safety of microbubble-based contrast agents. Contrast Media in Ultrasonography. Medical Radiology (Diagnostic Imaging). Quaia, E. , Springer. Berlin, Heidelberg. 3-14 (2005).
- Unger, E. C., Porter, T., Culp, W., Labell, R., Matsunaga, T., Zutshi, R. Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (9), 1291-1314 (2004).
- Blomley, M. J. K., Cooke, J. C., Unger, E. C., Monaghan, M. J., Cosgrove, D. O. Microbubble contrast agents: a new era in ultrasound. BMJ. 322 (7296), 1222-1225 (2001).
- Faez, T., et al. 20 years of ultrasound contrast agent modeling. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency control. 60 (1), 7-20 (2012).
- De Jong, N., Emmer, M., Van Wamel, A., Versluis, M. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Medical & Biological Engineering & Computing. 47 (8), 861-873 (2009).
- De Jong, N. Acoustic properties of ultrasound contrast agents. , (1993).
- Schneider, M. Characteristics of sonovueTM. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Averkiou, M. A., Powers, J., Skyba, D., Bruce, M., Jensen, S. Ultrasound contrast imaging research. Ultrasound Quarterly. 19 (1), 27-37 (2003).
- Snipstad, S., et al. Contact-mediated intracellular delivery of hydrophobic drugs from polymeric nanoparticles. Cancer Nanotechnology. 5 (1), 8 (2014).
- Epstein, P. S., Plesset, M. S. On the stability of gas bubbles in liquid-gas solutions. The Journal of Chemical Physics. 18 (11), 1505-1509 (1950).
- Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
- Deshpande, N., Needles, A., Willmann, J. K. Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Clinical Radiology. 65 (7), 567-581 (2010).
- Miller, M. W., Miller, D. L., Brayman, A. A. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Medicine & Biology. 22 (9), 1131-1154 (1996).
- Snipstad, S., et al. Sonopermeation to improve drug delivery to tumors: from fundamental understanding to clinical translation. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (12), 1249-1261 (2018).
- Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
- May, J. -N., et al. Multimodal and multiscale optical imaging of nanomedicine delivery across the blood-brain barrier upon sonopermeation. Theranostics. 10 (4), 1948-1959 (2020).
- Carmen, J. C., et al. Ultrasonic-enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Journal of Infection and Chemotherapy. 10 (4), 193-199 (2004).
- Runyan, C. M., et al. Low-frequency ultrasound increases outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa. The Journal of General and Applied Microbiology. 52 (5), 295-301 (2006).
- Yemane, P. T., et al. Effect of ultrasound on the vasculature and extravasation of nanoscale particles imaged in real time. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (11), 3028-3041 (2019).
- van Wamel, A., et al. Acoustic Cluster Therapy (ACT) enhances the therapeutic efficacy of paclitaxel and Abraxane® for treatment of human prostate adenocarcinoma in mice. Journal of Controlled Release. 236, 15-21 (2016).
- Snipstad, S., et al. Ultrasound improves the delivery and therapeutic effect of nanoparticle-stabilized microbubbles in breast cancer xenografts. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
- Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Aslund, A. K. O., et al. Nanoparticle delivery to the brain-By focused ultrasound and self-assembled nanoparticle-stabilized microbubbles. Journal of Controlled Release. 220, 287-294 (2015).
- Downs, M. E., Buch, A., Karakatsani, M., Konofagou, E. E., Ferrera, V. P. Blood-brain barrier opening in behaving non-human primates via focused ultrasound with systemically administered microbubbles. Scientific Reports. 5, 15076 (2015).
- Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
- Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103 (2019).
- Lentacker, I., et al. Lipoplex-loaded microbubbles for gene delivery: a Trojan Horse controlled by ultrasound. Advanced Functional Materials. 17 (12), 1910-1916 (2007).
- De Temmerman, M., et al. mRNA-Lipoplex loaded microbubble contrast agents for ultrasound-assisted transfection of dendritic cells. Biomaterials. 32 (34), 9128-9135 (2011).
- Burke, C. W., Alexander, E., Timbie, K., Kilbanov, A. L., Price, R. J. Ultrasound-activated agents comprised of 5FU-bearing nanoparticles bonded to microbubbles inhibit solid tumor growth and improve survival. Molecular Therapy. 22 (2), 321-328 (2014).
- Mørch, Ý, et al. Nanoparticle-stabilized microbubbles for multimodal imaging and drug delivery. Contrast Media & Molecular Imaging. 10 (5), 356-366 (2015).
- Jamburidze, A., et al. Nanoparticle-coated microbubbles for combined ultrasound imaging and drug delivery. Langmuir. 35 (31), 10087-10096 (2019).
- Snipstad, S., et al. Sonopermeation enhances uptake and therapeutic effect of free and encapsulated cabazitaxel. Ultrasound in Medicine and Biology. , (2021).
- De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
- Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
- Klymchenko, A. S., et al. Highly lipophilic fluorescent dyes in nano-emulsions: towards bright non-leaking nano-droplets. RSC Advances. 2 (31), 11876 (2012).
- Aslund, A. K. O., et al. Quantification and qualitative effects of different PEGylations on Poly (butyl cyanoacrylate) Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 14 (8), 2560-2569 (2017).
- Born, M., Wolf, E. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge; New York. (1999).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Hak, S., Reitan, N. K., Haraldseth, O., de Lange Davies, C. Intravital microscopy in window chambers: a unique tool to study tumor angiogenesis and delivery of nanoparticles. Angiogenesis. 13 (2), 113-130 (2010).
- Fusser, M., et al. Cabazitaxel-loaded Poly (2-ethylbutyl cyanoacrylate) nanoparticles improve treatment efficacy in a patient derived breast cancer xenograft. Journal of Controlled Release. 293, 183-192 (2019).
- Abou-Saleh, R. H., et al. Molecular effects of glycerol on lipid monolayers at the gas-liquid interface: impact on microbubble physical and mechanical properties. Langmuir. 35 (31), 10097-10105 (2019).
- Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e55115 (2018).
- Luan, Y., et al. Lipid shedding from single oscillating microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (8), 1834-1846 (2014).
- Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 1-8 (2014).
- Mathiyazhakan, M., et al. Non-invasive controlled release from gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes through pulse laser induced microbubble cavitation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 126, 569-574 (2015).
- Vos, H. J., Emmer, M., de Jong, N. Oscillation of single microbubbles at room versus body temperature. 2008 IEEE Ultrasonics Symposium. , 982-984 (2008).
- Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall-a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
- Sijl, J., et al. Acoustic characterization of single ultrasound contrast agent microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (6), 4091-4097 (2008).
- Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90 (11), 114103 (2007).
- Baresch, D., Garbin, V. Acoustic trapping of microbubbles in complex environments and controlled payload release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15490-15496 (2020).
- Maresca, D., et al. Acoustic sizing of an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (10), 1713-1721 (2010).
- Renaud, G., Bosch, J. G., vander Steen, A. F. W., de Jong, N. An "acoustical camera" for in vitro characterization of contrast agent microbubble vibrations. Applied Physics Letters. 100 (10), 101911 (2012).
- Renaud, G., Bosch, J. G., Van Der Steen, A. F. W., De Jong, N. Low-amplitude non-linear volume vibrations of single microbubbles measured with an "acoustical camera.". Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (6), 1282-1295 (2014).
- Luan, Y., et al. Combined optical sizing and acoustical characterization of single freely-floating microbubbles. Applied Physics Letters. 109 (23), (2016).
- Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: Fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10 (1), 011501 (2016).
- Guan, J., Matula, T. J. Using light scattering to measure the response of individual ultrasound contrast microbubbles subjected to pulsed ultrasound in vitro. The Journal of the Acoustical Society of America. 116 (5), 2832-2842 (2004).
- Sofias, A. M., Åslund, A. K. O., Hagen, N., Grendstad, K., Hak, S. Simple and robust intravital microscopy procedures in hybrid TIE2GFP-BALB/c transgenic mice. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 486-493 (2020).
- Ritsma, L., Steller, E. J. A., Ellenbroek, S. I. J., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. M., van Rheenen, J. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
