Summary
所提出的方案可用于表征为超声触发的药物递送应用而设计的荧光标记微气泡的反应，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 用于 捕获相关长度和时间尺度的 体外和体内 显微镜技术。
Abstract
微气泡造影剂在超声药物输送应用中具有很大的前景。将药物封装在纳米颗粒中可降低全身毒性并增加药物的循环时间。在微气泡辅助药物递送的新方法中，纳米颗粒被掺入微气泡壳中或微气泡壳上，从而能够通过超声波局部和触发释放纳米颗粒有效载荷。全面了解广阔超声参数空间内的释放机制对于高效和受控释放至关重要。这组提出的方案适用于具有含有荧光标记的外壳的微气泡。在这里，重点是装载聚（2-乙基丁基氰基丙烯酸酯）聚合物纳米颗粒的微气泡，掺杂了改性的尼罗河红染料。颗粒固定在变性的酪蛋白壳内。微气泡通过剧烈搅拌产生，在含有酪蛋白和纳米颗粒的液相中形成全氟丙烷气体的分散体，之后微气泡壳自组装。需要各种显微镜技术来表征纳米颗粒稳定微气泡在纳米颗粒释放过程的所有相关时间尺度上。纳米颗粒的荧光可以对单个微气泡进行共聚焦成像，揭示壳内的颗粒分布。使用明场显微镜以每秒1000万帧的速度进行 体外 超高速成像，可以深入了解响应超声共振的气泡动力学。最后，从气泡壳中释放的纳米颗粒最好通过荧光显微镜进行可视化，以每秒500，000帧的速度进行。为了表征 体内药物递送，在植入背侧皮褶窗室的肿瘤中使用活体显微镜研究脉管系统内纳米颗粒的触发释放及其在内皮层之外的外渗，时间范围为几分钟。这些互补表征技术的结合为微气泡的行为及其有效载荷在 体外 和 体内的时间和长度尺度上的释放提供了独特的见解。
Introduction
超声是最广泛使用的医学成像技术。它具有非侵入性、快速、安全、经济高效且便于携带1，2，3。然而，血液是一种较差的超声散射器，静脉注射超声造影剂可以增强血池的对比度3。这种增强的血池对比能够定量器官灌注用于诊断目的， 例如，检测冠状动脉疾病4 和转移性肝病5。事实上，肿瘤脉管系统被证明是一个重要的预后因素6。现在，一项主要的研究工作是针对微气泡辅助的靶向分子成像和定制用于治疗用途的造影剂。
市售的超声造影剂通常由直径范围为1μm至10μm9的涂层微气泡悬浮液7，8组成。由于超声造影剂微气泡略小于红细胞7，因此微气泡甚至可以安全地到达最小的毛细血管，而不会产生闭塞3。与 tissue10 相比，微气泡的超声反向散射系数显著增加，因为它们具有可压缩的气体核心11。此外，微气泡回波是高度非线性的，即其频谱包含驱动频率的谐波和次谐波。此外，回波强度很大程度上取决于气泡的共振响应12。虽然组织仅线性散射，但少量微气泡足以在谐波成像中实现高检测灵敏度13，14。这种非线性对比度生成甚至可以强大到足以跟踪体内的单个气泡15。
超声造影剂的外壳可稳定气泡，防止溶解和凝聚，从而增加它们在血液池中的循环时间16。外壳可以由脂质，聚合物或变性蛋白质组成3，8。它降低了界面张力，从而限制了拉普拉斯压力驱动溶解的影响17 ，并产生了防止气体扩散的电阻屏障18。为了进一步提高稳定性，造影剂微泡通常填充在血液中溶解度低的高分子量气体11。微气泡壳极大地改变了微气泡对超声共振的反应11。未涂覆的气泡具有与其大小成反比的特征共振频率，并且由于壳的固有刚度，添加脂质涂层会增加相对于未涂层气泡的共振频率3。此外，壳体通过膨胀粘度消散能量，膨胀粘度是涂层气泡阻尼的主要来源3。稳定壳具有额外的优点，即它可以功能化， 例如， 通过将靶向配体结合到微气泡表面。这种靶向使这些气泡的许多应用成为可能，特别是超声波分子成像14，19。
微气泡造影剂在超声药物输送应用中具有很大的前景。在血管范围内振荡的微气泡可导致毛细血管壁上的微流以及局部法向和剪切应力3。在高声压下，大振幅振荡可能导致微气泡塌陷，这称为惯性空化，进而可能导致血管破裂或内陷20。这些暴力现象可以诱导生物效应，例如超声手术21，增强治疗药物通过内皮壁（细胞旁或跨细胞）渗入间质。它还可以改善治疗剂通过富含基质的肿瘤的细胞外基质21，22 和生物膜23，24的渗透，尽管这种机制仍然知之甚少26。
超声介导的药物递送在临床前27，28 和临床试验中都显示出有希望的结果22。此外，当与相对低频超声（~1 MHz）一起使用时，据报道微气泡局部和短暂地增加了血脑屏障通透性，从而使药物能够在临床前和临床研究中进入脑实质29，30，31，32，33，34。
超声介导的药物递送通常有两种方法：治疗材料可以与气泡共同施用，或者可以附着在气泡壳中或装入气泡壳28，35，36。第二种方法已被证明在药物输送方面更有效37。微气泡可以装载药物或遗传物质，这些药物或遗传物质封装在附着在壳上的纳米颗粒（脂质体或聚合物纳米结构）中或直接掺入微气泡壳中35，36。纳米颗粒负载的微气泡可以通过（聚焦）超声波激活，以局部释放纳米颗粒有效载荷28，33，38，39，40。如果这种微气泡与细胞直接接触，则 在体外 已经表明，有效载荷甚至可以在称为声压印的过程中沉积到细胞细胞质膜上34，35。
微气泡谐振的超声参数空间广阔， 体内 生物条件进一步增加复杂性。因此，聚焦超声和纳米颗粒负载微气泡的组合在靶向治疗领域提出了挑战。
这项工作的目的是提供可用于详细成像微气泡响应作为超声参数函数的方案，并研究导致壳破裂和随后释放荧光标记的壳材料的机制。这组协议适用于含有荧光染料的外壳的微气泡。图1显示了SINTEF（挪威特隆赫姆）开发的聚合物纳米颗粒和蛋白质稳定微气泡的示意图。这些气泡充满全氟丙烷气体（C3F8），稳定外壳的纳米颗粒含有NR668，它是Nile Red荧光染料的亲脂衍生物38，43。纳米颗粒由聚（2-乙基丁基氰基丙烯酸酯）（PEBCA）组成，并被PEGylation.聚乙二醇（PEG）的功能化减少了单核吞噬细胞系统的调性和吞噬作用，从而延长了循环时间14，44。结果，PEGylation增加了到达目标位点的纳米颗粒的量，从而提高了处理的功效16。图2说明了使用四种显微镜方法如何使研究人员能够覆盖所有相关的时间和长度尺度。应该注意的是，光学显微镜中可实现的空间分辨率由衍射极限决定，衍射极限取决于光的波长和物镜的数值孔径（NA）以及物体照明源的数值孔径（NA）45。对于手头的系统，光学分辨率限制通常为200 nm。此外，活体显微镜检查可用于在亚细胞水平上成像46。对于这项工作中使用的纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡，与活体显微镜相关的最小长度尺度是小毛细血管的大小（≥10μm）。描述了单个微气泡的体外高速光学成像（每秒1000万帧）和高速荧光成像（每秒500，000帧）实验。纳秒时间尺度的高速明场成像适用于研究振动气泡的时间分辨径向动力学。相比之下，高速荧光显微镜允许直接可视化荧光标记纳米颗粒的释放。此外，可以使用Z-stack三维（3D）共聚焦显微镜和扫描电子显微镜（后者的协议不包括在当前工作中）来研究微气泡壳的结构。活体显微镜包括使用多光子显微镜对在背窗室中生长的肿瘤进行成像，以提供有关局部血流和荧光标记纳米颗粒在体内命运的实时信息47。这些显微镜方法的结合最终提供了对治疗微泡剂响应超声的行为的详细见解，无论是在体外还是在体内。
Protocol
注：所有实验程序均已获得挪威动物研究机构的批准。协议中使用的材料的详细信息可以在 材料表中找到。
1. 微气泡的生产
注意：在这项工作中，感兴趣的微气泡是蛋白质和纳米颗粒稳定的微气泡，其生产方案之前已经描述过28，33，48。因此，此处简要总结了制造协议。
- 首先，使用移液管，将超纯水与0.5重量%的酪蛋白在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和1重量%的纳米颗粒中混合，标记有0.21重量%的荧光染料NR668（改性尼罗河红），在无菌玻璃压接顶部小瓶（10毫升，直径2厘米）中。聚合物纳米颗粒是使用Mørch等人描述的微型乳液聚合方法制备的。38.
注意：在这里，染料作为模型药物的功能，使纳米颗粒释放的可视化成为可能。使用纳米颗粒溶液时，请穿上实验室外套，护目镜和手套。立即用100%丙酮擦去纳米颗粒溶液的任何溢出物。 - 用橡胶盖住小瓶，稍微混合，然后将小瓶在室温下置于超声波浴中10分钟，以消除可能的聚集物。将分散工具与搅拌器的尖端放在距离玻璃小瓶底部约0.5厘米处。使用连接到气体容器的玻璃移液器，将全氟丙烷气体添加到含有溶液的小瓶的顶部空间，直到溶液开始轻微冒泡。
注意：将自密封膜包裹在分散工具的底部，以防止在搅拌过程中玻璃小瓶打滑。 - 使用分散工具在1935× g （24，000 rpm，旋转半径为3 mm）下剧烈搅拌溶液4分钟。用橡胶盖关闭小瓶，并密封小瓶以备将来使用。
注意：搅拌将气体滞留在液体中。微气泡壳随后自行组装，无需任何主动步骤。 - 将多余的酪蛋白和纳米颗粒溶液储存在4°C，并用100%丙酮清洁分散工具。
2. 成像单个气泡
- 共聚焦显微镜
- 样品制备
- 稀释气泡溶液以成像单个微气泡，如下所示。将排气针（19 G-21 G）放入装有微气泡的玻璃压接顶部小瓶中，按照第1节中描述的步骤产生微气泡。将小瓶倒置，让大气泡远离小瓶的密封。
- 将另一个小（约1 mL）注射器的针尖（19 G）插入小瓶中，而小瓶仍然倒置。除去少量气泡悬浮液，并将注射器的内容物转移到小管中，以便在下一步中更容易移液。
注意：直接提取的悬浮液的体积取决于气泡悬浮液的类型和浓度。在这种情况下，提取0.2毫升。 - 使用移液器，在过滤的PBS中稀释微气泡悬浮液（从第1部分开始），以达到约2×105 至6×105 微气泡/ mL的浓度，以实现单气泡成像。
注意：根据气泡类型，建议洗涤气泡悬浮液以除去游离荧光染料。这对于将荧光染料注入壳中的气泡尤其重要。为了洗涤气泡，稀释气泡悬浮液（例如， 通过在10mL PBS中取100μL气泡溶液），并离心（通常以100× g的速度）。最后，用移液器除去含有微气泡的上清液以进行进一步分析。剩余的溶液含有游离荧光颗粒，可以丢弃。应根据需要重复洗涤步骤。 - 向混合物中添加甘油以增加培养基的粘度，并消除由布朗运动引起的运动，否则会干扰相当慢的共聚焦Z-stack成像。
注意：甘油的量取决于成像的气泡类型（此处为〜50%）。对于某些类型的气泡，甘油可能对稳定性产生不利影响49。然而，在共聚焦成像下，在大约30分钟内没有观察到气泡的明显变化。此外，甘油可能会改变微气泡的声学响应，因此只能与微气泡不不协调的成像方法一起使用。 - 将微气泡悬浮液置于壁薄的腔室中，以获得最佳成像效果，例如通道载玻片。
- 成像方案
- 打开共聚焦显微镜，选择合适的物镜以及所需的激光和扫描仪，以便在共聚焦显微镜下使用。
注意：此处，使用分辨率为 0.08 μm/像素的 60 倍水浸物镜，并根据气泡大小，对 256 x 256 像素或 128 x 128 像素的区域进行成像。在这些特定的实验中，使用488nm激光和Galvano扫描仪。发射波长取决于荧光染料，通常是宽带的。 - 在明场中查找微气泡，然后切换到共聚焦显微镜。设置所需的顶部和底部平面，共聚焦显微镜将在其间进行扫描。获取Z轴堆栈以观察3D结构;在 Z 方向上使用 100 nm 的步长。
- 打开共聚焦显微镜，选择合适的物镜以及所需的激光和扫描仪，以便在共聚焦显微镜下使用。
- 样品制备
- 明场显微镜
- 光学系统的组装
注：明场显微镜设置的示意图如图 3A所示。为确保超声波不受干扰地传播，水浴包含两个开口：一个用于光源，一个用于超声波换能器。光学系统由（模块化）显微镜、高速相机和匹配的光学元件组成。由于微气泡振荡周期通常为1 μs（使用1 MHz超声波），因此相机应设置为以至少每秒500万帧的帧速率进行录制。在这里，相机将设置为以每秒1000万帧（256 x 400像素）的速度记录256帧（25.6μs），以捕获气泡动力学的所有细节，包括更高的谐波。- 将具有适当放大倍率、工作距离和数值孔径的水浸物镜连接到显微镜上。
注：尽管水逐渐蒸发，但使用水浸物镜提供稳定的工作距离。这里，选择了放大倍率为60倍，工作距离为2 mm，NA为1的水浸物镜。 - 使用峰值功率输出至少为1 kW的频闪灯进行照明，并在显微镜和相机之间使用管透镜，以确保尽可能少的环境光到达高速相机的传感器。
- 使用可调光卤素光源聚焦于单个微气泡，并对准光学和声学系统，以进行实时成像。
- 将具有适当放大倍率、工作距离和数值孔径的水浸物镜连接到显微镜上。
- 声学系统的组装
- 使用可编程任意波形发生器和功率放大器（56 dB增益）以平滑的信封和波形驱动传感器。将示波器连接到任意波形发生器以检查信号。将个人计算机连接到任意波形发生器，使用内部编写的脚本对传入的声压波进行编程。
- 使用脉冲/延迟发生器作为主触发器来同步光学和声学系统。在脉冲/延迟发生器和相机软件上设置触发延迟，以便在超声波传输后16 μs开始记录，以允许超声波到达气泡。在记录开始前1.5 μs触发光源，以确保在气泡振荡期间获得适当的照明（时序图见 图3B ）。
- 选择具有适当中心频率的合适传感器。将其放置在水浴的开口中，使其相对于光轴呈一定角度，以最大限度地减少样品支架膜的反射并减少驻波的形成。
注：此处，中心频率为2.25 MHz、焦距为1"、元件直径为0.75"的单元件聚焦浸入式探头相对于光轴以35°的角度放置。传递函数的校准需要使用与声学系统中使用的放大器相同的放大器进行。使用光纤水听器校准从电压幅度到压力幅度的传递函数，作为超声波发射频率的函数。
- 选择样品架
- 使用具有光学和声学透明膜的样品架，其体积足够大，可以对同一样品中的多个微气泡进行成像。
注意：这里使用体积为10mL，膜面积为25 cm2，膜厚度为175μm的细胞培养盒。由于下部膜上的声学反射，以及显微镜物镜和上膜反射的波的干扰， 原位 声压可能与任意波形发生器上编程的声压不同。将探头放置在相对于样品支架膜的角度可减少驻波的形成，但会增加膜的反射。 - 确保样品可以完全浸没并带入探头和显微镜物镜的焦点内。使用连接到3D微定位台的铝支撑独立移动样品架。
- 使用具有光学和声学透明膜的样品架，其体积足够大，可以对同一样品中的多个微气泡进行成像。
- 光学和声学系统的对准
- 要使3D平移对齐设置，请将水浴连接到XY平移载物台，并将载物台连接到光学工作台，以确保其在实验过程中不会移动。然后，用水填充水浴，并打开可调光卤素光源。在对准过程中，将显微镜物镜移到一侧以防止超声波反射。
- 将针式水听器（0.2 mm）连接到样品架臂上，并将针式水听器置于水浴中，尖端在物镜的视野中。打开放大器和任意波形发生器;使用5至10个超声周期的单脉冲和15 Hz的脉冲重复频率。确保水听器尖端居中并聚焦在显微镜图像上。沿 XY 方向移动油箱，将针向 Z 方向移动，直到达到最大压力振幅。
- 调整显微镜的焦点，重新聚焦在水听器的尖端。
注：该协议可确保显微镜焦点和换能器焦点之间的对准。对准后不要改变显微镜和换能器的位置。
- 样品制备
- 重复步骤2.1.1.1至2.1.1.3以制备样品溶液。稀释气泡溶液以实现单气泡成像并排除相邻气泡的声学相互作用。
- 打开样品架的出口。使用注射器，将样品溶液注入样品架的另一个开口，直到完全充满。确保样品架内没有气泡，以防止与超声场发生不必要的相互作用。
- 关闭样品架的两个阀门，并将样品架垂直于光轴放置。
注意：保持填充的样品架水平，以防止在移动过程中气泡移动到样品架的一侧。
- 成像方案
- 通过上述内部书面脚本，在任意波形发生器中对所需的超声驱动频率和声压进行编程。
注意：在这里，声压波是40个周期的单次爆发，具有8个周期的高斯锥形脉冲。这些实验中使用的超声频率为1 MHz，2 MHz或3 MHz，声压幅度范围为81 kPa至1200 kPa。 - 使用XYZ载物台移动包含样品溶液的样品架，以定位显微镜焦点中的单个微气泡。从样品架一角的视场开始，并确保微气泡的边缘清晰可见且对焦（参见 图3C 以获得理想的相机视图）。
- 将先前连接到卤素灯的光纤的一端连接到频闪灯上，以便另一端仍连接到水浴。触发录制。
- 根据超声设置（频率和声压）重复步骤2.2.6.2至2.2.6.3，根据需要多次，将含有微气泡的细胞培养盒从先前位置移动至少2毫米（在焦平面中），以确保视场中的微气泡在先前的实验中不致敏。
注意：在这里，每个实验重复约20次。当整个样品架不均匀时，清空样品架，并用新鲜的样品溶液重新填充它以进行后续实验。
- 通过上述内部书面脚本，在任意波形发生器中对所需的超声驱动频率和声压进行编程。
- 数据分析
- 采用编程环境，根据研究问题进行数据分析，处理图像后进行边缘检测。使用测量图像区域属性的函数，找到气泡的质心和每个气泡周围强度分布的导数，以检测气泡的轮廓（从而检测气泡半径 R）。从单个微气泡随时间变化的半径中提取相关参数。
注：在本研究中，使用编程环境进行图像处理，以对单个微气泡的记录进行二值化和过滤。使用内部脚本来查找每个气泡周围强度分布的导数。
- 采用编程环境，根据研究问题进行数据分析，处理图像后进行边缘检测。使用测量图像区域属性的函数，找到气泡的质心和每个气泡周围强度分布的导数，以检测气泡的轮廓（从而检测气泡半径 R）。从单个微气泡随时间变化的半径中提取相关参数。
- 光学系统的组装
- 荧光显微镜
- 光学系统的组装
- 构建荧光显微镜的设置（图4A），使用与第2.2节所述的明场显微镜相同的碱基。
注：第2.3节中描述的设置可以与第2.2节中描述的明场显微镜设置结合使用。结合荧光显微镜和明场显微镜，可以在对纳米颗粒释放进行成像的同时可视化微气泡气体核心。 - 将高速相机设置为以每秒 500，000 帧（400 x 250 像素）的速度录制 128 帧 （256 μs）。
注意：成像时间比明场实验长，因为荧光中的光强度有限，并且因为粒子传递发生的时间尺度比气泡动力学的时间尺度长。 - 选择功率足够高以提供足够光并具有合适激发波长的激光器，并确保它与声光调制器耦合，以避免漂白样品。
注意：在这项研究中，使用激发波长为532nm的5 W连续波激光器来激发纳米颗粒的荧光。 - 在激光和显微镜物镜之间放置分束器，二向色镜和陷波滤光片，以将激发光引导到样品，同时允许荧光发射到达相机。
- 构建荧光显微镜的设置（图4A），使用与第2.2节所述的明场显微镜相同的碱基。
- 声学系统的组装
- 要使微气泡发出声学，请使用与第2.2.2节相同的声学设置。在这些特定实验中，将换能器更改为中心频率为2.25 MHz，焦距为1.88"，元件直径为1"的单元件聚焦浸入式换能器。将其放置在相对于光轴的35°角处，以最大限度地减少样品支架膜的反射并减少驻波的形成。
- 光学和声学系统的对准
- 重复第 2.2.4 节中描述的步骤。
- 样品制备
- 按照第 2.2.5 节中所述准备示例解决方案。
- 成像方案
- 通过上述内部书面脚本在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压幅度。
注意：在这里，声压波被编程为140个周期的单次超声波爆发，具有10个周期的高斯锥形脉冲。与研究气泡动力学所需的脉冲持续时间相比，通常需要更长的脉冲持续时间来诱导生物效应。这些实验中使用的超声频率为1 MHz，2 MHz或3 MHz，声压幅度范围为81 kPa至1200 kPa。 - 在脉冲/延迟发生器上，设置激光的触发延迟，以便在记录期间从微气泡中激发纳米颗粒的荧光。
注意：对于这些特定实验，触发延迟在20 μs和170 μs之间，总持续时间为150 μs。时序图如图 4B所示。 - 使用XYZ载物台移动包含样品溶液的样品架，以定位显微镜焦点中的单个微气泡。从样品架一角的视野开始;参见 图4C ，了解理想的相机视图，其中微气泡的界面清晰可见且对焦。触发录制。
- 根据超声设置（频率和声压）根据需要多次重复步骤2.3.5.3，将含有微气泡的细胞培养盒从先前位置移动至少2毫米（在光学平面中），以确保在先前的实验中视场中的微气泡不会被超声处理。
注意：在本研究中，每个实验重复〜10-20x。当整个样品架不均匀时，清空样品架，并用新鲜的样品溶液重新填充它以进行后续实验。在实验之间移动样品架的距离取决于声束大小。
- 通过上述内部书面脚本在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压幅度。
- 数据分析
- 根据研究问题分析荧光显微镜记录。对于每个微气泡，在荧光显微镜实验中直观地确定纳米颗粒的递送是否发生。如果观察到纳米颗粒从气芯到样品支架膜上的分离和沉积有单个微气泡，则手动输入在编程环境中发生的递送。
- 光学系统的组装
3. 活体显微镜检查
- 背侧皮褶窗腔手术（如前所述26，47，50）
- 在放置窗户室之前，使动物适应一周。虽然雌性和雄性小鼠都可以使用，并且年龄不重要，但要确保小鼠的重量至少为22-24g，以使皮肤具有足够的灵活性。
- 在全身麻醉下进行手术，术中和术后镇痛治疗。通过皮下注射芬太尼（0.05mg / kg）/美替咪定（0.5mg / kg）/ midazolam（5mg / kg）/ 水（2：1：2：5）以每10g重量0.1mL的剂量麻醉动物。使用加热垫或加热灯来保持动物的体温。
- 轻轻拉动动物背部的双层皮肤，使皮肤夹在窗室的两个对称聚甲醛框架之间。通过放置两个穿过双层皮层的螺钉并沿着腔室的上边缘缝合来固定腔室。
- 取下皮肤褶皱一侧腔室圆形框架内的皮肤。将直径为11.8毫米的盖玻片放在框架内，去除皮肤以形成进入组织的窗口。
- 皮下注射阿替马唑（2.5mg / kg），氟马西尼（0.5mg / kg）和水（1：1：8），剂量为每10g0.1mL作为解毒剂以终止麻醉。将动物放在加热的回收架中过夜。用25mg / mL恩诺沙星补充动物的水，以防止手术部位感染。
- 肿瘤模型创建
- 将癌细胞保持在37°C和5%CO 2 气氛中，在适当的培养基中补充10%胎牛血清和100 U / mL青霉素和100mg / mL链霉素。
注意：该方案中使用了人骨肉瘤（OHS）细胞系，但也可以使用其他细胞系。 - 在步骤3.1.5后的第二天，用异氟醚麻醉动物几分钟（诱导期间为5%，维持期间为1-2%）。取出盖玻片，在30μL细胞培养基中施用5×106 个癌细胞，然后更换盖玻片。
- 在成像之前，让肿瘤生长2周，并在此期间每周至少监测动物的体重和健康状况3次。
- 将癌细胞保持在37°C和5%CO 2 气氛中，在适当的培养基中补充10%胎牛血清和100 U / mL青霉素和100mg / mL链霉素。
- 光学系统的组装
- 在超声治疗期间（如之前的工作26中所述），根据所涉及的研究问题，使用合适的显微镜和物镜进行活体成像。实验设置的示意图见 图5A 。
注意：对于该特定实验，使用了多光子显微镜，配备了20倍浸水物镜（NA为1.0，工作距离为2 mm）和脉冲激光器。在共振扫描模式下以每秒31帧（512 x 512像素）的速度获取图像，视场为400 x 400μm2。激发波长为790 nm。两个砷化镓磷化物检测器前面的滤光片是长通590 nm和带通525/50 nm，用于检测荧光。
- 在超声治疗期间（如之前的工作26中所述），根据所涉及的研究问题，使用合适的显微镜和物镜进行活体成像。实验设置的示意图见 图5A 。
- 声学系统的组装
- 将合适的超声换能器安装在波导（定制）中，相对于光轴的角度为45°，位于物镜下方，以最大限度地减少背皮褶窗室盖板玻璃的反射，并减少驻波形成。用蒸馏水和脱气水填充波导。在波导顶部涂上超声耦合凝胶。
- 光学和声学系统的对准
- 将光轴与超声波的焦点对齐。将光纤水听器放置在物镜的焦点中。然后，打开放大器和任意波形发生器，以脉冲重复频率为100 Hz的短脉冲（5-10个周期）激发换能器，并将超声换能器移动到示波器上的水听器信号检测到最高压力的位置。
注：对准后不要改变探头的位置。
- 将光轴与超声波的焦点对齐。将光纤水听器放置在物镜的焦点中。然后，打开放大器和任意波形发生器，以脉冲重复频率为100 Hz的短脉冲（5-10个周期）激发换能器，并将超声换能器移动到示波器上的水听器信号检测到最高压力的位置。
- 成像方案
- 将加热的动物支架（定制设计）放置在波导和物镜之间的XY定位平台，并添加更多的耦合凝胶。麻醉动物，并放置尾静脉导管。将鼠标放入加热的支架中，并将窗口腔固定在支架中。在窗口室中的盖玻片顶部添加一个水滴，并将物镜移动到位以成像肿瘤组织。
-
图5B 显示了描述事件顺序的实验的时序图。静脉注射荧光标记的2 MDa葡聚糖（30μL，4mg / mL稀释在盐水中）以可视化脉管系统，并使用XY翻译阶段移动小鼠以找到具有合适血管的位置。在超声治疗前记录基线图像。根据研究问题以及要成像的显微镜和染料的细节调整帧速率，视野和记录长度。
注意：在这些实验中，在400 x 400μm2的视场下每秒记录31帧，并连续进行5分钟的成像。 - 在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率、脉冲长度和声压幅度。
注意：对于这些实验，使用1 MHz的频率，脉冲长度为10 ms，峰值负压幅度在0.2 MPa至0.8 MPa之间。使用0.5 Hz或0.1 Hz的脉冲重复频率，允许新的微气泡在超声脉冲之间重新注入治疗区域。 - 静脉注射 50 μL 微气泡（2 × 108 至 5 × 108 微气泡/mL），并在成像时应用超声检查，如 26 中所述。
- 数据分析
- 根据研究问题，使用（开源）图像处理软件和编程环境分析图像，如26中所述，以确定血管参数（直径，分支，流速和方向），血管中纳米颗粒的积累以及葡聚糖和纳米颗粒外渗到肿瘤组织的动力学和穿透深度。
Representative Results
按照协议中所述产生的微气泡使用各种显微镜方法和各种时间尺度进行分析。
共聚焦显微镜中纳米颗粒的荧光（图6A）表明壳具有不均匀的颗粒分布。其他显微镜方法可用于气泡表征。例如， 图6B 显示了使用扫描电子显微镜的微气泡的整体结构，如先前的工作34所示。
径向动力学和现象学气泡行为可以使用所描述的 体外 明场显微镜方法进行研究，其中微气泡以每秒1000万帧的速度成像。单个微气泡的半径是使用内部编写的脚本随着时间的推移提取的。这种径向响应的示例如图 7所示。
如图8A所示，典型成功纳米颗粒递送的图像序列，如第2.3.6节所述。当激光到达气泡时，可以看到嵌入微气泡壳中的纳米颗粒由于荧光而发光。在超声共振的驱动下，荧光纳米颗粒从微气泡的气芯中分离出来，沉积在样品支架的膜上。最后，激光关闭，荧光纳米颗粒不再被激发。微气泡的荧光标记有效载荷的不成功传递通常看起来像图8B中所示的图像序列，其中荧光纳米颗粒在微气泡的外壳上发光，在超声暴露期间保持完整。
采用超声实时活体内多光子显微镜检查，研究了超声和微气泡对血液中纳米颗粒行为的影响，增强了肿瘤血管的通透性，改善了纳米颗粒的递送。可以表征渗透到细胞外基质中的程度和动力学，作为声压，频率和脉冲长度的函数。超声治疗的效果可能因血管的大小和形态以及由此产生的气泡限制而异。超声波治疗如何影响血流和方向可以确定。 图9 显示了纳米颗粒随时间推移的外渗的示例实验，机械指数（MI）为0.826。活体内多光子显微镜的结果阐明了超声暴露过程中纳米颗粒的空间和时间外渗，这对于完全了解超声介导的纳米颗粒递送机制并优化此类技术非常有益26。
图1：变性酪蛋白中具有荧光标记的聚合物纳米颗粒壳的微气泡的示意图。微气泡的直径通常在1μm到10μm之间。纳米颗粒的直径大多在100nm和200nm38之间。缩写：C3F8 = 全氟丙烷气体。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：示意图，显示了明场显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜和活体显微镜的相关时间和长度尺度。请单击此处查看此图的放大版本。
图3：明场显微镜实验的示意图， （A）实验设置，（B）时序图，（C）典型的记录框架。比例尺 （C） = 10 μm。缩写：fps = 每秒帧数。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：荧光显微镜实验的示意图。 （A）实验设置，（B）时序图，和（C）典型记录帧。比例尺 （C） = 10 μm。缩写：fps = 每秒帧数。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：活体显微镜实验的示意图， （A）实验设置，（B）时序图，（C）典型的记录框架。比例尺 （C） = 50 μm。绿色对应于葡聚糖-FITC，红色对应于纳米颗粒。缩写：GaAsP = 砷化镓磷化物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：单个纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的3D结构 （A）使用共聚焦显微镜显示纳米颗粒，（B）使用扫描电子显微镜显示3D结构。（二）经34许可转载。（A） 中的比例尺 = 5 μm;（B） 中的比例尺 = 2 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图7：在1 MHz的超声频率和142 kPa的声压振幅下，2.89μm半径的纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的典型球形振荡。比例尺 = 5 μm，红线表示初始半径。照明曲线（任意单位）由黄色表示。放大倍率为 120 倍。请单击此处查看此图的放大版本。
图8：来自高速荧光显微镜的图像序列。 （A）在2 MHz的超声频率和600 kPa的声压振幅下，成功递送纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的荧光标记纳米颗粒。（B）在2 MHz的超声频率和210 kPa的声压振幅下发出的纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡的荧光标记纳米颗粒的递送不成功。比例尺 = 10 μm。放大倍率为 120 倍。 请单击此处查看此图的放大版本。
图9：纳米颗粒和蛋白质稳定的微气泡在1 MHz的超声频率和800 kPa的声压振幅下进行振动显微镜检查 （A）容器内的纳米颗粒，以及（B）由白色虚线正方形指示的区域的图像序列，描绘了葡聚糖（绿色）和纳米颗粒（红色）的外渗。比例尺 = 50 μm。放大倍率为 20 倍。 请单击此处查看此图的放大版本。
Discussion
结合不同的光学显微镜方法，以获得有关纳米颗粒从微气泡表面传递到周围介质的各个步骤的信息。对气泡振荡进行成像，以及对气泡壳中纳米颗粒的释放，外渗以及体内肿瘤细胞外基质的渗透进行成像。与更复杂的体内设置相比，体外成像可以筛选许多超声参数。结合这一系列成像方式的好处是在不同的时间尺度上可以获得补充信息 - 这一特征对于表征和优化微气泡以获得成功递送并获得治疗效果至关重要。这种方法有助于了解所有微气泡的递送机制，包括具有荧光标记纳米颗粒和药物的构建体。
用于研究单个微气泡的显微镜方法中最关键的步骤如下。对于荧光显微镜，纳米颗粒应进行荧光标记，以便能够可视化颗粒释放。此外，样品溶液应充分稀释以分离单个微气泡，以便在共聚焦，明场和荧光显微镜方法中进行分析。此外，重要的是选择超声波驱动频率和声压来最有效地激发气泡，即在它们的共振下。如果研究问题涉及纳米颗粒有效载荷的传递，则应将适当的超声参数作为研究的一部分。除了共振之外，这些气泡还应被驱动到或超过其纳米颗粒释放的阈值，通常在相对较高的声压振幅（MI >0.3）51。对于明场显微镜成像，选择具有足够高帧速率的高速相机以最大限度地减少运动模糊并避免混叠至关重要。
明场显微镜主要受成像帧速率和可用光源强度的限制，因为较高的帧速率可以更详细地了解气泡动力学的时间分辨，但由于曝光时间更短，因此需要更强烈的照明。为了更详细地研究粒子释放，原则上可以通过增加激光的强度来增加荧光成像的帧速率。然而，荧光标记的微气泡对高强度激光的吸收会产生热量，即使使用高量子产率染料也是如此。这种热量会干扰所涉及的实验，并且在极端情况下会诱发光热空化52。因此，在实践中，所施加的激光通量是有限制的。然而，强烈的激光照明也可以故意用于诱导脂质体的颗粒释放53。温度影响气泡动力学和超声波响应，具体取决于气泡类型54。因此，如果要客观地比较 体外 和活体内的方法，则应在37°C下进行方案中讨论的 体外 方法。 当前论文中讨论的 体外 方法的另一个局限性是气泡不在自由场环境中，因为微气泡将漂浮在样品架膜下方。此外，在对单个微气泡进行成像时存在选择偏差。然而，对单个气泡进行重复实验可以研究大小的影响并去除混杂因素 - 大小分布。如果气泡响应可以理解为大小的函数，而浓度不太高以防止气泡 - 气泡相互作用，则可以计算任何任意气泡群体的响应。最后，明场和荧光显微镜方法都提供了对二维（2D）图像中卷曲的微气泡的见解。如果研究问题需要超过2D成像，则可以通过将协议中描述的设置与多平面成像的侧视图设置相结合来解决气泡的3D行为55。
研究微气泡的另一种方法是声学表征56。然而，测量单个微气泡的回波需要定位和隔离超声束内的单个微气泡56，这带来了通常通过使用窄管或光学或声学镊子来解决的挑战57，58。为了从声学上确定气泡的大小，微气泡可以在几何散射状态下以远高于其共振频率的频率进行共振，这不会诱发体积微气泡振荡59。使用"声学相机"是一种响应超声波对单个微气泡的径向动力学进行成像的方法，其中高频超声探头用于确定气泡对低频驱动波60的径向响应。该方法的缺点是只能用于确定微气泡半径的相对变化;因此，需要另一种方法来确定绝对气泡 半径，例如，通过光学成像61，62。微气泡以高于其共振频率的频率暴露于超声波的方法的缺点是，在如此高的频率下，穿透深度减小59，限制了 体内 应用的可用性。其他形式的显微镜也可用于研究微气泡，例如扫描电子显微镜，原子力显微镜和透射电子显微镜63。然而，这些替代显微镜技术可实现的时空分辨率通常更有限，并且这些技术的缺点是成像是在超声暴露之前或之后通过离线分析进行的，并且通常呈现低通量63。另一种选择是使用光散射方法，该方法可用于实时研究单个微气泡的径向动力学，但与声学散射方法相比，信噪比较低64。
超声暴露期间的实时活体显微镜检查是一种强大的方法，可以在超声暴露期间获得有关脉管系统，微气泡，纳米颗粒或其他分子（例如右旋糖）行为的新见解。进行实时活体显微镜检查时的一般限制是仅对组织的一小部分区域进行成像，并且光对组织的穿透深度有限。如果成像的血管在视野内含有很少的微气泡和/或纳米颗粒，则很少或根本没有关于纳米颗粒行为和外渗的信息。此外，由于视场有限，光和超声波路径之间的正确对齐至关重要。如果超声压力足够高以诱发气泡破坏，那么选择脉冲重复频率也很重要，该频率允许新鲜气泡在超声脉冲之间重新注入视野。此外，由于超声波将从窗室和物镜中的盖板玻璃反射，因此将换能器放置在一定角度对于减少反射非常重要，以防止形成驻波，从而扭曲校准的压力场。另一个实际问题是，设置需要有足够的空间来安装显微镜设置中物镜上方或下方的超声探头和波导。背窗室中的肿瘤由于限制室和盖玻片而具有有限的厚度;但是，如果需要，可以使用其他模型。例如，皮肤褶皱肿瘤在乳腺脂肪垫65 或腹部活体内成像的肿瘤在各个器官66。这种肿瘤可以在适当的微环境中原位生长，因此，呈现出更具临床相关性的病例。
这项工作中描述的方法启发了荧光标记微气泡的潜力，以使用气泡和超声波研究药物递送应用的基础知识。这种显微镜方法的组合为超声谐振的微气泡响应及其相关的声学参数空间提供了有价值的见解，并提供了相关时间和长度尺度范围内微气泡和有效载荷行为的清晰视图。
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 | Tabor Electronics | Arbitrary waveform generator (programmable) | |
| 2100 L | ENI | Amplifier, used in window chamber setup | |
| 2 MDa dextran | Sigma-Aldrich | ||
| 33522 A | Agilent Technologies | Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup | |
| A1R | Nikon Instruments | Confocal microscope | |
| ACE I | SCHOTT | Dimmable AC halogen light source | |
| Atipemazol | Orion Pharma | Antidote to wake animal | |
| Baytril | Bayer | Enrofloxacin | |
| BD Neoflon 24 G | Becton Dickinson & Company | Tail vein catheter | |
| BNC model 575 | Berkely Nucleonics Corporation | Pulse/delay generator | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Branson | Ultrasonic bath | |
| Channel slide | Ibidi | ||
| CLINIcell 25 | Laboratoires Mabio International | Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm) | |
| Cohlibri | Lightline | Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm) | |
| DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | Oscilloscope | |
| Fentanyl | Actavis Group HF | Anaesthesia of mouse | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | Supplement for cell culture medium | |
| Fiber-optic hydrophone | Precision Acoustics | Used for alignment | |
| Flumanezil | Fresenius Kabi | Antidote to wake animal | |
| Heated animal holder | Custom design | A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber | |
| Hyper Vision HPV-X2 | Shimadzu | High-speed camera | |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin | open source image processing program | |
| In vivo SliceScope | Scientifica | Multiphoton microscope | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| ISOTON | Beckman Coulter | Filtered, phosphate-buffered saline solution | |
| LUMPLFLN60XW | Olympus | Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm) | |
| MaiTai DeepSee | Spectra-Physics | Pulsed laser | |
| MATLAB | Mathworks | Programming environment | |
| Medetomidine | Orion Pharma | Anesthesia of mouse | |
| Midazolam | Accord Healthcare Limited | Anesthesia of mouse | |
| Milli-Q | Merck | Ultrapure water | |
| MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe | PerkinElmer | Strobe light | |
| Panametrics-NDT C305 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1") | |
| Panametrics-NDT V304 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25") | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
| Perfluoropropane gas | F2 Chemicals | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 | Gibco Thermo-Fisher | Cell culture medium | |
| Safe-Lock tube | Eppendorf | ||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
| T 25 basic ULTRA-TURRAX | IKA laboratory technology | Dispersion tool | |
| TDS 210 | Tektronix | Oscilloscope, used in window chamber setup | |
| Transducer | Precision Acoustics Ltd | Used in window chamber setup | |
| U-TLU | Olympus | Tube lens | |
| VBA100-200 | Vectawave | Amplifier | |
| Window chambers | Custom made | Used in window chamber setup | |
| XLUMPLFLN20 XW | Olympus | 20x water dipping objective | |
| XY(Z) translation stages | Thorlabs |
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