Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Multi-timescale mikroskopi metoder til karakterisering af fluorescerende-mærket Microbubbles for Ultralyd-udløst Drug Release

Published: June 12, 2021 doi: 10.3791/62251
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 4,5,6, 3,6,7, 7, 1
1Physics of Fluids group, Department of Science and Technology, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 2BIOS Lab-on-a-Chip group, Max Planck Center Twente for Complex Fluid Dynamics, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 3Department of Biotechnology and Nanomedicine, SINTEF Industry, 4Department of Circulation and Medical Imaging, Norwegian University of Science and Technology, 5Department of Health Research, SINTEF Digital, 6Cancer Clinic, St. Olav’s Hospital, 7Department of Physics, Norwegian University of Science and Technology

Summary

De præsenterede protokoller kan bruges til at karakterisere reaktionen af fluorescerende-mærket mikrobobler designet til ultralyd-udløste lægemiddellevering applikationer, herunder deres aktiveringsmekanismer samt deres biovirkninger. Dette papir dækker en række in vitro - og in vivomikroskopiteknikker , der udføres for at fange de relevante længder og tidshorisonter.

Abstract

Microbubble kontrast agenter holder store løfte for narkotika levering applikationer med ultralyd. Indkapsling af lægemidler i nanopartikler reducerer systemisk toksicitet og øger cirkulationstiden for stofferne. I en ny tilgang til mikrobubble-assisteret lægemiddellevering er nanopartikler indarbejdet i eller på mikrobubbleskaller, hvilket muliggør lokal og udløst frigivelse af nanopartiklernes nyttelast med ultralyd. En grundig forståelse af frigivelsesmekanismerne inden for det store ultralydsparameterrum er afgørende for effektiv og kontrolleret frigivelse. Dette sæt af præsenterede protokoller gælder for mikrobobler med en skal indeholdende en fluorescerende etiket. Her er der fokus på mikrobobler fyldt med poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylat) polymere nanopartikler, dopet med et modificeret Nilrødt farvestof. Partiklerne er fastgjort i en denatureret kasein shell. Mikroboblerne produceres ved kraftig omrøring, der danner en spredning af perfluoropropan gas i væskefasen, der indeholder kasein og nanopartikler, hvorefter mikrobobbleskallen selv samler sig. En række mikroskopi teknikker er nødvendige for at karakterisere nanopartikler-stabiliseret mikrobobler på alle relevante tidshorisonter af nanopartikler frigivelsesprocessen. Fluorescens af nanopartikler muliggør konfokal billeddannelse af enkelte mikrobobler, der afslører partikelfordelingen i skallen. In vitro ultra-high-speed imaging ved hjælp af bright-field mikroskopi på 10 millioner billeder i sekundet giver indsigt i boblen dynamik som reaktion på ultralyd insonation. Endelig nanopartikler frigivelse fra boblen shell er bedst visualiseret ved hjælp af fluorescens mikroskopi, udført på 500.000 billeder i sekundet. For at karakterisere lægemiddellevering in vivo studeres den udløste frigivelse af nanopartikler i vaskulaturen og deres ekstravasation ud over etdotellaget ved hjælp af intravital mikroskopi i tumorer implanteret i dorsale hudfold vindueskamre over en tidshorisont på flere minutter. Kombinationen af disse komplementære karakteriseringsteknikker giver unik indsigt i mikroboblernes adfærd og deres nyttelastfrigivelse på en række tids- og længdeskalaer, både in vitro og in vivo.

Introduction

Ultralyd er den mest udbredte medicinske billeddannelsesteknik. Det er ikke-invasiv, hurtig, sikker, omkostningseffektiv, og bærbar1,2,3. Men, blod er en dårlig ultralyd scatterer, og kontrasten i blodpuljen kan forbedres ved en intravenøs injektion af ultralyd kontrast agenter3. Denne forbedrede kontrast i blodpølen gør det muligt at kvantificere organperfusion til diagnostiske formål, f.eks. Faktisk tumor vaskulatur viste sig at være en vigtig prognostisk faktor6. En stor forskningsindsats er nu rettet mod mikrobobble-assisteret, målrettet molekylær billeddannelse og skræddersy kontrastmidler til terapeutisk brug.

Kommercielt tilgængelige ultralyd kontrastmidler består typisk af en suspension af coatede mikrobubbles7,8 med diametre fra 1 μm til 10 μm9. Da ultralyd kontrast agent mikrobubbles er lidt mindre end røde blodlegemer7, mikrobobler kan sikkert nå selv de mindste kapillærer uden at skabe en okklusion3. Mikrobubbles har en dramatisk øget ultralyd backscattering koefficient i forhold til væv10, på grund af deres komprimerbare gas kerne11. Desuden er mikrobobble echo meget ikke-lineært, dvs. dets spektrum indeholder harmoniske og underharmonikere af kørefrekvensen. Derudover er ekkostyrken stærkt afhængig af boblens resonante respons12. Mens væv spredes kun lineært, et lille antal mikrobobler er tilstrækkelig til at opnå en høj detektion følsomhed i harmonisk billeddannelse13,14. Denne ikke-lineære kontrast generation kan endda være stærk nok til at spore enkelte bobler i kroppen15.

Skallen af ultralyd kontrast agent stabiliserer boblerne mod opløsning og sammenhold, hvilket øger deres omsætning tid i blodpuljen16. Skallen kan bestå af lipider, polymerer, eller denaturerede proteiner3,8. Det mindsker den interfaciale spænding og begrænser dermed effekten af Laplace trykdrevet opløsning17 og skaber en resistiv barriere mod gasspredning18. For yderligere at øge stabiliteten er kontrastmikrobubblerne typisk fyldt med en høj molekylvægtgas med lav opløselighed i blodet11. Mikrobobble shell dramatisk ændrer reaktionen af mikrobobler til ultralyd insonation11. Ubestrøgne gasbobler har en karakteristisk resonansfrekvens, der er omvendt proportional med deres størrelse, og tilsætning af en lipidbelægning øger resonansfrekvensen i forhold til en ubestrøget buble på grund af skallens indre stivhed3. Desuden spreder skallen energi gennem dilatationsviskositet, som udgør den dominerende kilde til dæmpning for coatede bobler3. Den stabiliserende skal har den ekstra fordel, at den kan funktionaliseres, f.eks. ved at binde målretning ligands til overfladen af mikrobobler. Denne målretning muliggør mange applikationer til disse bobler og især molekylær billeddannelse med ultralyd14,19.

Microbubble kontrast agenter holder store løfte for narkotika levering applikationer med ultralyd. Microbubbles oscillerende i indespærring af et blodkar kan forårsage mikrostreaming samt lokale normale og forskydning understreger på kapillær væg3. Ved høje akustiske tryk kan store amplitudssvingninger føre til mikrobubble kollaps i en voldelig proces kaldet inertiel kavitation, hvilket igen kan føre til brud eller invagination af blodkarret20. Disse voldelige fænomener kan fremkalde bioeffekter såsom sonopermeation21, øge ekstravasation af terapeutiske lægemidler i interstitium på tværs af endotelvæggen, enten paracellulært eller transcellulært. Det kan også forbedre indtrængen af terapeutiske midler gennem den ekstracellulære matrix af stroma-rige tumorer21,22 og biofilm23,24, selv om denne mekanisme er stadig dårligt forstået26.

Ultralyd-medieret lægemiddellevering har vist lovende resultater både præklinisk27,28 og i kliniske forsøg22. Desuden, når de anvendes med relativt lavfrekvente ultralyd (~ 1 MHz), mikrobobler er blevet rapporteret til lokalt og forbigående øge blod - hjerne barriere permeabilitet, hvilket gør det muligt for lægemidler at komme ind i hjernen parenkym, både i prækliniske og kliniske undersøgelser29,30,31,32,33,34.

Der er generelt to tilgange til ultralyd-medieret lægemiddellevering: Det terapeutiske materiale kan administreres sammen med boblerne, eller det kan fastgøres til eller indlæses i bobleskallen28,35,36. Den anden tilgang har vist sig at være mere effektiv med hensyn til narkotikalevering37. Mikrobobler kan lastes med lægemidler eller genetisk materiale indkapslet i nanopartikler (liposomer eller polymere nanokonstruktioner), der er fastgjort til skallen eller indarbejdet direkte i mikrobobbleskallen35,36. Nanopartikler-loaded mikrobubbles kan aktiveres ved (fokuseret) ultralyd til lokalt at frigive nanopartikler nyttelast28,33,38,39,40. Hvis en sådan mikrobobble er i direkte kontakt med en celle, har det vist sig in vitro, at nyttelasten endda kan deponeres på cellen cytoplasmisk membran i en proces kaldet sonoprinting34,35.

Ultralyd parameter plads til microbubble insonation er omfattende, og in vivo biologiske forhold yderligere tilføje kompleksitet. Således udgør kombinationen af fokuseret ultralyd og nanopartikler-loaded mikrobubbles en udfordring inden for målrettet terapi.

Formålet med dette arbejde er at levere protokoller, der kan bruges til at afbilde, i detaljer, respons af mikrobobler som en funktion af ultralydsparametrene og at studere de mekanismer, der fører til shell brud og efterfølgende frigivelse af fluorescerende mærket shell materiale. Dette sæt protokoller gælder for mikrobobler med skaller, der indeholder et fluorescerende farvestof. Figur 1 viser en skematisk repræsentation af de polymer-nanopartikler og protein stabiliserede mikrobobler udviklet på SINTEF (Trondheim, Norge). Disse bobler er fyldt med perfluoropropan gas (C3F8) og nanopartikler, der stabiliserer skallen indeholder NR668, som er en lipophilic derivat af Nile Red fluorescerende dye38,43. Nanopartiklerne består af poly(2-ethyl-butylcyanisacrylat) (PEBCA) og er PEGylated. Funktionalisering med polyethylenglycol (PEG) reducerer opsonisering og fagocytose ved mononuklear phagocytsystemet og forlænger derved cirkulationstiden14,44. Som følge heraf øger PEGylation mængden af nanopartikler, der når målstedet, hvilket forbedrer effekten af behandlingen16. Figur 2 illustrerer, hvordan brugen af fire mikroskopimetoder gør det muligt for forskere at dække alle relevante tids- og længdeskalaer. Det skal bemærkes, at den rumlige opløsning, der kan opnås ved optisk mikroskopi, bestemmes af diffraktionsgrænsen, som afhænger af bølgelængden af den lette og numeriske blænde (NA) af målet og objektbelysningskilden45. For de foreliggende systemer er den optiske opløsningsgrænse typisk 200 nm. Derudover kan intravital mikroskopi bruges til at afbilde på det subcellulære niveau46. For de nanopartikler og proteinstabiliserede mikrobobler, der anvendes i dette arbejde, er den mindste længdeskala, der er relevant for intravital mikroskopi, størrelsen af små kapillærer (≥10 μm). In vitro high-speed optisk billeddannelse (10 millioner billeder i sekundet) og højhastigheds fluorescens imaging (500.000 billeder i sekundet) eksperimenter er beskrevet for enkelt mikrobobler. Højhastigheds lys-felt billeddannelse på nanosekund tidsskalaer er egnet til at studere den tid-løst radiale dynamikken i de vibrerende bobler. I modsætning hertil giver højhastighedsbio fluorescensmikroskopi mulighed for direkte visualisering af frigivelsen af de fluorescerende mærkede nanopartikler. Desuden kan strukturen af mikrobobble shell undersøges ved hjælp af Z-stack tre-dimensionelle (3D) konfokal mikroskopi, og scanning elektronmikroskopi (protokollen for sidstnævnte er ikke inkluderet i det nuværende arbejde). Intravital mikroskopi består i at bruge multiphoton mikroskopi til billede tumorer vokser i dorsale vindueskamre til at give real-time oplysninger om lokal blodgennemstrømning og om skæbnen for fluorescerende-mærket nanopartikler in vivo47. Kombinationen af disse mikroskopi metoder i sidste ende giver detaljeret indsigt i adfærd terapeutiske mikrobubble agenter som reaktion på ultralyd, både in vitro og in vivo.

Protocol

BEMÆRK: Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af de norske dyreforsøgsmyndigheder. Oplysninger om materialer, der blev brugt i protokollen, findes i materialetabellen.

1. Produktion af mikrobobler

BEMÆRK: I dette arbejde er de mikrobubbles af interesse protein-og-nanopartikler stabiliserede mikrobubbles, for hvilke produktionsprotokollen tidligere er blevet beskrevet28,33,48. Derfor er fabrikationsprotokollen blevet kort opsummeret her.

  1. For det første blandes ultrapurt vand med 0,5 wt% af kasein i fosfat-buffered saltvand (PBS) og 1 wt% af nanopartiklerne mærket med 0,21 wt% af fluorescerende farvestof, NR668 (modificeret Nile Red), i et sterilt glas krympe top hætteglas (10 mL, diameter på 2 cm). De polymere nanopartikler fremstilles ved hjælp af miniemulsionspolymeriseringsmetoden som beskrevet af Mørch et al. 38.
    BEMÆRK: Her fungerer farvestoffet som et modelmiddel for at muliggøre visualisering af nanopartikler frigivelse. Når du arbejder med nanopartikler opløsning, bære en kittel, beskyttelsesbriller, og handsker. Tør eventuelle spild af nanopartikler opløsning straks med 100% acetone.
  2. Cap hætteglasset med gummihætten, bland lidt, og læg hætteglasset i et ultralydsbad i 10 minutter ved stuetemperatur for at eliminere mulige aggregater. Placer et spredningsværktøj med spidsen af omrøreren ~ 0,5 cm fra bunden af glasglasset. Ved hjælp af en glaspipette, der er tilsluttet gasbeholderen, tilsættes perfluoropropangassen til hætteglasset, der indeholder opløsningen, indtil opløsningen begynder at boble lidt.
    BEMÆRK: Pak selvlukkende film rundt om bunden af spredningsværktøjet for at forhindre, at glasglasglasset glider under omrøring.
  3. Rør kraftigt opløsningen ved 1935 × g (24.000 omdr./min. med en rotationsradius på 3 mm) i 4 min ved hjælp af spredningsværktøjet. Luk hætteglasset med gummihætten, og forsegl hætteglasset til videre brug.
    BEMÆRK: Omrøring fasts fastslutter gassen i væsken. Mikrobobbleskallen samler efterfølgende sig selv uden at kræve noget aktivt trin.
  4. Opbevar den overskydende kasein- og nanopartikleropløsning ved 4 °C, og rengør spredningsværktøjet med 100 % acetone.

2. Imaging enkelt bobler

  1. Konfokal mikroskopi
    1. Prøveforberedelse
      1. Fortynd bobleopløsningen til at afbilde enkelte mikrobobler som følger. Anbring en udluftningsnål (19 G-21 G) i et glas krympe topglas, der indeholder de mikrobubbles, der produceres ved at følge proceduren i punkt 1. Vend hætteglasset på hovedet for at tillade store bobler at bevæge sig væk fra hætteglasets forsegling.
      2. Sæt endnu en nålespids (19 G) af en lille (~1 mL) sprøjte i hætteglasset, mens hætteglasset stadig er på hovedet. Fjern en lille mængde af bobleaffjedringen, og overfør indholdet af sprøjten til et lille rør for lettere pipettering i næste trin.
        BEMÆRK: Suspensionens volumen, der skal udtrækkes direkte, afhænger af typen og koncentrationen af bobleaffjedringen. I dette tilfælde blev der udvundet 0,2 mL.
      3. Ved hjælp af en pipette fortyndes mikrobubbleaffjedringen (fra afsnit 1) i filtreret PBS for at opnå en koncentration på ca. 2 × 105 til 6 × 105 mikrobobler /mL for at muliggøre enkeltboblebilleddannelse.
        BEMÆRK: Afhængigt af bobletypen anbefales det at vaske bobleaffjedringen for at fjerne frit fluorescerende farvestof. Dette er især vigtigt med bobler, for hvilke fluorescerende farvestof er infunderes i skallen. Hvis du vil vaske bobler, fortyndes bobleaffjedringen (f.eks. ved at tage 100 μL af bobleopløsningen i 10 mL PBS) og centrifugere den (typisk ved hastigheder i størrelsesordenen 100 × g). Endelig skal du fjerne supernatanten, der indeholder mikroboblerne, med en pipette til yderligere analyse. Den resterende opløsning indeholder de frie fluorescerende partikler og kan kasseres. Vasketrinnet skal gentages efter behov.
      4. Tilføj glycerol til blandingen for at øge viskositeten af mediet og fjerne bevægelsen induceret af Brownian bevægelse, der ellers ville forstyrre den ret langsomme confocal Z-stack imaging.
        BEMÆRK: Mængden af glycerol afhænger af den type boble, der er afbildet (her ~ 50%). For nogle typer bobler kan glycerol have en negativ indvirkning på stabilitet49. Der blev dog ikke observeret nogen mærkbar ændring i boblerne over ca. 30 min under konfokal billeddannelse. Desuden kan glycerol ændre mikroboblernes akustiske respons og kan derfor kun anvendes med billeddannelsesmetoder, hvor mikroboblerne ikke er insonificeret.
      5. Placer mikrobobble suspension i et kammer med tynde vægge for optimal billeddannelse såsom en kanal slide.
    2. Billedprotokol
      1. Tænd for det konfokale mikroskop, og vælg et passende mål og den ønskede laser og scanner til brug under konfokal mikroskopi.
        BEMÆRK: Her skal du bruge et 60x vanddypningsmål for en opløsning på 0,08 μm/pixel, og afhængigt af boblestørrelsen skal du afbilde et område på 256 x 256 pixels eller 128 x 128 pixels. I disse specifikke eksperimenter skal du bruge en 488 nm laser og en Galvano scanner. Emissionsbølgelængden afhænger af det fluorescerende farvestof og er typisk bredbånd.
      2. Find en mikrobobble i bright-field, og skift til konfokal mikroskopi. Indstil de ønskede top- og bundplaner, mellem hvilke det konfokale mikroskop scanner. Erhverve en Z-stak til at observere 3D-struktur; bruge en trinstørrelse på 100 nm i Z-retningen.
  2. Mikroskopi i lyse felt
    1. Samling af det optiske system
      BEMÆRK: Der vises en skematisk repræsentation af opsætningen af mikroskopi i det lyse felt i figur 3A. For at sikre uforstyrret ultralydsudbredelse indeholder vandbadet to åbninger: en til en lyskilde og en til en ultralydtransducer. Det optiske system består af et (modulært) mikroskop, et højhastighedskamera og matchende optik. Da perioden med mikrobubblesvingninger typisk er i størrelsesordenen 1 μs (ved hjælp af 1 MHz ultralyd), skal kameraet indstilles til at optage med en framerate på mindst 5 millioner billeder i sekundet. Her skal kameraet indstilles til at optage med 10 millioner billeder i sekundet (256 x 400 pixels) for 256 billeder (25,6 μs) for at fange alle detaljer om bobledynamikken, herunder højere harmoniske.
      1. Fastgør et vanddypningsmål med en passende forstørrelse, arbejdsafstand og NA til mikroskopet.
        BEMÆRK: Et vanddypningsmål blev brugt til at give en stabil arbejdsafstand på trods af gradvis fordampning af vandet. Her blev der valgt et vanddypningsmål med en forstørrelse på 60x, en arbejdsafstand på 2 mm og en NA på 1.
      2. Brug et strobelys med en topeffekt på mindst 1 kW til belysning og en rørlinse mellem mikroskopet og kameraet for at sikre, at så lidt omgivende lys som muligt når sensoren på højhastighedskameraet.
      3. Brug en dæmpbar halogenlyskilde til at fokusere på enkelte mikrobobler og justering af det optiske og akustiske system til realtidsbilleddannelse.
    2. Montering af det akustiske system
      1. Brug en programmerbar vilkårlig bølgeform generator og en effekt-forstærker (56 dB gain) til at drive transducer med en glat omsluttende og bølgeform. Tilslut et oscilloskop til den vilkårlige bølgeformgenerator for at kontrollere signalet. Tilslut en personlig computer til den vilkårlige bølgeform generator til at programmere den indgående akustiske trykbølge, ved hjælp af et script skrevet in-house.
      2. Brug en puls/forsinkelsesgenerator som hovedudløser til at synkronisere de optiske og akustiske systemer. Indstil udløserforsinkelserne på puls-/forsinkelsesgeneratoren og kamerasoftwaren, så optagelsen starter 16 μs efter ultralydsoverførsel, så ultralydsbølgen kan nå boblerne. Udløs lyskilden 1,5 μs før optagelsens start for at sikre korrekt belysning under boblesvingningerne (se figur 3B for timingdiagrammet).
      3. Vælg en passende transducer med en passende centerfrekvens. Placer det i en åbning af vandbadet, så det er i en vinkel med hensyn til den optiske akse for at minimere refleksioner fra prøveholdermembranerne og for at reducere stående bølgedannelse.
        BEMÆRK: Her blev en enkelt-element fokuseret nedsænkningstransducer med en midterfrekvens på 2,25 MHz, en brændvidde på 1" og elementdiameter på 0,75" placeret i en vinkel på 35 ° med hensyn til den optiske akse. Kalibreringen af overførselsfunktionen skal udføres ved hjælp af den samme forstærker, som bruges i det akustiske system. Kalibrer overførselsfunktionen fra spænding amplitud til tryk amplitud af transducer ved hjælp af en fiberoptisk hydrofon som en funktion af ultralydstransmission frekvens.
    3. Valg af prøveholder
      1. Brug en prøveholder med optisk og akustisk gennemsigtige membraner og et volumen, der er stort nok til at give mulighed for billeddannelse af flere enkeltmikrobubbles i samme prøve.
        BEMÆRK: Her blev der anvendt en cellekulturkassette med et volumen på 10 mL, membranområder på 25 cm2 og membrantykkelse på 175 μm. På grund af akustiske refleksioner på den nederste membran og interferens fra bølger, der reflekteres af mikroskopmålet og den øverste membran, kan det in situ akustiske tryk afvige fra det, der er programmeret på den vilkårlige bølgeformgenerator. Hvis transduceren placeres i en vinkel i forhold til prøveholdermembranerne, reduceres stående bølgedannelse, men kan øge refleksionerne fra membranerne.
      2. Sørg for, at prøven kan være helt nedsænket og bragt inden for fokus for både transducer og mikroskop mål. Brug en aluminiumsstøtte, der er fastgjort til et 3D-mikropositioneringstrin, til at flytte prøveholderen uafhængigt.
    4. Justering af de optiske og akustiske systemer
      1. For 3D-oversættelse for at justere opsætningen skal du fastgøre vandbadet til et XY-oversættelsesstadium og fastgøre scenen til et optisk bord for at sikre, at det ikke bevæger sig under eksperimenter. Fyld derefter vandbadet med vand, og tænd for den dæmpbare halogenlyskilde. Under justering skal du flytte mikroskopmålet til siden for at forhindre ultralydsrefleksioner.
      2. Fastgør en nål hydrofon (0,2 mm) til prøveholderarmen, og anbring nålen hydrofon i vandbadet med spidsen i synsfeltet af målet. Tænd forstærkeren og den vilkårlige bølgeform generator; brug enkeltimpulser på 5 til 10 ultralydscyklusser og en pulsgentagelsesfrekvens på 15 Hz. Sørg for, at hydrofonspidsen er centreret og i fokus på mikroskopbilledet. Flyt tanken i XY-retningen og nålen i Z-retningen, indtil den maksimale tryk amplitud er nået.
      3. Juster mikroskopets fokus for at fokusere på vandtelefonens spids igen.
        BEMÆRK: Denne protokol sikrer justeringen mellem mikroskopfokus og transducerfokus. Du må ikke ændre mikroskopets og transducerens position efter justering.
    5. Prøveforberedelse
      1. 2.1.1.1 til 2.1.1.3 for at forberede prøveopløsningen. Fortynd bobleløsningen for at muliggøre enkeltboblebilleddannelse og for at udelukke akustiske interaktioner af nærliggende bobler.
      2. Åbn prøveholderens udløb. Ved hjælp af en sprøjte skal prøveopløsningen injiceres i prøveholderens anden åbning, indtil den er helt fyldt. Sørg for, at der ikke er luftbobler inde i prøveholderen for at forhindre uønskede interaktioner med ultralydsfeltet.
      3. Luk begge ventiler i prøveholderen, og placer prøveholderen vinkelret på den optiske akse.
        BEMÆRK: Hold det fyldte prøveholderniveau for at forhindre, at boblerne flyttes til den ene side af prøveholderen under bevægelse.
    6. Billedprotokol
      1. Programmer den ønskede ultralydskørselsfrekvens og akustisk tryk i den vilkårlige bølgeformgenerator gennem det førnævnte in-house skriftlige script.
        BEMÆRK: Her var den akustiske trykbølge en enkelt byge af 40 cyklusser med en 8-cyklus Gaussian-tilspidset puls. Ultralyd frekvenser, der anvendes i disse eksperimenter var 1 MHz, 2 MHz, eller 3 MHz, med akustisk tryk amplituder spænder fra 81 kPa til 1200 kPa.
      2. Flyt prøveholderen, der indeholder prøveopløsningen, ved hjælp af XYZ-stadiet for at finde enkelte mikrobobler i mikroskopets fokus. Start med et synsfelt i et hjørne af prøveholderen, og sørg for, at kanten af mikroboblerne er tydeligt synlig og i fokus (se Figur 3C for en ideel kameravisning).
      3. Fastgør enden af en optisk fiber, der tidligere var forbundet til halogenlyset til et strobelys, så den anden ende stadig er forbundet til vandbadet. Afløs optagelsen.
      4. Gentag trin 2.2.6.2 til 2.2.6.3 så mange gange som ønsket pr. ultralydsindstilling (frekvens og akustisk tryk), idet cellekulturkassetten, der indeholder mikroboblerne, flyttes mindst 2 mm (i brændplanet) fra det tidligere sted for at sikre, at mikroboblerne i synsfeltet ikke er insonificeret i tidligere eksperimenter.
        BEMÆRK: Her blev hvert eksperiment gentaget ~ 20 gange. Når hele prøveholderen er insonificeret, tømmes prøveholderen og genopfyldes med frisk prøveopløsning til efterfølgende forsøg.
    7. Dataanalyse
      1. Vedtage et programmeringsmiljø til at udføre dataanalyse i henhold til forskningsspørgsmålet, og udføre kantdetektering efter behandling af billederne. Ved hjælp af en funktion, der måler billedregionernes egenskaber, skal du finde centroiden af en boble og derivatet af intensitetsprofilen omkring hver boble for at registrere boblens kontur (og dermed bobleradius R). Uddrag relevante parametre fra radius over tid for enkelte mikrobobler.
        BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt et programmeringsmiljø til billedbehandling til binarize og filteroptagelser af enkelte mikrobubbles. En in-house script blev brugt til at finde derivatet af intensiteten profil omkring hver boble.
  3. Fluorescensmikroskopi
    1. Samling af det optiske system
      1. Opbygge opsætningen for fluorescensmikroskopi (figur 4A) med samme base, der anvendes i den i punkt 2.2 beskrevne farvestofmikroskopi.
        BEMÆRK: Den opsætning, der er beskrevet i punkt 2.3, kan kombineres med den, der er beskrevet for lys-feltmikroskopi i afsnit 2.2. Ved at kombinere både fluorescensmikroskopi og lysfeltmikroskopi muliggør visualisering af mikrobobblegaskernen, mens nanopartiklerne frigives.
      2. Indstil højhastighedskameraet til at optage med 500.000 billeder i sekundet (400 x 250 pixel) for 128 billeder (256 μs).
        BEMÆRK: Billedtiden er længere end i de lyse feltforsøg, da lysintensiteten er begrænset i fluorescens, og fordi den tidsskala, over hvilken partikellevering forekommer, er længere end bobledynamikkens.
      3. Vælg en laser med en effekt høj nok til at levere tilstrækkeligt lys, og som har en passende excitation bølgelængde, og sørg for, at det er kombineret med en acousto-optisk modulator for at undgå blegning prøven.
        BEMÆRK: I denne undersøgelse blev en 5 W kontinuerlig bølgelaser med en excitationsbølgelængde på 532 nm brugt til at ophidse nanopartiklernes fluorescens.
      4. Placer en stråle splitter, dichroic spejl og hak filter mellem laser og mikroskop mål at lede excitation lys mod prøven og samtidig tillade fluorescens emission at nå kameraet.
    2. Montering af det akustiske system
      1. For at insonify mikroboblerne skal du bruge den samme akustiske opsætning som i punkt 2.2.2. Skift transduceren i disse specifikke eksperimenter til en enkelt-element, fokuseret nedsænkning transducer med en center frekvens på 2,25 MHz, en brændvidde på 1,88 ", og element diameter på 1". Placer den i en vinkel på 35° med hensyn til den optiske akse for at minimere refleksioner fra prøveholdermembranerne og reducere stående bølgeformationer.
    3. Justering af de optiske og akustiske systemer
      1. Gentag de trin, der er beskrevet i punkt 2.2.4.
    4. Prøveforberedelse
      1. Prøveopløsningen forberedes som beskrevet i punkt 2.2.5.
    5. Billedprotokol
      1. Indstil den ønskede ultralydskørselsfrekvens og akustisk tryk amplitud på den vilkårlige bølgeformgenerator gennem det førnævnte in-house skriftlige script.
        BEMÆRK: Her blev den akustiske trykbølge programmeret til at være en enkelt ultralydsudbrud på 140 cyklusser med en 10-cyklus gaussisk-tilspidset puls. Længere pulsvarigheder er generelt nødvendige for at fremkalde bioeffekter sammenlignet med dem, der kræves for at studere bobledynamik. Ultralyd frekvenser, der anvendes i disse eksperimenter var 1 MHz, 2 MHz, eller 3 MHz, med akustisk tryk amplituder spænder fra 81 kPa til 1200 kPa.
      2. På puls/forsinkelsesgeneratoren skal du indstille udløserforsinkelsen for laseren til fluorescerende excitation af nanopartiklerne fra mikroboblerne under optagelsen.
        BEMÆRK: For disse specifikke forsøg var udløserforsinkelsen mellem 20 μs og 170 μs i en samlet varighed på 150 μs. Tidsdiagrammet vises i figur 4B.
      3. Flyt prøveholderen, der indeholder prøveopløsningen, ved hjælp af XYZ-stadiet for at finde enkelte mikrobobler i mikroskopets fokus. Start med et synsfelt i et hjørne af prøveholderen. se Figur 4C for en ideel kameravisning, hvor mikroboblernes grænseflade er tydeligt synlig og i fokus. Afløs optagelsen.
      4. Gentag trin 2.3.5.3 så mange gange som ønsket pr. ultralydindstilling (frekvens og akustisk tryk), og cellkulturkassetten, der indeholder mikroboblerne, flyttes mindst 2 mm (i det optiske plan) fra det tidligere sted for at sikre, at mikrobobler i synsfeltet ikke sonikeres i tidligere eksperimenter.
        BEMÆRK: I denne undersøgelse blev hvert eksperiment gentaget ~ 10-20x. Når hele prøveholderen er insonificeret, tømmes prøveholderen og genopfyldes med frisk prøveopløsning til efterfølgende forsøg. Hvilken afstand prøveholderen skal flytte mellem eksperimenterne, afhænger af den akustiske strålestørrelse.
    6. Dataanalyse
      1. Analysere fluorescens mikroskopi optagelser i henhold til forskningsspørgsmålet. For hver mikrobobble, visuelt afgøre, om levering af nanopartikler i fluorescens mikroskopi eksperimenter opstod. Hvis der observeres løsrivelse og deposition af nanopartiklerne fra gaskernen til prøveholdermembranen for en enkelt mikrobubble, skal du manuelt indtaste, at leveringen fandt sted i programmeringsmiljøet.

3. Intravital mikroskopi

  1. Dorsal hudfold vindue kammer kirurgi (beskrevet tidligere26,47,50)
    1. Akklimatificer dyrene i en uge, før du placerer vindueskamrene. Selvom både hun- og hanmus kan bruges, og alderen er uvæsentlig, skal du sikre dig, at musenes vægt er mindst 22-24 g, så huden er tilstrækkelig fleksibel.
    2. Udfør operationen under generel anæstesi med intraoperativ og postoperativ smertestillende behandling. Bedøve dyret ved en subkutan injektion af fentanyl (0,05 mg/kg)/medetomidin (0,5 mg/kg)/midazolam (5 mg/kg)/vand (2:1:2:5) med en dosis på 0,1 mL pr. 10 g vægt. Brug en varmepude eller en varmelampe til at opretholde dyrets kropstemperatur.
    3. Træk forsigtigt på det dobbelte lag af huden på bagsiden af dyret, så huden er klemt inde mellem to symmetriske polyoxymethylenrammer i vindueskammeret. Fastgør kammeret ved at placere to skruer, der strækker sig gennem det dobbelte hudlag og syer langs kammerets øverste kant.
    4. Fjern huden i kammerets cirkulære ramme på den ene side af hudfolden. Placer et dækglas med en diameter på 11,8 mm inden for rammen, hvor huden fjernes for at danne et vindue ind i vævet.
    5. Brug en subkutan injektion af atipemazol (2,5 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) og vand (1:1:8) ved en dosis på 0,1 mL pr. 10 g som modgift for at afslutte anæstesi. Placer dyret i en opvarmet genopretning rack natten over. Suppler vandet til dyrene med 25 mg/mL enrofloxacin for at forhindre infektion på det kirurgiske sted.
  2. Oprettelse af tumormodel
    1. Opretholde kræftceller ved 37 °C og i en 5% CO2-atmosfære i et passende kulturmedium suppleret med 10% fosterkvægsserum og 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin.
      BEMÆRK: Den menneskelige osteosarcoma (OHS) cellelinje blev brugt i denne protokol, men andre cellelinjer kan også bruges.
    2. Dagen efter trin 3.1.5 bedøver dyret med isoflurane (5% under induktion og 1-2% under vedligeholdelse) i et par minutter. Fjern dækglasset, påfør 5 × 106 kræftceller i 30 μL cellekulturmedie, og udskift dækglasset.
    3. Tillad tumorer at vokse i 2 uger før billeddannelse, og overvåge vægten og sundhedsstatus af dyrene mindst 3 gange om ugen i denne periode.
  3. Samling af det optiske system
    1. Udfør intravital billeddannelse under ultralydsbehandling (som beskrevet i tidligere arbejde26) med et passende mikroskop og mål afhængigt af det forskningsspørgsmål, der er på spil. Se figur 5A for en skematisk repræsentation af forsøgsopsætningen.
      BEMÆRK: Til dette specifikke eksperiment blev der anvendt et multifotonmikroskop, der var udstyret med et 20x vanddypningsmål (NA på 1,0 og en arbejdsafstand på 2 mm) og en pulserende laser. Billeder blev erhvervet i resonant scanning tilstand på 31 billeder i sekundet (512 x 512 pixels) med et synsfelt på 400 x 400 μm2. Excitation bølgelængden var 790 nm. Filtrene foran de to gallium arsenidfosphiddetektorer var long-pass 590 nm og band-pass 525/50 nm til påvisning af fluorescens.
  4. Montering af det akustiske system
    1. Monter en egnet ultralydtransducer i en bølgeleder (specialfremstillet) placeret under målet i en vinkel på 45° med hensyn til den optiske akse for at minimere refleksioner fra dækglasset i det dorsale skinfold vindueskammer og for at reducere stående bølgeformationer. Fyld bølgeguiden med destilleret og afgasset vand. Påfør ultralyd kobling gel på toppen af waveguide.
  5. Justering af de optiske og akustiske systemer
    1. Juster den optiske akse med fokus for ultralyd. Placer en fiberoptisk hydrofon i fokus for målet. Tænd derefter forstærkeren og den vilkårlige bølgeformgenerator for at ophidse transduceren med korte udbrud (5-10 cyklusser) med en pulsgentagelsesfrekvens på 100 Hz og flytte ultralydtransduceren til den position, hvor det højeste tryk registreres med hydrofonsignalet på oscilloskopet.
      BEMÆRK: Transducerens position må ikke ændres efter justering.
  6. Billedprotokol
    1. Placer den opvarmede dyreholder (specialdesignet) tilsluttet et XY-positioneringstrin mellem bølgelederen og målet, og tilsæt mere koblingsgel. Bedøve dyret, og læg en hale venekateter. Placer musen i den opvarmede holder, og fastgør vindueskammeret i holderen. Tilføj en vanddråbe oven på dækslet slip i vinduet kammer, og flytte målet på plads for at billedet tumorvæv.
    2. Figur 5B viser timingdiagrammet over de eksperimenter, der skildrer hændelsesforløbet. Injicer fluorescerende mærket 2 MDa dextran intravenøst (30 μL, 4 mg/mL fortyndet i saltvand) for at visualisere vaskulaturen, og flyt musen ved hjælp af XY-oversættelsesfasen for at finde en position med egnede blodkar. Optag baseline billeder før ultralyd behandling. Juster billedhastighed, synsfelt og optagelseslængde afhængigt af forskningsspørgsmålet og detaljerne i det mikroskop og farvestoffer, der skal afbildes.
      BEMÆRK: I disse forsøg blev der registreret 31 billeder i sekundet med et synsfelt på 400 x 400 μm2, og billeddannelse blev udført kontinuerligt i 5 min.
    3. Indstil den ønskede ultralydskørselsfrekvens, pulslængde og akustisk tryk amplitud på den vilkårlige bølgeformgenerator.
      BEMÆRK: Til disse eksperimenter blev der anvendt en frekvens på 1 MHz med en pulslængde på 10 ms og peak negative tryk amplituder mellem 0,2 MPa og 0,8 MPa. En puls gentagelse frekvens på 0,5 Hz eller 0,1 Hz blev brugt til at tillade nye mikrobobler til at reperfuse i det behandlede område mellem ultralyd pulser.
    4. Indsprøjt 50 μL mikrobubbles (2 × 108 til 5 × 108 mikrobubbles/mL) intravenøst, og anvende ultralyd under billeddannelse, som beskrevet i26.
  7. Dataanalyse
    1. Afhængigt af forskningsspørgsmål, analysere billeder med (open source) billedbehandling software og et programmeringsmiljø, som beskrevet i26, at bestemme blodkar parametre (diameter, forgrening, flow hastighed, og retning), ophobning af nanopartikler i fartøjerne, og kinetika og penetration dybde ekstravasation af dextran og nanopartikler i tumorvæv.

Representative Results

Mikroboblerne, der blev produceret som beskrevet i protokollen, blev analyseret ved hjælp af forskellige mikroskopimetoder og på forskellige tidsskalaer.

Nanopartiklernes fluorescens i konfokal mikroskopi (figur 6A) indikerer, at skallen har en ikke-ensartet partikelfordeling. Andre mikroskopi metoder kan bruges til boble karakterisering. For eksempel viser figur 6B mikrobubbles overordnede struktur ved hjælp af scanningselektronmikroskopi, som præsenteret i tidligere arbejde34.

Radial dynamik og fænomenologisk boble adfærd kan studeres ved hjælp af den beskrevne in vitro lyse felt mikroskopi metode, hvori mikrobubbles blev afbildet på 10 millioner billeder i sekundet. Radius af enkelt mikrobobler blev udvundet over tid ved hjælp af et script skrevet in-house. Et eksempel på et sådant radialt respons er vist i figur 7.

En billedsekvens af typisk vellykket nanopartikler, som beskrevet i punkt 2.3.6, er vist i figur 8A. Nanopartiklerne indlejret i mikrobobbleskallen kan ses at lyse op på grund af fluorescens, når laserlyset når boblen. Drevet af ultralydssonation løsner de fluorescerende nanopartikler sig fra mikroboblernes gaskerne og deponeres på prøveholderens membran. Endelig er laseren slukket, og de fluorescerende nanopartikler er ikke længere begejstrede. Mislykket levering af mikroboblernes fluorescerende nyttelast ligner typisk billedsekvensen vist i figur 8B, hvor de fluorescerende nanopartikler lyser op på skallen af mikrobobble, der forbliver intakt under ultralydseksponering.

Real-time intravital multiphoton mikroskopi under ultralyd blev brugt til at undersøge virkningerne af ultralyd og mikrobobler på nanopartikler adfærd i blodet, forbedring af permeabiliteten af tumor blodkar, og forbedring af leveringen af nanopartikler. Omfanget og kinetikken af indtrængning i den ekstracellulære matrix som funktion af akustisk tryk, frekvens og pulslængder kan karakteriseres. Effekten af ultralydsbehandlingen kan variere med hensyn til fartøjernes størrelse og morfologi og deraf følgende indespærring af boblen. Hvordan ultralydsbehandlingen påvirker blodgennemstrømningen og retningen, kan bestemmes. Et eksempelforsøg, der viser ekstravasation af nanopartikler over tid, er vist i figur 9 ved et mekanisk indeks (MI) på 0,826. Resultaterne af intravital multiphotonmikroskopi belyser den rumlige og tidsmæssige ekstravasation af nanopartikler under ultralydseksponering, hvilket er yderst gavnligt for den fuldstændige forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for ultralydmedieret levering af nanopartikler og for at optimere sådanne teknologier26.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af en mikrobobble med en skal af fluorescerende mærkede polymere nanopartikler i denatureret kasein. Mikroboblerne er typisk mellem 1 μm og 10 μm i diameter. Nanopartiklerne har en diameter for det meste mellem 100 nm og 200 nm38. Forkortelse: C3F8 = perfluoropropan gas. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt, der viser de relevante tids- og længdeskalaer for lyse felt, fluorescens, konfokal og intravital mikroskopi.

Figure 3
Figur 3: Skematisk repræsentation af lysfeltmikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentel opsætning, (B) tidsdiagrammet og (C) en typisk indspillet ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer pr. sekund. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Skematisk repræsentation af fluorescensmikroskopiforsøg. (A) Eksperimentel opsætning, (B) tidsdiagrammet og (C) en typisk indspillet ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer pr. sekund. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Skematisk repræsentation af intravitale mikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentel opsætning, (B) tidsdiagrammet og (C) en typisk indspillet ramme. Skalastang i (C) = 50 μm. Grøn svarer til dextran-FITC og rød til nanopartikler. Forkortelse: GaAsP = gallium arsenidfosphid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: 3D-struktur af en enkelt nanopartikler-og-protein-stabiliseret mikrobobble. (A) Brug af konfokal mikroskopi til at vise nanopartiklerne og (B) ved hjælp af et scanningselektronmikroskop til at vise 3D-strukturen. B) er gengivet med tilladelse fra 34. Vægtstang i (A) = 5 μm; skalalinje i (B) = 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Typiske sfæriske svingninger af en 2,89 μm radius nanopartikler-og-protein-stabiliseret mikrobobble insonified ved en ultralydsfrekvens på 1 MHz og en akustisk tryk amplitud på 142 kPa. (A-D) Billeder fra højhastighedsoptagelsen og den tilsvarende bobleradius over tidskurven (nederst). Skalastænger = 5 μm, og den røde linje angiver den oprindelige radius. Belysningsprofilen (vilkårlige enheder) er angivet med gul. Forstørrelsen er 120x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Billedsekvens fra højhastighedsstofstofcensmikroskopi. (A) Vellykket levering af fluorescerende mærkede nanopartikler af en nanopartikler og proteinstabiliseret mikrobobble insoneret ved en ultralydsfrekvens på 2 MHz og en akustisk tryk amplitud på 600 kPa. (B) Mislykket levering af fluorescerende mærkede nanopartikler af en nanopartikler-og-protein-stabiliseret mikrobobble insonified ved en ultralydsfrekvens på 2 MHz og en akustisk tryk amplitud på 210 kPa. Skalastænger = 10 μm. Forstørrelsen er 120x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Intravital mikroskopi efter insonation af nanopartikler-og-protein-stabiliserede mikrobobler ved en ultralydsfrekvens på 1 MHz og en akustisk tryk amplitud på 800 kPa. (A) Nanopartikler i fartøjet, og (B) et billede sekvens af det område, der er angivet af den hvide stiplede firkant i (A) skildrer ekstravasation af dextran (grøn) og nanopartikler (rød). Skalastænger = 50 μm. Forstørrelsen er 20x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Forskellige optiske mikroskopi metoder blev kombineret for at få oplysninger om de forskellige trin i leveringen af nanopartikler fra overfladen af mikrobubbles til det omgivende medium. Imaging af boblen svingninger blev udført, samt billeddannelse af frigivelsen af nanopartikler fra boblen shell, ekstravasation, og penetration gennem den ekstracellulære matrix af tumorer in vivo. In vitro imaging muliggør screening af mange ultralydsparametre sammenlignet med de mere komplekse in vivo-opsætninger . Fordelen ved at kombinere denne vifte af billeddannelsesmetoder er de komplementære oplysninger, der kan fås på forskellige tidshorisonter - en funktion, der er afgørende for at karakterisere og optimere mikroboblerne til vellykket levering og for at opnå terapeutisk effekt. Denne tilgang er nyttig til at forstå leveringsmekanismerne for alle mikrobobler, herunder konstruktioner med fluorescerende mærkede nanopartikler og lægemidler.

De mest kritiske trin i mikroskopi metoder, der anvendes til at studere enkelt mikrobobler er som følger. For fluorescensmikroskopi bør nanopartiklerne fluorescerende mærkes for at muliggøre visualisering af partikelfrigivelsen. Desuden bør prøveopløsningen fortyndes nok til at isolere enkelte mikrobobler til analyse i konfokale, lyse felt- og fluorescensmikroskopimetoder. Derudover er det vigtigt at vælge en ultralydskørselsfrekvens og akustisk tryk for at ophidse boblerne mest effektivt, nemlig ved deres resonans. Hvis forskningsspørgsmålet vedrører levering af nanopartiklernes nyttelast, bør de relevante ultralydsparametre være en del af undersøgelsen. Ved siden af resonans, disse bobler bør også køres på eller ud over deres tærskel for nanopartikler frigivelse, typisk ved relativt højt akustisk tryk amplituder (MI > 0,3)51. For lys-felt mikroskopi billeddannelse, er det afgørende at vælge en højhastigheds-kamera med en tilstrækkelig høj framerate at minimere motion blur og for at undgå aliasing.

Bright-field mikroskopi er hovedsageligt begrænset af billeddannelse framerate og intensiteten af lyskilder til rådighed, som en højere framerate ville give en mere detaljeret tid-løst indsigt i boblen dynamik, men kræver mere intens belysning på grund af kortere eksponeringstider. For at studere partikeludslip mere detaljeret kan rammehastigheden for fluorescensbilleddannelse i princippet øges ved at øge laserlysets intensitet. Men absorptionen af det højintensive laserlys ved fluorescerende mærkede mikrobobler genererer varme, selv med højt kvanteudbyttefarvestoffer. Denne varme kan forstyrre de eksperimenter, der er på spil, og i ekstreme tilfælde fremkalde foto-termisk kavitation52. Således er der i praksis en grænse for den anvendte laser fluence. Men, intens laser belysning kan også bevidst bruges til at fremkalde partikel frigivelse fra liposomer53. Temperatur påvirker boble dynamik og ultralyd respons, afhængigt af boble type54. Hvis in vitro- og intravitale metoder skal sammenlignes objektivt, bør de in vitro-metoder, der er beskrevet i protokollen, derfor udføres ved 37 °C. En anden begrænsning af de in vitro-metoder, der er diskuteret i det aktuelle papir, er, at boblerne ikke er i et frit feltmiljø, da mikrobubbles vil flyde under prøveholdermembranen. Desuden er der et valg bias, når billeddannelse enkelte mikrobobler. Men udførelse af gentagne eksperimenter på enkeltbobler giver mulighed for at undersøge effekten af størrelse og fjernelse af den forvirrende faktor-størrelsesfordelingen. Hvis bobleresponset som en funktion af størrelse kan forstås, mens koncentrationen ikke er for høj til at forhindre boblebobleinteraktioner, kan svaret fra enhver vilkårlig boblepopulation beregnes. Endelig giver både lysfelt- og fluorescensmikroskopimetoder indsigt i mikrobobler, der er indviklet i et todimensionelt (2D) billede. Hvis forskningsspørgsmålet kræver mere end 2D-billeddannelse, kan boblernes 3D-funktionsmåde løses ved at kombinere den opsætning, der er beskrevet i protokollen, med en sideviewopsætning til multiplanbilledbilled55.

En alternativ metode til at studere mikrobubbles er akustisk karakterisering56. Men måling af ekkoet af en enkelt mikrobobble kræver lokalisering og isolering af en enkelt mikrobobble i ultralydsstrålen56, hvilket udgør en udfordring, der typisk tackles ved brug af et smalt rør eller optisk eller akustisk pincet57,58. For at størrelse bobler akustisk, mikrobobler kan insonified i den geometriske spredning regime ved frekvenser meget højere end deres resonans frekvens, som ikke fremkalde volumetrisk microbubble svingninger59. Brugen af et "akustisk kamera" er en sådan metode til at afbilde den radiale dynamik af enkelte mikrobubbles som reaktion på ultralyd, hvori en højfrekvent ultralydsonde bruges til at bestemme boblens radiale respons til en lavfrekvent kørselsbølge60. Ulempen ved denne metode er, at den kun kan bruges til at bestemme den relative ændring af mikrobobbleradius; derfor er der behov for en anden metode til at bestemme den absolutte bobleradius, f.eks. Ulempen ved metoder, hvori mikrobubbles udsættes for ultralyd ved frekvenser højere end deres resonansfrekvens, er, at penetrationsdybden ved så høje frekvenser reduceres59, hvilket begrænser anvendeligheden for in vivo-applikationer. Andre former for mikroskopi kan også anvendes til at studere mikrobobler såsom scanning elektronmikroskopi, atomprøvesprængning mikroskopi, og transmission elektron mikroskopi63. Den opnåelige spatio-temporal opløsning af disse alternative mikroskopi teknikker, dog, er generelt mere begrænset, og disse teknikker har den ulempe, at billeddannelse udføres enten før eller efter ultralyd eksponering ved off-line analyse og typisk præsentere en lav gennemløb63. Et andet alternativ er at bruge en let spredningsmetode, som kan bruges til at studere radial dynamik af enkelte mikrobobler i realtid, men har et lavt signal til støjforhold sammenlignet med akustiske spredningsmetoder64.

Real-time intravital mikroskopi under ultralyd eksponering er en kraftfuld metode til at erhverve ny indsigt i vaskulatur, adfærd mikrobobler, nanopartikler, eller andre molekyler (såsom dextran i dette tilfælde) under ultralyd eksponering. En generel begrænsning, når der udføres intravital mikroskopi i realtid, er, at kun et lille område af vævet er afbildet, og lysets indtrængningsdybde i væv er begrænset. Hvis de afbildede fartøjer indeholder meget få mikrobobler og/eller nanopartikler inden for synsfeltet, kan der kun opnås få eller ingen oplysninger om nanopartiklernes adfærd og ekstravasation. Derudover er en korrekt tilpasning mellem lys- og ultralydsstier afgørende på grund af det begrænsede synsfelt. Hvis ultralydstrykket er højt nok til at fremkalde bobledestruktion, er det også vigtigt at vælge en pulsgentagelsesfrekvens, der gør det muligt for friske bobler at reperfuse ind i synsfeltet mellem ultralydsimpulser. Da ultralyden vil blive reflekteret fra dækglasset i vindueskammeret og målet, er det vigtigt at placere transduceren i en vinkel for at reducere refleksioner for at forhindre dannelsen af stående bølger, som forvrænger det kalibrerede trykfelt. Et andet praktisk problem er, at opsætningen skal have tilstrækkelig plads til at montere ultralydtransducer og waveguide over eller under målet i mikroskopopsætningen. Tumorerne i det dorsale vindue kammer vil have en begrænset tykkelse på grund af begrænsende kammer og dækslet slip; Hvis det er nødvendigt, kan der dog anvendes andre modeller. Eksempler er skinfold tumorer, for eksempel i bryst fedt pad65 eller abdominal intravital billeddannelse af tumorer i de forskellige organer66. Sådanne tumorer kan dyrkes orthotopically i passende mikromiljø, og som sådan, præsentere en mere klinisk relevant tilfælde.

De metoder, der er beskrevet i dette arbejde, oplyser potentialet i fluorescerende mærkede mikrobobler for at studere de grundlæggende elementer i lægemiddelleveringsapplikationer ved hjælp af bobler og ultralyd. Denne kombination af mikroskopi metoder giver værdifuld indsigt i mikrobobble respons på ultralyd insonation og dens tilhørende akustiske parameter plads og præsenterer et klart overblik over mikrobobble og nyttelast adfærd over en relevant række tid og længde skalaer.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 Tabor Electronics Arbitrary waveform generator (programmable)
2100 L ENI Amplifier, used in window chamber setup
2 MDa dextran Sigma-Aldrich
33522 A Agilent Technologies Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup
A1R Nikon Instruments Confocal microscope
ACE I SCHOTT Dimmable AC halogen light source
Atipemazol Orion Pharma Antidote to wake animal
Baytril Bayer Enrofloxacin
BD Neoflon 24 G Becton Dickinson & Company Tail vein catheter
BNC model 575 Berkely Nucleonics Corporation Pulse/delay generator
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Branson Ultrasonic bath
Channel slide Ibidi
CLINIcell 25 Laboratoires Mabio International Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm)
Cohlibri Lightline Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix Oscilloscope
Fentanyl Actavis Group HF Anaesthesia of mouse
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich Supplement for cell culture medium
Fiber-optic hydrophone Precision Acoustics Used for alignment
Flumanezil Fresenius Kabi Antidote to wake animal
Heated animal holder Custom design A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber
Hyper Vision HPV-X2 Shimadzu High-speed camera
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin open source image processing program
In vivo SliceScope Scientifica Multiphoton microscope
Isoflurane Baxter
ISOTON Beckman Coulter Filtered, phosphate-buffered saline solution
LUMPLFLN60XW Olympus Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)
MaiTai DeepSee Spectra-Physics Pulsed laser
MATLAB Mathworks Programming environment
Medetomidine Orion Pharma Anesthesia of mouse
Midazolam Accord Healthcare Limited Anesthesia of mouse
Milli-Q Merck Ultrapure water
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe PerkinElmer Strobe light
Panametrics-NDT C305 Olympus Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1")
Panametrics-NDT V304 Olympus Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25")
Penicillin Sigma-Aldrich Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
Perfluoropropane gas F2 Chemicals
Roswell Park Memorial Institute 1640 Gibco Thermo-Fisher Cell culture medium
Safe-Lock tube Eppendorf
Streptomycin Sigma-Aldrich Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
T 25 basic ULTRA-TURRAX IKA laboratory technology Dispersion tool
TDS 210 Tektronix Oscilloscope, used in window chamber setup
Transducer Precision Acoustics Ltd Used in window chamber setup
U-TLU Olympus Tube lens
VBA100-200 Vectawave Amplifier
Window chambers Custom made Used in window chamber setup
XLUMPLFLN20 XW Olympus 20x water dipping objective
XY(Z) translation stages Thorlabs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, T. L. Diagnostic ultrasound imaging: inside out. , Academic Press. (2004).
  2. Paefgen, V., Doleschel, D., Kiessling, F. Evolution of contrast agents for ultrasound imaging and ultrasound-mediated drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 197 (2015).
  3. Versluis, M., Stride, E., Lajoinie, G., Dollet, B., Segers, T. Ultrasound contrast agents modeling. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (9), 2117-2144 (2020).
  4. Coelho-Filho, O. R., Rickers, C., Kwong, R. Y., Jerosch-Herold, M. MR myocardial perfusion imaging. Radiology. 266 (3), 701-715 (2013).
  5. Pandharipande, P. V., Krinsky, G. A., Rusinek, H., Lee, V. S. Perfusion imaging of the liver: current challenges and future goals. Radiology. 234 (3), 661-673 (2005).
  6. Weidner, N., Carroll, P. R., Flax, J., Blumenfeld, W., Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. The American Journal of Pathology. 143 (2), 401-409 (1993).
  7. Quaia, E. Classification and safety of microbubble-based contrast agents. Contrast Media in Ultrasonography. Medical Radiology (Diagnostic Imaging). Quaia, E. , Springer. Berlin, Heidelberg. 3-14 (2005).
  8. Unger, E. C., Porter, T., Culp, W., Labell, R., Matsunaga, T., Zutshi, R. Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (9), 1291-1314 (2004).
  9. Blomley, M. J. K., Cooke, J. C., Unger, E. C., Monaghan, M. J., Cosgrove, D. O. Microbubble contrast agents: a new era in ultrasound. BMJ. 322 (7296), 1222-1225 (2001).
  10. Faez, T., et al. 20 years of ultrasound contrast agent modeling. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency control. 60 (1), 7-20 (2012).
  11. De Jong, N., Emmer, M., Van Wamel, A., Versluis, M. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Medical & Biological Engineering & Computing. 47 (8), 861-873 (2009).
  12. De Jong, N. Acoustic properties of ultrasound contrast agents. , (1993).
  13. Schneider, M. Characteristics of sonovueTM. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
  14. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  15. Averkiou, M. A., Powers, J., Skyba, D., Bruce, M., Jensen, S. Ultrasound contrast imaging research. Ultrasound Quarterly. 19 (1), 27-37 (2003).
  16. Snipstad, S., et al. Contact-mediated intracellular delivery of hydrophobic drugs from polymeric nanoparticles. Cancer Nanotechnology. 5 (1), 8 (2014).
  17. Epstein, P. S., Plesset, M. S. On the stability of gas bubbles in liquid-gas solutions. The Journal of Chemical Physics. 18 (11), 1505-1509 (1950).
  18. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  19. Deshpande, N., Needles, A., Willmann, J. K. Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Clinical Radiology. 65 (7), 567-581 (2010).
  20. Miller, M. W., Miller, D. L., Brayman, A. A. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Medicine & Biology. 22 (9), 1131-1154 (1996).
  21. Snipstad, S., et al. Sonopermeation to improve drug delivery to tumors: from fundamental understanding to clinical translation. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (12), 1249-1261 (2018).
  22. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  23. May, J. -N., et al. Multimodal and multiscale optical imaging of nanomedicine delivery across the blood-brain barrier upon sonopermeation. Theranostics. 10 (4), 1948-1959 (2020).
  24. Carmen, J. C., et al. Ultrasonic-enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Journal of Infection and Chemotherapy. 10 (4), 193-199 (2004).
  25. Runyan, C. M., et al. Low-frequency ultrasound increases outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa. The Journal of General and Applied Microbiology. 52 (5), 295-301 (2006).
  26. Yemane, P. T., et al. Effect of ultrasound on the vasculature and extravasation of nanoscale particles imaged in real time. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (11), 3028-3041 (2019).
  27. van Wamel, A., et al. Acoustic Cluster Therapy (ACT) enhances the therapeutic efficacy of paclitaxel and Abraxane® for treatment of human prostate adenocarcinoma in mice. Journal of Controlled Release. 236, 15-21 (2016).
  28. Snipstad, S., et al. Ultrasound improves the delivery and therapeutic effect of nanoparticle-stabilized microbubbles in breast cancer xenografts. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  29. Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
  30. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  31. Aslund, A. K. O., et al. Nanoparticle delivery to the brain-By focused ultrasound and self-assembled nanoparticle-stabilized microbubbles. Journal of Controlled Release. 220, 287-294 (2015).
  32. Downs, M. E., Buch, A., Karakatsani, M., Konofagou, E. E., Ferrera, V. P. Blood-brain barrier opening in behaving non-human primates via focused ultrasound with systemically administered microbubbles. Scientific Reports. 5, 15076 (2015).
  33. Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
  34. Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103 (2019).
  35. Lentacker, I., et al. Lipoplex-loaded microbubbles for gene delivery: a Trojan Horse controlled by ultrasound. Advanced Functional Materials. 17 (12), 1910-1916 (2007).
  36. De Temmerman, M., et al. mRNA-Lipoplex loaded microbubble contrast agents for ultrasound-assisted transfection of dendritic cells. Biomaterials. 32 (34), 9128-9135 (2011).
  37. Burke, C. W., Alexander, E., Timbie, K., Kilbanov, A. L., Price, R. J. Ultrasound-activated agents comprised of 5FU-bearing nanoparticles bonded to microbubbles inhibit solid tumor growth and improve survival. Molecular Therapy. 22 (2), 321-328 (2014).
  38. Mørch, Ý, et al. Nanoparticle-stabilized microbubbles for multimodal imaging and drug delivery. Contrast Media & Molecular Imaging. 10 (5), 356-366 (2015).
  39. Jamburidze, A., et al. Nanoparticle-coated microbubbles for combined ultrasound imaging and drug delivery. Langmuir. 35 (31), 10087-10096 (2019).
  40. Snipstad, S., et al. Sonopermeation enhances uptake and therapeutic effect of free and encapsulated cabazitaxel. Ultrasound in Medicine and Biology. , (2021).
  41. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  42. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
  43. Klymchenko, A. S., et al. Highly lipophilic fluorescent dyes in nano-emulsions: towards bright non-leaking nano-droplets. RSC Advances. 2 (31), 11876 (2012).
  44. Aslund, A. K. O., et al. Quantification and qualitative effects of different PEGylations on Poly (butyl cyanoacrylate) Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 14 (8), 2560-2569 (2017).
  45. Born, M., Wolf, E. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge; New York. (1999).
  46. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  47. Hak, S., Reitan, N. K., Haraldseth, O., de Lange Davies, C. Intravital microscopy in window chambers: a unique tool to study tumor angiogenesis and delivery of nanoparticles. Angiogenesis. 13 (2), 113-130 (2010).
  48. Fusser, M., et al. Cabazitaxel-loaded Poly (2-ethylbutyl cyanoacrylate) nanoparticles improve treatment efficacy in a patient derived breast cancer xenograft. Journal of Controlled Release. 293, 183-192 (2019).
  49. Abou-Saleh, R. H., et al. Molecular effects of glycerol on lipid monolayers at the gas-liquid interface: impact on microbubble physical and mechanical properties. Langmuir. 35 (31), 10097-10105 (2019).
  50. Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e55115 (2018).
  51. Luan, Y., et al. Lipid shedding from single oscillating microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (8), 1834-1846 (2014).
  52. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 1-8 (2014).
  53. Mathiyazhakan, M., et al. Non-invasive controlled release from gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes through pulse laser induced microbubble cavitation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 126, 569-574 (2015).
  54. Vos, H. J., Emmer, M., de Jong, N. Oscillation of single microbubbles at room versus body temperature. 2008 IEEE Ultrasonics Symposium. , 982-984 (2008).
  55. Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall-a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
  56. Sijl, J., et al. Acoustic characterization of single ultrasound contrast agent microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (6), 4091-4097 (2008).
  57. Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90 (11), 114103 (2007).
  58. Baresch, D., Garbin, V. Acoustic trapping of microbubbles in complex environments and controlled payload release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15490-15496 (2020).
  59. Maresca, D., et al. Acoustic sizing of an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (10), 1713-1721 (2010).
  60. Renaud, G., Bosch, J. G., vander Steen, A. F. W., de Jong, N. An "acoustical camera" for in vitro characterization of contrast agent microbubble vibrations. Applied Physics Letters. 100 (10), 101911 (2012).
  61. Renaud, G., Bosch, J. G., Van Der Steen, A. F. W., De Jong, N. Low-amplitude non-linear volume vibrations of single microbubbles measured with an "acoustical camera.". Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (6), 1282-1295 (2014).
  62. Luan, Y., et al. Combined optical sizing and acoustical characterization of single freely-floating microbubbles. Applied Physics Letters. 109 (23), (2016).
  63. Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: Fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10 (1), 011501 (2016).
  64. Guan, J., Matula, T. J. Using light scattering to measure the response of individual ultrasound contrast microbubbles subjected to pulsed ultrasound in vitro. The Journal of the Acoustical Society of America. 116 (5), 2832-2842 (2004).
  65. Sofias, A. M., Åslund, A. K. O., Hagen, N., Grendstad, K., Hak, S. Simple and robust intravital microscopy procedures in hybrid TIE2GFP-BALB/c transgenic mice. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 486-493 (2020).
  66. Ritsma, L., Steller, E. J. A., Ellenbroek, S. I. J., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. M., van Rheenen, J. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).

Tags

Bioengineering ultralyd ultralyd kontrast midler lægemiddellevering bright-field mikroskopi fluorescens mikroskopi intravital mikroskopi konfokal mikroskopi
Multi-timescale mikroskopi metoder til karakterisering af fluorescerende-mærket Microbubbles for Ultralyd-udløst Drug Release
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nawijn, C., Segers, T., Lajoinie,… More

Nawijn, C., Segers, T., Lajoinie, G., Mørch, Ý., Berg, S., Snipstad, S., de Lange Davies, C., Versluis, M. Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release. J. Vis. Exp. (172), e62251, doi:10.3791/62251 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter