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Bioengineering

अल्ट्रासाउंड-ट्रिगर ड्रग रिलीज के लिए फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले माइक्रोबबल्स के लक्षण वर्णन के लिए मल्टी-टाइमस्केल माइक्रोस्कोपी विधियां

Published: June 12, 2021 doi: 10.3791/62251
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 4,5,6, 3,6,7, 7, 1
1Physics of Fluids group, Department of Science and Technology, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 2BIOS Lab-on-a-Chip group, Max Planck Center Twente for Complex Fluid Dynamics, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 3Department of Biotechnology and Nanomedicine, SINTEF Industry, 4Department of Circulation and Medical Imaging, Norwegian University of Science and Technology, 5Department of Health Research, SINTEF Digital, 6Cancer Clinic, St. Olav’s Hospital, 7Department of Physics, Norwegian University of Science and Technology

Summary

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग अल्ट्रासाउंड-ट्रिगर किए गए दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले माइक्रोबबल्स की प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें उनके सक्रियण तंत्र के साथ-साथ उनके बायोइफेक्ट भी शामिल हैं। यह पेपर इन विट्रो और इन विवो माइक्रोस्कोपी तकनीकों की एक श्रृंखला को शामिल करता है जो प्रासंगिक लंबाई और टाइमस्केल को कैप्चर करने के लिए किया जाता है।

Abstract

Microbubble कंट्रास्ट एजेंटों अल्ट्रासाउंड के साथ दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए महान वादा पकड़. नैनोकणों में encapsulating दवाओं प्रणालीगत विषाक्तता को कम कर देता है और दवाओं के परिसंचरण समय बढ़ जाती है। माइक्रोबबल-असिस्टेड ड्रग डिलीवरी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण में, नैनोकणों को माइक्रोबबल गोले में या उन पर शामिल किया जाता है, जो अल्ट्रासाउंड के साथ नैनोपार्टिकल पेलोड की स्थानीय और ट्रिगर रिलीज को सक्षम करते हैं। विशाल अल्ट्रासाउंड पैरामीटर अंतरिक्ष के भीतर रिलीज तंत्र की पूरी तरह से समझ कुशल और नियंत्रित रिलीज के लिए महत्वपूर्ण है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का यह सेट एक फ्लोरोसेंट लेबल वाले शेल के साथ माइक्रोबबल्स पर लागू होता है। यहां, फोकस पॉली (2-एथिल-ब्यूटाइल साइनोएक्रिलेट) बहुलक नैनोकणों के साथ लोड किए गए माइक्रोबबल्स पर है, जो एक संशोधित नील लाल डाई के साथ डोप किया गया है। कणों को एक विकृत कैसिइन शेल के भीतर तय किया जाता है। माइक्रोबबल्स को जोरदार सरगर्मी द्वारा उत्पादित किया जाता है, जो केसिन और नैनोकणों वाले तरल चरण में परफ्लोरोप्रोपेन गैस का फैलाव बनाता है, जिसके बाद माइक्रोबबल शेल स्वयं को इकट्ठा करता है। नैनोपार्टिकल रिलीज प्रक्रिया के सभी प्रासंगिक टाइमस्केल पर नैनोपार्टिकल-स्थिर माइक्रोबबल्स को चिह्नित करने के लिए विभिन्न प्रकार की माइक्रोस्कोपी तकनीकों की आवश्यकता होती है। नैनोकणों की प्रतिदीप्ति एकल माइक्रोबबल्स के कॉन्फोकल इमेजिंग को सक्षम बनाती है, जो शेल के भीतर कण वितरण का खुलासा करती है। इन विट्रो अल्ट्रा-हाई-स्पीड इमेजिंग प्रति सेकंड 10 मिलियन फ्रेम पर उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड इनसोनेशन के जवाब में बुलबुला गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। अंत में, बुलबुला खोल से नैनोपार्टिकल रिलीज को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सबसे अच्छी तरह से कल्पना की जाती है, जो प्रति सेकंड 500,000 फ्रेम पर किया जाता है। विवो में दवा वितरण को चिह्नित करने के लिए, वास्कुलचर के भीतर नैनोकणों की ट्रिगर रिलीज और एंडोथेलियल परत से परे उनके एक्सट्रावेशन का अध्ययन पृष्ठीय स्किनफोल्ड विंडो चैंबरों में प्रत्यारोपित ट्यूमर में इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जाता है, कई मिनटों के टाइमस्केल पर। इन पूरक लक्षण वर्णन तकनीकों का संयोजन माइक्रोबबल्स के व्यवहार में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और समय और लंबाई के तराजू की एक सीमा पर उनके पेलोड रिलीज, दोनों इन विट्रो और विवो में।

Introduction

अल्ट्रासाउंड सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली चिकित्सा इमेजिंग तकनीक है। यह गैर-इनवेसिव, तेज, सुरक्षित, लागत प्रभावी और पोर्टेबल 1,2,3 है। हालांकि, रक्त एक खराब अल्ट्रासाउंड प्रकीर्णक है, और रक्त पूल के विपरीत अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों के अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा बढ़ाया जा सकता है3। यह बढ़ाया रक्त-पूल कंट्रास्ट नैदानिक उद्देश्यों के लिए अंग परफ्यूजन के परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, कोरोनरी धमनी रोग 4 और मेटास्टैटिक यकृत रोग 5 का पता लगाने में। दरअसल, ट्यूमर वास्कुलचर एक महत्वपूर्ण भविष्यवाणी कारक साबित हुआ था6. एक प्रमुख शोध प्रयास अब माइक्रोबबल-असिस्टेड, लक्षित आणविक इमेजिंग और चिकित्सीय उपयोग के लिए कंट्रास्ट एजेंटों को सिलाई करने की दिशा में निर्देशित किया जाता है।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों में आमतौर पर लेपित माइक्रोबबल्स 7,8 का निलंबन होता है, जिसमें 1 μm से 10 μm9 तक के व्यास होते हैं। चूंकि अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट माइक्रोबबल्स लाल रक्त कोशिकाओं की तुलना में थोड़ा छोटे होते हैं, इसलिए माइक्रोबबल्स सुरक्षित रूप से रोड़ा 3 बनाने के बिना सबसे छोटी केशिकाओं तक भी पहुंच सकते हैं। Microbubbles एक नाटकीय रूप से वृद्धि हुई अल्ट्रासाउंड backscattering गुणांक ऊतक 10 की तुलना में, उनके संपीड़ित गैस core11 के कारण है. इसके अलावा, microbubble प्रतिध्वनि अत्यधिक nonlinear है, यानी, इसके स्पेक्ट्रम harmonics और ड्राइविंग आवृत्ति के subharmonics शामिल हैं. इसके अलावा, प्रतिध्वनि शक्ति दृढ़ता से bubble12 की अनुनादी प्रतिक्रिया पर निर्भर है। जबकि ऊतक केवल रैखिक रूप से बिखरता है, माइक्रोबबल्स की एक छोटी संख्या हार्मोनिक इमेजिंग 13,14 में एक उच्च पहचान संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। यह nonlinear विपरीत पीढ़ी भी body15 में एकल बुलबुले को ट्रैक करने के लिए पर्याप्त मजबूत हो सकता है।

अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट का खोल विघटन और सम्मिलन के खिलाफ बुलबुले को स्थिर करता है, जिससे रक्त पूल 16 में उनके परिसंचरण समय में वृद्धि होती है। खोल में लिपिड, पॉलिमर, या विकृत प्रोटीन 3,8 शामिल हो सकते हैं। यह इंटरफेसियल तनाव को कम करता है, जिससे लाप्लास दबाव-संचालित विघटन 17 के प्रभाव को सीमित किया जाता है और गैस प्रसार 18 के खिलाफ एक प्रतिरोधी बाधा पैदा होती है। स्थिरता को और बढ़ाने के लिए, इसके विपरीत माइक्रोबबल्स आमतौर पर रक्त 11 में कम घुलनशीलता के साथ एक उच्च आणविक वजन गैस से भरे होते हैं। माइक्रोबबल शेल नाटकीय रूप से अल्ट्रासाउंड insonation11 के लिए microbubbles की प्रतिक्रिया को बदलदेता है। Uncoated गैस बुलबुले एक विशेषता अनुनाद आवृत्ति है कि उनके आकार के व्युत्क्रमानुपाती है और एक लिपिड कोटिंग के अलावा एक uncoated buble के संबंध में अनुनाद आवृत्ति बढ़ जाती है के संबंध में खोल 3 की आंतरिक कठोरता के कारण. इसके अलावा, खोल फैलाव चिपचिपाहट के माध्यम से ऊर्जा को नष्ट करता है, जो लेपित बुलबुले 3 के लिए भिगोने के प्रमुख स्रोत का गठन करता है। स्थिर करने वाले खोल का अतिरिक्त लाभ है कि इसे कार्यात्मक बनाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, माइक्रोबबल्स की सतह पर लक्षित लिगेंड को बाध्य करके। यह लक्ष्यीकरण इन बुलबुले के लिए कई अनुप्रयोगों को सक्षम बनाता है और विशेष रूप से, अल्ट्रासाउंड 14,19 के साथ आणविक इमेजिंग।

Microbubble कंट्रास्ट एजेंटों अल्ट्रासाउंड के साथ दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए महान वादा पकड़. माइक्रोबबल्स एक रक्त वाहिका के कारावास में दोलन माइक्रोस्ट्रीमिंग के साथ-साथ केशिका दीवार 3 पर स्थानीय सामान्य और कतरनी तनाव का कारण बन सकते हैं। उच्च ध्वनिक दबाव पर, बड़े आयाम दोलनों से एक हिंसक प्रक्रिया में माइक्रोबबल पतन हो सकता है जिसे जड़त्वीय cavitation कहा जाता है, जो बदले में, रक्त वाहिकाओं के टूटने या invagination का कारण बन सकता है20। ये हिंसक घटनाएं बायोइफेक्ट्स को प्रेरित कर सकती हैं जैसे कि सोनोपर्मेशन 21, एंडोथेलियल दीवार के पार इंटरस्टिटियम में चिकित्सीय दवाओं के बहिष्करण को बढ़ाना, या तो पैरासेल्युलर रूप से या ट्रांससेलुलर रूप से। यह स्ट्रोमा-समृद्ध ट्यूमर 21,22 और बायोफिल्म्स 23,24 के एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के माध्यम से चिकित्सीय एजेंटों के प्रवेश में भी सुधार कर सकता है, हालांकि यह तंत्र अभी भी खराब रूप से समझा जाता है26।

अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता दवा वितरण ने प्रीक्लिनिकल रूप से 27,28 और नैदानिक परीक्षणों में दोनों आशाजनक परिणाम दिखाए हैं22। इसके अलावा, जब अपेक्षाकृत कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (~ 1 मेगाहर्ट्ज) के साथ उपयोग किया जाता है, तो माइक्रोबबल्स को स्थानीय रूप से और क्षणिक रूप से रक्त-मस्तिष्क बाधा पारगम्यता को बढ़ाने की सूचना दी गई है, जिससे दवाओं को मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रवेश करने में सक्षम बनाया गया है, दोनों प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययनों में 29,30,31,32,33,34।

अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता दवा वितरण के लिए आम तौर पर दो दृष्टिकोण होते हैं: चिकित्सीय सामग्री को बुलबुले के साथ सह-प्रशासित किया जा सकता है, या इसे बुलबुले शेल 28,35,36 से जोड़ा या लोड किया जा सकता है। दूसरा दृष्टिकोण दवा वितरण के मामले में अधिक कुशल होने के लिए दिखाया गया है37। Microbubbles दवाओं या आनुवांशिक सामग्री नैनोकणों (liposomes या बहुलक nanoconstructs) खोल से जुड़े या सीधे microbubble shell35,36 में शामिल में encapsulated सामग्री के साथ लोड किया जा सकता है। Nanoparticle-लोडेड microbubbles (केंद्रित) अल्ट्रासाउंड द्वारा सक्रिय किया जा सकता है स्थानीय रूप से nanoparticle पेलोड 28,33,38,39,40 जारी करने के लिए। यदि इस तरह के माइक्रोबबल एक सेल के साथ सीधे संपर्क में है, तो यह विट्रो में दिखाया गया है कि पेलोड को सोनोप्रिंटिंग 34,35 नामक प्रक्रिया में सेल साइटोप्लाज्मिक झिल्ली पर भी जमा किया जा सकता है।

माइक्रोबबल इनसोनेशन के लिए अल्ट्रासाउंड पैरामीटर स्पेस व्यापक है, और इन विवो जैविक स्थितियां आगे जटिलता जोड़ती हैं। इस प्रकार, केंद्रित अल्ट्रासाउंड और नैनोपार्टिकल-लोडेड माइक्रोबबल्स का संयोजन लक्षित चिकित्सीय के क्षेत्र में एक चुनौती है।

इस काम का उद्देश्य प्रोटोकॉल प्रदान करना है जिसका उपयोग अल्ट्रासाउंड पैरामीटर के एक समारोह के रूप में माइक्रोबबल्स की प्रतिक्रिया को चित्रित करने के लिए किया जा सकता है, और शेल टूटने और फ्लोरोसेंटली-लेबल वाली शेल सामग्री की बाद की रिहाई के लिए अग्रणी तंत्र का अध्ययन करना है। प्रोटोकॉल का यह सेट गोले के साथ माइक्रोबबल्स पर लागू होता है जिसमें फ्लोरोसेंट डाई होती है। चित्रा 1 SINTEF (Trondheim, नॉर्वे) में विकसित बहुलक-nanoparticle-और-प्रोटीन-स्थिर microbubbles का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है। ये बुलबुले perfluoropropane गैस (C3F8) से भरे हुए हैं और खोल को स्थिर करने वाले नैनोकणों में NR668 होता है, जो नील लाल फ्लोरोसेंट डाई 38,43 का एक लिपोफिलिक व्युत्पन्न है। नैनोकणों में पॉली (2-एथिल-ब्यूटाइल साइनोएक्रिलेट) (पीईबीसीए) शामिल हैं और पीईजीलेटेड हैं। Polyethylene glycol (PEG) के साथ functionalization मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट प्रणाली द्वारा opsonization और फागोसाइटोसिस को कम करता है, जिससे परिसंचरण समय 14,44 का विस्तार होता है। नतीजतन, पीईजिलेशन लक्ष्य स्थल तक पहुंचने वाले नैनोकणों की मात्रा को बढ़ाता है, जिससे उपचार की प्रभावकारिता में सुधार होता है16। चित्रा 2 दिखाता है कि कैसे चार माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग शोधकर्ताओं को सभी प्रासंगिक समय और लंबाई के तराजू को कवर करने की अनुमति देता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में प्राप्त होने वाले स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को विवर्तन सीमा द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो उद्देश्य के प्रकाश और संख्यात्मक एपर्चर (एनए) की तरंग दैर्ध्य और वस्तु रोशनी स्रोत 45 पर निर्भर करता है। हाथ में सिस्टम के लिए, ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन सीमा आमतौर पर 200 एनएम होती है। इसके अतिरिक्त, intravital माइक्रोस्कोपी उपकोशिकीय स्तर 46 पर छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस काम में उपयोग किए जाने वाले नैनोपार्टिकल-और-प्रोटीन-स्थिर माइक्रोबबल्स के लिए, इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रासंगिक न्यूनतम लंबाई का पैमाना छोटी केशिकाओं (≥10 μm) का आकार है। इन विट्रो हाई-स्पीड ऑप्टिकल इमेजिंग (प्रति सेकंड 10 मिलियन फ्रेम) और उच्च गति प्रतिदीप्ति इमेजिंग (500,000 फ्रेम प्रति सेकंड) प्रयोगों को एकल माइक्रोबबल्स के लिए वर्णित किया गया है। नैनोसेकंड टाइमस्केल पर उच्च गति उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग हिल बुलबुले के समय-हल रेडियल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। इसके विपरीत, उच्च गति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले नैनोकणों की रिहाई के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, माइक्रोबबल शेल की संरचना की जांच जेड-स्टैक तीन-आयामी (3 डी) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की जा सकती है, और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उत्तरार्द्ध के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान काम में शामिल नहीं है)। Intravital माइक्रोस्कोपी में स्थानीय रक्त प्रवाह पर वास्तविक समय की जानकारी प्रदान करने के लिए पृष्ठीय खिड़की कक्षों में बढ़ रहे ट्यूमर की छवि के लिए मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना और vivo47 में फ्लोरोसेंटली-लेबल नैनोकणों के भाग्य पर शामिल है। इन माइक्रोस्कोपी विधियों का संयोजन अंततः अल्ट्रासाउंड के जवाब में चिकित्सीय माइक्रोबबल एजेंटों के व्यवहार में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, दोनों इन विट्रो और विवो में।

Protocol

नोट: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं नॉर्वेजियन पशु अनुसंधान अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किए गए थे। प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।

1. microbubbles का उत्पादन

नोट: इस काम में, ब्याज के microbubbles प्रोटीन-और-nanoparticle-स्थिर microbubbles हैं, जिसके लिए उत्पादन प्रोटोकॉल पहले 28,33,48 वर्णित किया गया है। इसलिए, निर्माण प्रोटोकॉल को संक्षेप में यहां संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

  1. सबसे पहले, एक पिपेट का उपयोग करते हुए, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में कैसिइन के 0.5 wt% के साथ अल्ट्राप्योर पानी मिलाएं और फ्लोरोसेंट डाई के 0.21 wt% के साथ लेबल किए गए नैनोकणों के 1 wt% के साथ लेबल किया गया, NR668 (संशोधित नील लाल), एक बाँझ ग्लास क्रिम्प टॉप शीशी (10 एमएल, 2 सेमी का व्यास) में। बहुलक नैनोकणों मिनी इमल्शन पोलीमराइजेशन विधि का उपयोग करके तैयार किए जाते हैं जैसा कि मोर्च एट अल द्वारा वर्णित है। ३८ ।
    नोट: यहाँ, डाई nanoparticle रिलीज के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए एक मॉडल दवा के रूप में कार्य करता है। नैनोपार्टिकल समाधान के साथ काम करते समय, एक प्रयोगशाला कोट, चश्मे और दस्ताने पहनें। 100% एसीटोन के साथ नैनोपार्टिकल समाधान के किसी भी फैल को तुरंत पोंछें।
  2. रबर टोपी के साथ शीशी कैप, थोड़ा मिश्रण, और संभव समुच्चय को खत्म करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में शीशी जगह। कांच की शीशी के नीचे से हलचल ~ 0.5 सेमी की नोक के साथ एक फैलाव उपकरण रखें। गैस कंटेनर से जुड़े एक ग्लास पिपेट का उपयोग करते हुए, समाधान युक्त शीशी के सिर के स्थान पर परफ्लोरोप्रोपेन गैस जोड़ें जब तक कि समाधान थोड़ा बुदबुदाने न शुरू हो जाए।
    नोट: सरगर्मी के दौरान कांच की शीशी के फिसलने को रोकने के लिए फैलाव उपकरण के आधार के चारों ओर स्व-सीलिंग फिल्म लपेटें।
  3. फैलाव उपकरण का उपयोग करके 4 मिनट के लिए 1935 × जी (3 मिमी के रोटेशन की त्रिज्या के साथ 24,000 आरपीएम) पर समाधान को जोरदार ढंग से हिलाएं। रबर कैप के साथ शीशी को बंद करें, और आगे के उपयोग के लिए शीशी को सील करें।
    नोट: सरगर्मी तरल में गैस को फंसाती है। माइक्रोबबल-शेल बाद में किसी भी सक्रिय चरण की आवश्यकता के बिना स्वयं को इकट्ठा करता है।
  4. अतिरिक्त केसीन और नैनोपार्टिकल समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और 100% एसीटोन के साथ फैलाव उपकरण को साफ करें।

2. इमेजिंग एकल बुलबुले

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
    1. नमूना तैयारी
      1. इस प्रकार के रूप में छवि एकल microbubbles करने के लिए बुलबुला समाधान पतला। एक वेंटिंग सुई (19 जी -21 जी) को एक ग्लास क्रिम्प टॉप शीशी में रखें जिसमें अनुभाग 1 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करके उत्पादित माइक्रोबबल्स होते हैं। शीशी की सील से दूर जाने के लिए बड़े बुलबुले की अनुमति देने के लिए शीशी को उल्टा करें।
      2. शीशी में एक छोटे (~ 1 एमएल) सिरिंज की एक और सुई टिप (19 जी) डालें, जबकि शीशी अभी भी उल्टा है। बुलबुला निलंबन की एक छोटी राशि निकालें, और अगले चरण में आसान pipetting के लिए एक छोटी ट्यूब में सिरिंज की सामग्री स्थानांतरित करें।
        नोट:: सीधे निकालने के लिए निलंबन की मात्रा प्रकार और बबल निलंबन की एकाग्रता पर निर्भर करता है। इस मामले में, 0.2 मिलीलीटर निकाला गया था।
      3. एक पिपेट का उपयोग करके, फ़िल्टर किए गए पीबीएस में माइक्रोबबल सस्पेंशन (अनुभाग 1 से) को पतला करें ताकि सिंगल-बबल इमेजिंग को सक्षम करने के लिए लगभग 2 × 105 से 6 × 105 माइक्रोबबल्स / एमएल की एकाग्रता प्राप्त की जा सके।
        नोट: बुलबुला प्रकार के आधार पर, यह मुक्त फ्लोरोसेंट डाई को हटाने के लिए बुलबुला निलंबन धोने के लिए सिफारिश की है। यह बुलबुले के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जिसके लिए फ्लोरोसेंट डाई को खोल में संक्रमित किया जाता है। बुलबुले को धोने के लिए, बुलबुला निलंबन को पतला करें (उदाहरण के लिए, पीबीएस के 10 मिलीलीटर में बबल समाधान के 100 μL लेकर), और इसे सेंट्रीफ्यूज करें (आमतौर पर 100 × जी के क्रम की गति पर)। अंत में, आगे के विश्लेषण के लिए एक पिपेट के साथ microbubbles युक्त supernatant निकालें। शेष समाधान में मुक्त फ्लोरोसेंट कण होते हैं और इसे छोड़ दिया जा सकता है। धोने के कदम को आवश्यकतानुसार दोहराया जाना चाहिए।
      4. माध्यम की चिपचिपाहट को बढ़ाने के लिए मिश्रण में ग्लिसरॉल जोड़ें और ब्राउनियन गति से प्रेरित आंदोलन को खत्म करें जो अन्यथा धीमी गति से कॉन्फोकल जेड-स्टैक इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा।
        नोट: ग्लिसरॉल की मात्रा बुलबुले के प्रकार पर निर्भर करती है जो चित्रित किया गया है (यहां, ~ 50%)। कुछ प्रकार के बुलबुले के लिए, ग्लिसरॉल का स्थिरता 49 पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। हालांकि, कॉन्फोकल इमेजिंग के तहत लगभग 30 मिनट से अधिक बुलबुले में कोई ध्यान देने योग्य परिवर्तन नहीं देखा गया था। इसके अलावा, ग्लिसरॉल माइक्रोबबल्स की ध्वनिक प्रतिक्रिया को बदल सकता है और इसलिए इसका उपयोग केवल इमेजिंग विधियों के साथ किया जा सकता है जहां माइक्रोबबल्स को इनसोनिफाइड नहीं किया जाता है।
      5. इस तरह के एक चैनल स्लाइड के रूप में इष्टतम इमेजिंग के लिए पतली दीवारों के साथ एक कक्ष में microbubble निलंबन जगह.
    2. इमेजिंग प्रोटोकॉल
      1. confocal माइक्रोस्कोप पर स्विच करें, और confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त उद्देश्य और वांछित लेजर और स्कैनर का चयन करें।
        नोट: यहाँ, 0.08 μm / पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन के लिए एक 60x पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें और बुलबुला आकार के आधार पर, 256 x 256 पिक्सेल या 128 x 128 पिक्सेल के एक क्षेत्र की छवि। इन विशिष्ट प्रयोगों में, एक 488 एनएम लेजर और एक गैल्वानो स्कैनर का उपयोग करें। उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य फ्लोरोसेंट डाई पर निर्भर करता है और आमतौर पर ब्रॉडबैंड होता है।
      2. उज्ज्वल क्षेत्र में एक microbubble खोजें, और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए स्विच करें। वांछित शीर्ष और नीचे के विमानों को बीच में सेट करें, जिसके बीच कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप स्कैन करेगा। 3 डी संरचना का निरीक्षण करने के लिए एक जेड-स्टैक प्राप्त करें; Z-दिशा में 100 nm के चरण आकार का उपयोग करें।
  2. ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी
    1. ऑप्टिकल सिस्टम की असेंबली
      नोट:: उज्ज्वल-फ़ील्ड माइक्रोस्कोपी सेटअप का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 3A में दिखाया गया है। अबाधित अल्ट्रासाउंड प्रसार सुनिश्चित करने के लिए, पानी के स्नान में दो उद्घाटन होते हैं: एक प्रकाश स्रोत के लिए और एक अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के लिए। ऑप्टिकल सिस्टम में एक (मॉड्यूलर) माइक्रोस्कोप, एक उच्च गति कैमरा और मिलान प्रकाशिकी शामिल हैं। चूंकि माइक्रोबबल दोलनों की अवधि आमतौर पर 1 μs (1 मेगाहर्ट्ज अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके) के क्रम की होती है, इसलिए कैमरे को प्रति सेकंड कम से कम 5 मिलियन फ्रेम के फ्रेमरेट पर रिकॉर्ड करने के लिए सेट किया जाना चाहिए। यहां, कैमरा को 256 फ्रेम (25.6 μs) के लिए 10 मिलियन फ्रेम प्रति सेकंड (256 x 400 पिक्सेल) पर रिकॉर्ड करने के लिए सेट किया जाना है ताकि उच्च हार्मोनिक्स सहित बुलबुला गतिशीलता के सभी विवरणों पर कब्जा किया जा सके।
      1. माइक्रोस्कोप के लिए एक उपयुक्त आवर्धन, काम की दूरी, और एनए के साथ एक जल-विसर्जन उद्देश्य संलग्न करें।
        नोट: पानी के क्रमिक वाष्पीकरण के बावजूद एक स्थिर काम की दूरी प्रदान करने के लिए एक जल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया गया था। यहां, 60x के आवर्धन के साथ एक जल-विसर्जन उद्देश्य, 2 मिमी की काम करने की दूरी, और 1 का एनए चुना गया था।
      2. रोशनी के लिए कम से कम 1 किलोवाट के पीक पावर आउटपुट के साथ एक स्ट्रोब लाइट का उपयोग करें और माइक्रोस्कोप और कैमरे के बीच एक ट्यूब लेंस यह सुनिश्चित करने के लिए कि जितना संभव हो उतना कम परिवेश प्रकाश उच्च गति वाले कैमरे के सेंसर तक पहुंचता है।
      3. एकल microbubbles और वास्तविक समय इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल और ध्वनिक प्रणाली के संरेखण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक dimmable हलोजन प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
    2. ध्वनिक प्रणाली की असेंबली
      1. एक प्रोग्राम करने योग्य मनमाना तरंग जनरेटर और एक शक्ति एम्पलीफायर (56 डीबी लाभ) का उपयोग करें एक चिकनी आवरण और तरंग के साथ ट्रांसड्यूसर ड्राइव करने के लिए। संकेत की जांच करने के लिए मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर के लिए एक oscilloscope कनेक्ट करें। आने वाले ध्वनिक दबाव तरंग को प्रोग्राम करने के लिए मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर के लिए एक व्यक्तिगत कंप्यूटर कनेक्ट करें, घर में लिखी गई स्क्रिप्ट का उपयोग करके।
      2. ऑप्टिकल और ध्वनिक प्रणालियों को सिंक्रनाइज़ करने के लिए मास्टर ट्रिगर के रूप में एक पल्स / देरी जनरेटर का उपयोग करें। पल्स / देरी जनरेटर और कैमरा सॉफ्टवेयर पर ट्रिगर देरी सेट करें जैसे कि अल्ट्रासाउंड तरंग को बुलबुले तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए अल्ट्रासाउंड ट्रांसमिशन के बाद रिकॉर्डिंग 16 μs शुरू होती है। बुलबुला दोलनों के दौरान उचित रोशनी सुनिश्चित करने के लिए रिकॉर्डिंग की शुरुआत से पहले प्रकाश स्रोत 1.5 μs को ट्रिगर करें (समय आरेख के लिए चित्रा 3 B देखें)।
      3. एक उपयुक्त केंद्र आवृत्ति के साथ एक उपयुक्त ट्रांसड्यूसर चुनें। इसे पानी के स्नान के उद्घाटन में रखें, ताकि यह नमूना धारक झिल्ली से प्रतिबिंब को कम करने और खड़े तरंग गठन को कम करने के लिए ऑप्टिकल अक्ष के संबंध में एक कोण पर हो।
        नोट: यहां, 2.25 मेगाहर्ट्ज की केंद्र आवृत्ति के साथ एक एकल-तत्व केंद्रित विसर्जन ट्रांसड्यूसर, 1 की फोकल दूरी और 0.75 के तत्व व्यास को ऑप्टिकल अक्ष के संबंध में 35 डिग्री के कोण पर रखा गया था। स्थानांतरण फ़ंक्शन के अंशांकन को उसी एम्पलीफायर का उपयोग करके निष्पादित करने की आवश्यकता होती है जो ध्वनिक प्रणाली में उपयोग किया जाता है। अल्ट्रासाउंड संचारित आवृत्ति के एक समारोह के रूप में एक फाइबर ऑप्टिक हाइड्रोफोन का उपयोग कर ट्रांसड्यूसर के दबाव आयाम के लिए वोल्टेज आयाम से स्थानांतरण समारोह कैलिब्रेट करें।
    3. नमूना धारक का चयन करना
      1. ऑप्टिकल और ध्वनिक रूप से पारदर्शी झिल्ली के साथ एक नमूना धारक का उपयोग करें और एक मात्रा जो एक ही नमूने के भीतर कई एकल माइक्रोबबल्स की इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त बड़ी है।
        नोट: यहां, 10 मिलीलीटर की मात्रा के साथ एक सेल संस्कृति कैसेट, 25 सेमी 2 के झिल्ली क्षेत्रों और 175 μm की झिल्ली मोटाई का उपयोग किया गया था। निचली झिल्ली पर ध्वनिक प्रतिबिंब, और माइक्रोस्कोप उद्देश्य और ऊपरी झिल्ली द्वारा परिलक्षित तरंगों से हस्तक्षेप के कारण, इन सीटू ध्वनिक दबाव मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर पर क्रमादेशित से भिन्न हो सकता है। नमूना धारक झिल्ली के संबंध में ट्रांसड्यूसर को एक कोण पर रखने से खड़ी तरंग गठन कम हो जाता है, लेकिन झिल्ली से प्रतिबिंब बढ़ सकता है।
      2. सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से जलमग्न किया जा सकता है और ट्रांसड्यूसर और माइक्रोस्कोप उद्देश्य दोनों के फोकस के भीतर लाया जा सकता है। नमूना धारक को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए एक 3 डी माइक्रोपोजिशनिंग चरण से जुड़े एल्यूमीनियम समर्थन का उपयोग करें।
    4. ऑप्टिकल और ध्वनिक प्रणालियों का संरेखण
      1. सेटअप को संरेखित करने के लिए 3 डी अनुवाद के लिए, पानी के स्नान को XY-अनुवाद चरण में संलग्न करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए मंच को ऑप्टिकल टेबल से संलग्न करें कि यह प्रयोगों के दौरान स्थानांतरित नहीं होता है। फिर, पानी के स्नान को पानी से भरें, और मंद हलोजन प्रकाश स्रोत पर स्विच करें। संरेखण के दौरान, अल्ट्रासाउंड प्रतिबिंबों को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य को पक्ष में ले जाएं।
      2. नमूना धारक हाथ के लिए एक सुई हाइड्रोफोन (0.2 मिमी) संलग्न करें, और उद्देश्य के दृश्य के क्षेत्र में टिप के साथ, पानी के स्नान में सुई हाइड्रोफोन रखें। एम्पलीफायर और मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर चालू करें; 5 से 10 अल्ट्रासाउंड चक्रों की एकल दालों और 15 हर्ट्ज की नाड़ी पुनरावृत्ति आवृत्ति का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि हाइड्रोफोन टिप केंद्रित है और माइक्रोस्कोप छवि पर ध्यान केंद्रित करता है। XY-दिशा में टैंक और सुई को Z-दिशा में तब तक ले जाएँ जब तक कि अधिकतम दबाव आयाम तक नहीं पहुंच जाता है।
      3. हाइड्रोफोन की नोक पर पुन: ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप के फोकस को समायोजित करें।
        नोट:: यह प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोप फ़ोकस और ट्रांसड्यूसर फ़ोकस के बीच संरेखण सुनिश्चित करता है। संरेखण के बाद माइक्रोस्कोप और ट्रांसड्यूसर की स्थिति को न बदलें।
    5. नमूना तैयारी
      1. नमूना समाधान तैयार करने के लिए चरण 2.1.1.1 से 2.1.1.3 तक दोहराएँ। एकल-बुलबुला इमेजिंग को सक्षम करने और पड़ोसी बुलबुले के ध्वनिक इंटरैक्शन को बाहर निकालने के लिए बुलबुला समाधान को पतला करें।
      2. नमूना धारक का आउटलेट खोलें। एक सिरिंज का उपयोग करते हुए, नमूना समाधान को नमूना धारक के अन्य उद्घाटन में इंजेक्ट करें जब तक कि यह पूरी तरह से भर न जाए। सुनिश्चित करें कि अल्ट्रासाउंड क्षेत्र के साथ अवांछित बातचीत को रोकने के लिए नमूना धारक के अंदर कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
      3. नमूना धारक के दोनों वाल्व बंद करें, और नमूना धारक को ऑप्टिकल अक्ष पर लंबवत रखें।
        नोट:: ले जाने के दौरान नमूना धारक के एक तरफ बुलबुले के स्थानांतरण को रोकने के लिए भरा हुआ नमूना धारक स्तर रखें।
    6. इमेजिंग प्रोटोकॉल
      1. कार्यक्रम वांछित अल्ट्रासाउंड ड्राइविंग आवृत्ति और ध्वनिक दबाव मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर में उपर्युक्त इन-हाउस लिखित स्क्रिप्ट के माध्यम से।
        नोट: यहां, ध्वनिक दबाव तरंग 40 चक्रों का एक विस्फोट था, जिसमें 8-चक्र गाऊसी-पतला नाड़ी थी। इन प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली अल्ट्रासाउंड आवृत्तियां 1 मेगाहर्ट्ज, 2 मेगाहर्ट्ज, या 3 मेगाहर्ट्ज थीं, जिसमें ध्वनिक दबाव आयाम 81 केपीए से 1200 केपीए तक थे।
      2. माइक्रोस्कोप के फ़ोकस में एकल microbubbles का पता लगाने के लिए XYZ-चरण का उपयोग करके नमूना समाधान वाले नमूना धारक को ले जाएँ। नमूना धारक के एक कोने में दृश्य के एक क्षेत्र के साथ शुरू करें, और सुनिश्चित करें कि microbubbles के किनारे स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और ध्यान में है (एक आदर्श कैमरा दृश्य के लिए चित्रा 3 C देखें)।
      3. एक ऑप्टिकल फाइबर के अंत को संलग्न करें जो पहले हैलोजन प्रकाश से एक स्ट्रोब प्रकाश से जुड़ा हुआ था, ताकि दूसरा छोर अभी भी पानी के स्नान से जुड़ा हो। रिकॉर्डिंग ट्रिगर करें.
      4. 2.2.6.2 के माध्यम से 2.2.6.3 के माध्यम से 2.2.6.3 के माध्यम से कई बार दोहराएं, पिछले स्थान से कम से कम 2 मिमी (फोकल प्लेन में) माइक्रोबबल्स वाले सेल कल्चर कैसेट को स्थानांतरित करना ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दृश्य के क्षेत्र में माइक्रोबबल्स पिछले प्रयोगों में इनसोनिफाइड नहीं हैं।
        नोट: यहाँ, प्रत्येक प्रयोग ~ 20 बार दोहराया गया था। जब पूरे नमूना धारक insonified है, नमूना धारक खाली है, और बाद के प्रयोगों के लिए ताजा नमूना समाधान के साथ इसे फिर से भरना।
    7. डेटा विश्लेषण
      1. अनुसंधान प्रश्न के अनुसार डेटा विश्लेषण करने के लिए एक प्रोग्रामिंग वातावरण को अपनाएं, और छवियों को संसाधित करने के बाद किनारे का पता लगाने का प्रदर्शन करें। एक फ़ंक्शन का उपयोग करना जो छवि क्षेत्रों के गुणों को मापता है, बुलबुले के समोच्च का पता लगाने के लिए एक बुलबुले के केंद्रक और प्रत्येक बुलबुले के चारों ओर तीव्रता प्रोफ़ाइल के व्युत्पन्न को ढूंढें (और इस प्रकार, बुलबुला त्रिज्या आर)। एकल microbubbles के लिए समय के साथ त्रिज्या से प्रासंगिक पैरामीटर निकालें।
        नोट:: वर्तमान अध्ययन में, एक प्रोग्रामिंग वातावरण का उपयोग छवि प्रसंस्करण के लिए एकल माइक्रोबबल्स की रिकॉर्डिंग को बायनाराइज़ और फ़िल्टर करने के लिए किया गया था। प्रत्येक बुलबुले के चारों ओर तीव्रता प्रोफ़ाइल के व्युत्पन्न को खोजने के लिए एक इन-हाउस स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था।
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
    1. ऑप्टिकल सिस्टम की असेंबली
      1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4A) के लिए सेटअप का निर्माण करें, अनुभाग 2.2 में वर्णित उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में उपयोग किए जाने वाले एक ही आधार के साथ।
        नोट:: अनुभाग 2.3 में वर्णित सेटअप को अनुभाग 2.2 में ब्राइट-फ़ील्ड माइक्रोस्कोपी के लिए वर्णित के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी दोनों का संयोजन नैनोपार्टिकल रिलीज इमेजिंग करते समय माइक्रोबबल गैस कोर के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।
      2. 128 फ्रेम (256 μs) के लिए 500,000 फ्रेम प्रति सेकंड (400 x 250 पिक्सेल) पर रिकॉर्ड करने के लिए उच्च गति कैमरा सेट करें।
        नोट:: इमेजिंग समय उज्ज्वल-क्षेत्र प्रयोगों की तुलना में अधिक है क्योंकि प्रकाश तीव्रता प्रतिदीप्ति में सीमित है, और क्योंकि जिस पर कण वितरण होता है, वह समय सीमा पर बुलबुला गतिशीलता की तुलना में अधिक लंबा होता है।
      3. पर्याप्त प्रकाश की आपूर्ति करने के लिए पर्याप्त शक्ति के साथ एक लेजर का चयन करें और जिसमें एक उपयुक्त उत्तेजना तरंग दैर्ध्य है, और यह सुनिश्चित करें कि यह नमूने को ब्लीच करने से बचने के लिए एक एकोस्टो-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर के साथ युग्मित है।
        नोट: इस अध्ययन में, नैनोकणों के प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करने के लिए 532 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक 5 डब्ल्यू निरंतर तरंग लेजर का उपयोग किया गया था।
      4. लेजर और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के बीच एक बीम विभाजक, डिक्रोइक दर्पण और पायदान फ़िल्टर रखें ताकि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को कैमरे तक पहुंचने की अनुमति देते हुए नमूने की ओर उत्तेजना प्रकाश को निर्देशित किया जा सके।
    2. ध्वनिक प्रणाली की असेंबली
      1. Microbubbles insonify करने के लिए, अनुभाग 2.2.2 में के रूप में एक ही ध्वनिक सेटअप का उपयोग करें। इन विशिष्ट प्रयोगों में ट्रांसड्यूसर को एक एकल-तत्व में बदलें, 2.25 मेगाहर्ट्ज की केंद्र आवृत्ति के साथ केंद्रित विसर्जन ट्रांसड्यूसर, 1.88 की फोकल दूरी ", और 1" के तत्व व्यास। नमूना धारक झिल्ली से प्रतिबिंब को कम करने और स्थायी तरंग संरचनाओं को कम करने के लिए ऑप्टिकल अक्ष के संबंध में इसे 35 डिग्री के कोण पर रखें।
    3. ऑप्टिकल और ध्वनिक प्रणालियों का संरेखण
      1. अनुभाग 2.2.4 में वर्णित चरणों को दोहराएँ।
    4. नमूना तैयारी
      1. अनुभाग 2.2.5 में वर्णित के रूप में नमूना समाधान तैयार करें।
    5. इमेजिंग प्रोटोकॉल
      1. aforementioned इन-हाउस लिखित स्क्रिप्ट के माध्यम से मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर पर वांछित अल्ट्रासाउंड ड्राइविंग आवृत्ति और ध्वनिक दबाव आयाम सेट करें।
        नोट: यहां, ध्वनिक दबाव तरंग को 140 चक्रों के अल्ट्रासाउंड का एक विस्फोट होने के लिए क्रमादेशित किया गया था, जिसमें 10-चक्र गाऊसी-पतला नाड़ी थी। बुलबुले की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आवश्यक लोगों की तुलना में जैव-प्रभावों को प्रेरित करने के लिए आमतौर पर लंबे समय तक नाड़ी अवधि की आवश्यकता होती है। इन प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली अल्ट्रासाउंड आवृत्तियां 1 मेगाहर्ट्ज, 2 मेगाहर्ट्ज, या 3 मेगाहर्ट्ज थीं, जिसमें ध्वनिक दबाव आयाम 81 केपीए से 1200 केपीए तक थे।
      2. पल्स / देरी जनरेटर पर, रिकॉर्डिंग के दौरान microbubbles से नैनोकणों के फ्लोरोसेंट उत्तेजना के लिए लेजर के लिए ट्रिगर देरी सेट करें।
        नोट: इन विशिष्ट प्रयोगों के लिए, ट्रिगर देरी 150 μs की कुल अवधि के लिए 20 μs और 170 μs के बीच थी। समय आरेख चित्र 4B में दिखाया गया है।
      3. माइक्रोस्कोप के फ़ोकस में एकल microbubbles का पता लगाने के लिए XYZ-चरण का उपयोग करके नमूना समाधान वाले नमूना धारक को ले जाएँ। नमूना धारक के एक कोने के दृश्य के क्षेत्र के साथ शुरू करें; एक आदर्श कैमरा दृश्य के लिए चित्रा 4C देखें जिसमें microbubbles का इंटरफ़ेस स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और फोकस में है। रिकॉर्डिंग ट्रिगर करें.
      4. चरण 2.3.5.3 को अल्ट्रासाउंड सेटिंग (आवृत्ति और ध्वनिक दबाव) के अनुसार वांछित के रूप में कई बार दोहराएं, पिछले स्थान से कम से कम 2 मिमी (ऑप्टिकल विमान में) माइक्रोबबल्स युक्त सेल संस्कृति कैसेट को स्थानांतरित करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि दृश्य के क्षेत्र में माइक्रोबबल्स पिछले प्रयोगों में sonicated नहीं हैं।
        नोट: इस अध्ययन में, प्रत्येक प्रयोग को दोहराया गया था ~ 10-20x। जब पूरे नमूना धारक insonified है, नमूना धारक खाली है, और बाद के प्रयोगों के लिए ताजा नमूना समाधान के साथ इसे फिर से भरना। प्रयोगों के बीच नमूना धारक को स्थानांतरित करने के लिए कौन सी दूरी ध्वनिक बीम आकार पर निर्भर करती है।
    6. डेटा विश्लेषण
      1. अनुसंधान प्रश्न के अनुसार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करें। प्रत्येक माइक्रोबबल के लिए, नेत्रहीन रूप से निर्धारित करें कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों में नैनोकणों का वितरण हुआ या नहीं। यदि नमूना धारक झिल्ली पर गैस कोर से नैनोकणों की टुकड़ी और जमाव एक एकल माइक्रोबबल के लिए मनाया जाता है, तो मैन्युअल रूप से उस वितरण को प्रोग्रामिंग वातावरण में दर्ज करें।

3. Intravital माइक्रोस्कोपी

  1. पृष्ठीय skinfold खिड़की कक्ष सर्जरी (पहले वर्णित 26,47,50)
    1. खिड़की कक्षों को रखने से पहले एक सप्ताह के लिए जानवरों acclimate. यद्यपि मादा और नर चूहों दोनों का उपयोग किया जा सकता है, और उम्र महत्वहीन है, सुनिश्चित करें कि चूहों का वजन कम से कम 22-24 ग्राम है ताकि त्वचा पर्याप्त रूप से लचीली हो।
    2. इंट्राऑपरेटिव और पोस्टऑपरेटिव एनाल्जेसिक उपचार के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत सर्जरी करें। fentanyl (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) / medetomidine (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) / midazolam (5 मिलीग्राम / किग्रा ) / पानी (2: 1: 2: 5) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा जानवर को 0.1 मिलीलीटर प्रति 10 ग्राम वजन की खुराक पर एनेस्थेटिक करें। जानवर के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड या हीटिंग लैंप का उपयोग करें।
    3. जानवर की पीठ पर त्वचा की दोहरी परत पर धीरे से खींचें ताकि त्वचा को खिड़की कक्ष के दो सममित पॉलीऑक्सीमेथिलीन फ्रेम के बीच सैंडविच किया जा सके। डबल त्वचा परत के माध्यम से विस्तारित दो शिकंजा रखने और कक्ष के ऊपरी किनारे के साथ suturing द्वारा कक्ष को ठीक करें।
    4. त्वचा की तह के एक तरफ कक्ष के परिपत्र फ्रेम के भीतर त्वचा को हटा दें। फ्रेम के भीतर 11.8 मिमी के व्यास के साथ एक कवर ग्लास रखें जहां त्वचा को ऊतक में एक खिड़की बनाने के लिए हटा दिया जाता है।
    5. संज्ञाहरण को समाप्त करने के लिए एंटीडोट के रूप में 0.1 मिलीलीटर प्रति 10 ग्राम की खुराक पर एटिपेमाज़ोल (2.5 मिलीग्राम / किग्रा), फ्लुमाज़ेनिल (0.5 मिलीग्राम / किग्रा), और पानी (1: 1: 8) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन का उपयोग करें। रात भर एक गर्म वसूली रैक में जानवर जगह. सर्जिकल साइट में संक्रमण को रोकने के लिए एनरोफ्लोक्सासिन के 25 मिलीग्राम / एमएल के साथ जानवरों के लिए पानी के पूरक।
  2. ट्यूमर मॉडल निर्माण
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर कैंसर कोशिकाओं को बनाए रखें और उचित संस्कृति माध्यम में 5% सीओ 2 वातावरण में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
      नोट: मानव osteosarcoma (OHS) सेल लाइन इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य सेल लाइनों का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. चरण 3.1.5 के बाद के दिन, कुछ मिनटों के लिए आइसोफ्लुरान (प्रेरण के दौरान 5% और रखरखाव के दौरान 1-2%) द्वारा जानवर को एनेस्थेटिक करें। कवर ग्लास को हटा दें, सेल संस्कृति माध्यम के 30 μL में 5 × 106 कैंसर कोशिकाओं को लागू करें, और कवर ग्लास को बदलें।
    3. इमेजिंग से पहले ट्यूमर को 2 सप्ताह तक बढ़ने की अनुमति दें, और इस अवधि के दौरान प्रति सप्ताह कम से कम 3 बार जानवरों के वजन और स्वास्थ्य की स्थिति की निगरानी करें।
  3. ऑप्टिकल सिस्टम की असेंबली
    1. अल्ट्रासाउंड उपचार के दौरान इंट्रावाइटल इमेजिंग करें (जैसा कि पिछले work26 में वर्णित है) एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप और उद्देश्य के साथ दांव पर शोध प्रश्न के आधार पर। प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए चित्र 5A देखें।
      नोट: इस विशिष्ट प्रयोग के लिए, एक मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था, जो 20x पानी डुबकी उद्देश्य (1.0 का एनए और 2 मिमी की काम करने की दूरी) और एक स्पंदित लेजर से सुसज्जित था। छवियों को अनुनादी स्कैनिंग मोड में 31 फ्रेम प्रति सेकंड (512 x 512 पिक्सेल) पर 400 x 400 μm2 के दृश्य के क्षेत्र के साथ अधिग्रहित किया गया था। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 790 एनएम था। दो गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फाइड डिटेक्टरों के सामने फिल्टर प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए लंबे समय से पास 590 एनएम और बैंड-पास 525/50 एनएम थे।
  4. ध्वनिक प्रणाली की असेंबली
    1. पृष्ठीय स्किनफोल्ड विंडो चैंबर के कवर ग्लास से प्रतिबिंब को कम करने और खड़ी तरंग संरचनाओं को कम करने के लिए ऑप्टिकल अक्ष के संबंध में ऑप्टिकल अक्ष के संबंध में 45 डिग्री के कोण पर उद्देश्य के नीचे स्थित एक वेवगाइड (कस्टम मेड) में एक उपयुक्त अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर माउंट करें। आसुत और degassed पानी के साथ waveguide भरें। वेवगाइड के शीर्ष पर अल्ट्रासोनिक युग्मन जेल लागू करें।
  5. ऑप्टिकल और ध्वनिक प्रणालियों का संरेखण
    1. अल्ट्रासाउंड के फोकस के साथ ऑप्टिकल अक्ष संरेखित करें। उद्देश्य के फोकस में एक फाइबर ऑप्टिक हाइड्रोफोन की स्थिति। फिर, एम्पलीफायर और मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर को चालू करने के लिए 100 हर्ट्ज की नाड़ी पुनरावृत्ति आवृत्ति के साथ छोटे फटने (5-10 चक्र) के साथ ट्रांसड्यूसर को उत्तेजित करने के लिए, और अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को उस स्थिति में ले जाएं जहां ऑसिलोस्कोप पर हाइड्रोफोन सिग्नल के साथ उच्चतम दबाव का पता लगाया जाता है।
      नोट:: संरेखण के बाद ट्रांसड्यूसर की स्थिति को परिवर्तित न करें।
  6. इमेजिंग प्रोटोकॉल
    1. वेवगाइड और उद्देश्य के बीच एक XY-पोजिशनिंग चरण से जुड़े गर्म पशु धारक (कस्टम डिज़ाइन) की स्थिति रखें, और अधिक युग्मन जेल जोड़ें। जानवर को एनेस्थेटिक करें, और एक पूंछ शिरा कैथेटर रखें। माउस को गर्म धारक में रखें, और धारक में खिड़की कक्ष को ठीक करें। खिड़की कक्ष में कवर पर्ची के शीर्ष पर एक पानी की बूंद जोड़ें, और ट्यूमर ऊतक छवि के लिए जगह में उद्देश्य ले जाएँ।
    2. चित्र 5B घटनाओं के क्रम को दर्शाने वाले प्रयोगों के समय आरेख को दर्शाता है। वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले 2 एमडीए डेक्सट्रान को अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट करें (30 μL, 4 मिलीग्राम / एमएल खारा में पतला) और उपयुक्त रक्त वाहिकाओं के साथ एक स्थिति खोजने के लिए XY-अनुवाद चरण का उपयोग करके माउस को स्थानांतरित करें। अल्ट्रासाउंड उपचार से पहले बेसलाइन छवियों को रिकॉर्ड करें। फ्रेम दर, दृश्य के क्षेत्र, और रिकॉर्डिंग की लंबाई को समायोजित करें जो अनुसंधान प्रश्न और माइक्रोस्कोप और रंजक की बारीकियों के आधार पर चित्रित किया जाना है।
      नोट: इन प्रयोगों में, 400 x 400 μm2 के दृश्य के क्षेत्र के साथ प्रति सेकंड 31 फ्रेम दर्ज किए गए थे, और इमेजिंग 5 मिनट के लिए लगातार किया गया था।
    3. मनमाना तरंग जनरेटर पर वांछित अल्ट्रासाउंड ड्राइविंग आवृत्ति, नाड़ी लंबाई, और ध्वनिक दबाव आयाम सेट करें।
      नोट: इन प्रयोगों के लिए, 1 मेगाहर्ट्ज की आवृत्ति का उपयोग 10 एमएस की नाड़ी लंबाई और 0.2 एमपीए और 0.8 एमपीए के बीच चोटी के नकारात्मक दबाव आयामों के साथ किया गया था। 0.5 हर्ट्ज या 0.1 हर्ट्ज की पल्स पुनरावृत्ति आवृत्ति का उपयोग अल्ट्रासाउंड दालों के बीच उपचारित क्षेत्र में नए माइक्रोबबल्स को पुन: प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए किया गया था।
    4. अंतःशिरा रूप से 50 μL microbubbles (2 × 108 × 108 microbubbles / mL) इंजेक्ट करें, और इमेजिंग करते समय अल्ट्रासाउंड लागू करें, जैसा कि 26 में वर्णित है।
  7. डेटा विश्लेषण
    1. अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, (ओपन सोर्स) छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर और एक प्रोग्रामिंग वातावरण के साथ छवियों का विश्लेषण करें, जैसा कि 26 में वर्णित है, रक्त वाहिका पैरामीटर (व्यास, ब्रांचिंग, प्रवाह गति, और दिशा) निर्धारित करने के लिए, जहाजों में नैनोकणों का संचय, और कैनेटीक्स और ट्यूमर ऊतक में डेक्सट्रान और नैनोकणों के अतिरिक्त की गहराई।

Representative Results

प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में उत्पादित माइक्रोबबल्स का विश्लेषण विभिन्न माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करके और विभिन्न टाइमस्केल पर किया गया था।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6 ए) में नैनोकणों की प्रतिदीप्ति इंगित करती है कि शेल में एक गैर-समान कण वितरण है। अन्य माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग बबल लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 6B स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माइक्रोबबल की समग्र संरचना को दर्शाता है, जैसा कि पिछले work34 में प्रस्तुत किया गया है।

रेडियल गतिशीलता और phenomenological बुलबुला व्यवहार विट्रो उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी विधि में वर्णित का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है जिसमें microbubbles प्रति सेकंड 10 मिलियन फ्रेम पर चित्रित किया गया था। एकल माइक्रोबबल्स की त्रिज्या को घर में लिखी गई स्क्रिप्ट का उपयोग करके समय के साथ निकाला गया था। इस तरह की रेडियल प्रतिक्रिया का एक उदाहरण चित्र 7 में दिखाया गया है।

विशिष्ट सफल नैनोपार्टिकल वितरण का एक छवि अनुक्रम, जैसा कि अनुभाग 2.3.6 में वर्णित है, चित्र 8A में दिखाया गया है। माइक्रोबबल शेल में एम्बेडेड नैनोकणों को प्रतिदीप्ति के कारण प्रकाश में देखा जा सकता है जब लेजर प्रकाश बुलबुले तक पहुंचता है। अल्ट्रासाउंड insonation द्वारा संचालित, फ्लोरोसेंट नैनोकणों microbubbles के गैस कोर से अलग और नमूना धारक की झिल्ली पर जमा कर रहे हैं. अंत में, लेजर बंद कर दिया जाता है, और फ्लोरोसेंट नैनोकणअब उत्साहित नहीं होते हैं। माइक्रोबबल्स के फ्लोरोसेंटली-लेबल पेलोड का असफल वितरण आमतौर पर चित्रा 8 बी में दिखाए गए छवि अनुक्रम की तरह दिखता है, जहां फ्लोरोसेंट नैनोकण माइक्रोबबल के खोल पर प्रकाश डालते हैं जो अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान बरकरार रहता है।

अल्ट्रासाउंड के दौरान रियल-टाइम इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग रक्त में नैनोपार्टिकल व्यवहार पर अल्ट्रासाउंड और माइक्रोबबल्स के प्रभावों की जांच करने, ट्यूमर रक्त वाहिकाओं की पारगम्यता में वृद्धि और नैनोकणों के वितरण में सुधार के लिए किया गया था। ध्वनिक दबाव, आवृत्ति और नाड़ी लंबाई के एक समारोह के रूप में बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में प्रवेश की सीमा और कैनेटीक्स की विशेषता हो सकती है। अल्ट्रासाउंड उपचार का प्रभाव जहाजों के आकार और आकृति विज्ञान के संबंध में भिन्न हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप बुलबुले का बंधन हो सकता है। अल्ट्रासाउंड उपचार रक्त प्रवाह और दिशा को कैसे प्रभावित करता है, यह निर्धारित किया जा सकता है। समय के साथ नैनोकणों के बहिष्करण को दर्शाने वाला एक उदाहरण प्रयोग चित्र 9 में 0.826 के एक यांत्रिक सूचकांक (एमआई) में दिखाया गया है। इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के परिणाम अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान नैनोकणों के स्थानिक और अस्थायी बहिष्करण को स्पष्ट करते हैं, जो नैनोकणों के अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता वितरण के अंतर्निहित तंत्र की पूरी समझ के लिए अत्यधिक फायदेमंद है और ऐसी प्रौद्योगिकियों को अनुकूलित करने के लिए 26।

Figure 1
चित्रा 1: विकृत केसिन में फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले बहुलक नैनोकणों के एक खोल के साथ एक माइक्रोबबल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। माइक्रोबबल्स आमतौर पर व्यास में 1 μm और 10 μm के बीच होते हैं। नैनोकणों का व्यास ज्यादातर 100 एनएम और 200 एनएम 38 के बीच होता है। संक्षिप्त नाम: C3F8 = perfluoropropane गैस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: योजनाबद्ध अवलोकन उज्ज्वल-क्षेत्र, प्रतिदीप्ति, confocal, और intravital माइक्रोस्कोपी के लिए प्रासंगिक समय और लंबाई तराजू दिखा रहा है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A) प्रयोगात्मक सेटअप, (B) समय आरेख, और (C) एक विशिष्ट रिकॉर्ड किया गया फ़्रेम। (C) में स्केल बार = 10 μm. संक्षिप्त नाम: एफपीएस = फ्रेम प्रति सेकंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) प्रयोगात्मक सेटअप, (बी) समय आरेख, और (सी) एक विशिष्ट रिकॉर्ड किया गया फ्रेम। (C) में स्केल बार = 10 μm. संक्षिप्त नाम: एफपीएस = फ्रेम प्रति सेकंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A) प्रयोगात्मक सेटअप, (B) समय आरेख, और (C) एक विशिष्ट रिकॉर्ड किया गया फ़्रेम. (C) में स्केल बार = 50 μm. हरा dextran-FITC और नैनोकणों के लिए लाल से मेल खाती है। संक्षिप्त नाम: GAAsP = गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एक एकल नैनोपार्टिकल-और-प्रोटीन-स्थिर माइक्रोबबल की 3 डी संरचना। (ए) नैनोकणों को दिखाने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, और (बी) 3 डी संरचना को दिखाने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना। (बी) को 34 से अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया है। (A) में स्केल बार = 5 μm; (B) = 2 μm में स्केल बार। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एक 2.89 μm त्रिज्या nanoparticle-और-प्रोटीन-स्थिर microbubble के विशिष्ट गोलाकार दोलनों 1 मेगाहर्ट्ज की एक अल्ट्रासाउंड आवृत्ति और 142 kPa के एक ध्वनिक दबाव आयाम पर insonified.(ए-डी) उच्च गति रिकॉर्डिंग से छवियों और समय वक्र (नीचे) पर इसी बुलबुला त्रिज्या से छवियों. स्केल बार = 5 μm, और लाल रेखा प्रारंभिक त्रिज्या को इंगित करती है। रोशनी प्रोफ़ाइल (मनमाना इकाइयों) पीले रंग द्वारा इंगित किया जाता है। आवर्धन 120x है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: उच्च गति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से छवि अनुक्रम. (A) एक नैनोपार्टिकल-और-प्रोटीन-स्थिर माइक्रोबबल के फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले नैनोकणों की सफल डिलीवरी 2 मेगाहर्ट्ज की अल्ट्रासाउंड आवृत्ति और 600 kPa के ध्वनिक दबाव आयाम पर insonified। (बी) एक नैनोपार्टिकल-और-प्रोटीन-स्थिर माइक्रोबबल के फ्लोरोसेंटली-लेबल नैनोकणों का असफल वितरण 2 मेगाहर्ट्ज की अल्ट्रासाउंड आवृत्ति और 210 केपीए के ध्वनिक दबाव आयाम पर इनोनिफाइड होता है। स्केल सलाखों = 10 μm. आवर्धन 120x है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: 1 मेगाहर्ट्ज की अल्ट्रासाउंड आवृत्ति और 800 केपीए के ध्वनिक दबाव आयाम पर नैनोपार्टिकल-और-प्रोटीन-स्थिर माइक्रोबबल्स के इनोनेशन के बाद इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (ए) पोत के भीतर नैनोकणों, और (बी) (ए) में सफेद धराशायी वर्ग द्वारा इंगित क्षेत्र का एक छवि अनुक्रम जो डेक्सट्रान (हरे) और नैनोकणों (लाल) के एक्सट्रावेशन को दर्शाता है। स्केल सलाखों = 50 μm. आवर्धन 20x है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

विभिन्न ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी विधियों को माइक्रोबबल्स की सतह से आसपास के माध्यम तक नैनोकणों के वितरण में विभिन्न चरणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए संयुक्त किया गया था। बुलबुला दोलनों की इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था, साथ ही साथ बुलबुला खोल से नैनोकणों की रिहाई की इमेजिंग, एक्सट्रावेशन, और विवो में ट्यूमर के एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के माध्यम से प्रवेश। इन विट्रो इमेजिंग विवो सेटअप में अधिक जटिल की तुलना में कई अल्ट्रासाउंड मापदंडों की स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है। इमेजिंग तौर-तरीकों की इस श्रृंखला के संयोजन का लाभ पूरक जानकारी है जिसे विभिन्न टाइमस्केल पर प्राप्त किया जा सकता है - एक ऐसी सुविधा जो सफल वितरण के लिए माइक्रोबबल्स को चिह्नित करने और अनुकूलित करने और चिकित्सीय प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह दृष्टिकोण सभी माइक्रोबबल्स के लिए समान रूप से वितरण तंत्र को समझने के लिए उपयोगी है, जिसमें फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले नैनोकणों और दवाओं के साथ निर्माण शामिल हैं।

एकल माइक्रोबबल्स का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी विधियों में सबसे महत्वपूर्ण चरण निम्नानुसार हैं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, कण रिलीज के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए नैनोकणों को फ्लोरोसेंटली-लेबल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, नमूना समाधान confocal, उज्ज्वल क्षेत्र, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधियों में विश्लेषण के लिए एकल microbubbles को अलग करने के लिए पर्याप्त पतला किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बुलबुले को सबसे अधिक कुशलता से उत्तेजित करने के लिए एक अल्ट्रासाउंड ड्राइविंग आवृत्ति और ध्वनिक दबाव का चयन करना महत्वपूर्ण है, अर्थात् उनके अनुनाद पर। यदि शोध प्रश्न नैनोपार्टिकल पेलोड के वितरण से संबंधित है, तो उपयुक्त अल्ट्रासाउंड पैरामीटर जांच का हिस्सा होना चाहिए। अनुनाद के बगल में, इन बुलबुले को नैनोपार्टिकल रिलीज के लिए उनकी दहलीज पर या उससे परे भी संचालित किया जाना चाहिए, आमतौर पर अपेक्षाकृत उच्च ध्वनिक दबाव आयामों (एमआई > 0.3) 51 पर। ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए, मोशन ब्लर को कम करने और एलियासिंग से बचने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च फ्रेमरेट के साथ एक उच्च गति वाले कैमरे का चयन करना महत्वपूर्ण है।

ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी मुख्य रूप से इमेजिंग फ्रेमरेट और उपलब्ध प्रकाश स्रोतों की तीव्रता से सीमित है, क्योंकि एक उच्च फ्रेमरेट बुलबुला गतिशीलता में अधिक विस्तृत समय-हल अंतर्दृष्टि देगा, लेकिन कम जोखिम समय के कारण अधिक तीव्र रोशनी की आवश्यकता होती है। अधिक विस्तार से कण रिलीज का अध्ययन करने के लिए, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए फ्रेमरेट, सिद्धांत रूप में, लेजर प्रकाश की तीव्रता को बढ़ाकर बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले माइक्रोबबल्स द्वारा उच्च तीव्रता वाले लेजर प्रकाश का अवशोषण उच्च क्वांटम उपज रंजक के साथ भी गर्मी उत्पन्न करता है। यह गर्मी दांव पर प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकती है, और चरम मामलों में, फोटो-थर्मल cavitation52 को प्रेरित कर सकती है। इस प्रकार, व्यवहार में, लागू लेजर समृद्धि की एक सीमा है। हालांकि, तीव्र लेजर रोशनी का उपयोग जानबूझकर लिपोसोम 53 से कण रिलीज को प्रेरित करने के लिए भी किया जा सकता है। तापमान बुलबुला गतिशीलता और अल्ट्रासाउंड प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है, बुलबुला टाइप 54 पर निर्भर करता है। इसलिए, यदि इन विट्रो और इंट्रावाइटल विधियों की तुलना निष्पक्ष रूप से की जानी है, तो प्रोटोकॉल में चर्चा की गई इन विट्रो विधियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए। वर्तमान पेपर में चर्चा की गई इन विट्रो विधियों की एक और सीमा यह है कि बुलबुले एक मुक्त-क्षेत्र वातावरण में नहीं हैं, क्योंकि माइक्रोबबल्स नमूना धारक झिल्ली के नीचे तैरेंगे। इसके अलावा, एकल माइक्रोबबल्स की इमेजिंग करते समय एक चयन पूर्वाग्रह होता है। हालांकि, एकल बुलबुले पर दोहराए गए प्रयोगों का प्रदर्शन आकार के प्रभाव की जांच और confounding कारक को हटाने की अनुमति देता है- आकार वितरण। यदि आकार के एक समारोह के रूप में बुलबुला प्रतिक्रिया को समझा जा सकता है, जबकि एकाग्रता बुलबुला-बुलबुला इंटरैक्शन को रोकने के लिए बहुत अधिक नहीं है, तो किसी भी मनमाने ढंग से बुलबुला आबादी की प्रतिक्रिया की गणना की जा सकती है। अंत में, उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दोनों विधियां दो-आयामी (2 डी) छवि में जटिल माइक्रोबबल्स में अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं। यदि शोध प्रश्न को 2D इमेजिंग से अधिक की आवश्यकता होती है, तो बुलबुले के 3D व्यवहार को प्रोटोकॉल में वर्णित सेटअप को मल्टीप्लेन इमेजिंग 55 के लिए साइडव्यू सेटअप के साथ जोड़कर हल किया जा सकता है।

माइक्रोबबल्स का अध्ययन करने का एक वैकल्पिक तरीका ध्वनिक लक्षण वर्णन 56 है। हालांकि, एक एकल माइक्रोबबल की गूंज को मापने के लिए अल्ट्रासाउंड बीम 56 के भीतर एक एकल माइक्रोबबल का पता लगाने और अलग करने की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर एक संकीर्ण ट्यूब या ऑप्टिकल या ध्वनिक चिमटी 57,58 के उपयोग से निपटने के लिए एक चुनौती पैदा करता है। ध्वनिक रूप से बुलबुले को आकार देने के लिए, माइक्रोबबल्स को ज्यामितीय प्रकीर्णन शासन में उनकी अनुनाद आवृत्ति की तुलना में बहुत अधिक आवृत्तियों पर इनसोनिफाइड किया जा सकता है, जो वॉल्यूमेट्रिक माइक्रोबबल दोलनों को प्रेरित नहीं करता है59। एक "ध्वनिक कैमरे" का उपयोग अल्ट्रासाउंड के जवाब में एकल माइक्रोबबल्स की रेडियल गतिशीलता की छवि बनाने के लिए एक ऐसी विधि है, जिसमें कम आवृत्ति ड्राइविंग वेव 60 के लिए बुलबुले की रेडियल प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए एक उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग किया जाता है। इस विधि का नुकसान यह है कि इसका उपयोग केवल माइक्रोबबल त्रिज्या के सापेक्ष परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है; इसलिए, पूर्ण बुलबुला त्रिज्या निर्धारित करने के लिए एक और विधि की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल इमेजिंग 61,62 के माध्यम से। उन तरीकों का नुकसान जिसमें माइक्रोबबल्स अपनी अनुनाद आवृत्ति से अधिक आवृत्तियों पर अल्ट्रासाउंड के संपर्क में आते हैं, यह है कि ऐसी उच्च आवृत्तियों पर, प्रवेश गहराई कम हो जाती है59, विवो अनुप्रयोगों में प्रयोज्य को सीमित करती है। माइक्रोस्कोपी के अन्य रूपों का उपयोग माइक्रोबबल्स का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जैसे कि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 63। हालांकि, इन वैकल्पिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों का प्राप्त करने योग्य स्पैटियो-टेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन आमतौर पर अधिक सीमित होता है, और इन तकनीकों का नुकसान होता है कि इमेजिंग को ऑफ-लाइन विश्लेषण द्वारा अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर से पहले या बाद में किया जाता है और आमतौर पर कम थ्रूपुट 63 पेश किया जाता है। एक अन्य विकल्प एक प्रकाश प्रकीर्णन विधि का उपयोग करना है, जिसका उपयोग वास्तविक समय में एकल माइक्रोबबल्स की रेडियल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ध्वनिक प्रकीर्णन विधियों की तुलना में शोर अनुपात के लिए कम संकेत है64।

अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान रियल-टाइम इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान वास्कुलचर, माइक्रोबबल्स, नैनोकणों, या अन्य अणुओं (जैसे इस मामले में डेक्सट्रान) के व्यवहार पर नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। वास्तविक समय इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी करते समय एक सामान्य सीमा यह है कि ऊतक के केवल एक छोटे से क्षेत्र को चित्रित किया जाता है, और ऊतक में प्रकाश की पैठ की गहराई सीमित होती है। यदि छविवाले जहाजों में दृश्य के क्षेत्र के भीतर बहुत कम माइक्रोबबल्स और / या नैनोकण होते हैं, तो नैनोपार्टिकल व्यवहार और बहिष्करण के बारे में बहुत कम या कोई जानकारी प्राप्त नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, दृश्य के सीमित क्षेत्र के कारण, प्रकाश और अल्ट्रासाउंड पथों के बीच एक उचित संरेखण महत्वपूर्ण है। यदि अल्ट्रासाउंड दबाव बुलबुला विनाश को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त उच्च है, तो एक नाड़ी पुनरावृत्ति आवृत्ति चुनना भी महत्वपूर्ण है जो ताजा बुलबुले को अल्ट्रासाउंड दालों के बीच दृश्य के क्षेत्र में reperfuse करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, जैसा कि अल्ट्रासाउंड खिड़की कक्ष और उद्देश्य में कवर ग्लास से परिलक्षित होगा, ट्रांसड्यूसर को एक कोण पर रखना स्थायी तरंगों के गठन को रोकने के लिए प्रतिबिंब को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो कैलिब्रेटेड दबाव क्षेत्र को विकृत करता है। एक और व्यावहारिक मुद्दा यह है कि सेटअप को माइक्रोस्कोप सेटअप में उद्देश्य के ऊपर या नीचे अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर और वेवगाइड को माउंट करने के लिए पर्याप्त स्थान की आवश्यकता होती है। पृष्ठीय खिड़की कक्ष में ट्यूमर सीमित कक्ष और कवर पर्ची के कारण एक सीमित मोटाई होगी; हालांकि, यदि आवश्यक हो, तो अन्य मॉडलों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उदाहरण के लिए, स्तन वसा पैड 65 या विभिन्न अंगों में ट्यूमर के पेट के इंट्रावाइटल इमेजिंग में स्किनफोल्ड ट्यूमर हैं। इस तरह के ट्यूमर को उचित माइक्रोएन्वायरमेंट में ऑर्थोटोपिक रूप से उगाया जा सकता है, और इस तरह, एक अधिक नैदानिक रूप से प्रासंगिक मामला पेश करता है।

इस काम में वर्णित तरीके बुलबुले और अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके दवा वितरण अनुप्रयोगों के मूल सिद्धांतों का अध्ययन करने के लिए फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले माइक्रोबबल्स की क्षमता को प्रबुद्ध करते हैं। माइक्रोस्कोपी विधियों का यह संयोजन अल्ट्रासाउंड इनसोनेशन और इसके संबंधित ध्वनिक पैरामीटर स्पेस के लिए माइक्रोबबल प्रतिक्रिया में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और समय और लंबाई के तराजू की एक प्रासंगिक सीमा पर माइक्रोबबल और पेलोड व्यवहार का एक स्पष्ट दृश्य प्रस्तुत करता है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 Tabor Electronics Arbitrary waveform generator (programmable)
2100 L ENI Amplifier, used in window chamber setup
2 MDa dextran Sigma-Aldrich
33522 A Agilent Technologies Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup
A1R Nikon Instruments Confocal microscope
ACE I SCHOTT Dimmable AC halogen light source
Atipemazol Orion Pharma Antidote to wake animal
Baytril Bayer Enrofloxacin
BD Neoflon 24 G Becton Dickinson & Company Tail vein catheter
BNC model 575 Berkely Nucleonics Corporation Pulse/delay generator
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Branson Ultrasonic bath
Channel slide Ibidi
CLINIcell 25 Laboratoires Mabio International Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm)
Cohlibri Lightline Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix Oscilloscope
Fentanyl Actavis Group HF Anaesthesia of mouse
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich Supplement for cell culture medium
Fiber-optic hydrophone Precision Acoustics Used for alignment
Flumanezil Fresenius Kabi Antidote to wake animal
Heated animal holder Custom design A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber
Hyper Vision HPV-X2 Shimadzu High-speed camera
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin open source image processing program
In vivo SliceScope Scientifica Multiphoton microscope
Isoflurane Baxter
ISOTON Beckman Coulter Filtered, phosphate-buffered saline solution
LUMPLFLN60XW Olympus Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)
MaiTai DeepSee Spectra-Physics Pulsed laser
MATLAB Mathworks Programming environment
Medetomidine Orion Pharma Anesthesia of mouse
Midazolam Accord Healthcare Limited Anesthesia of mouse
Milli-Q Merck Ultrapure water
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe PerkinElmer Strobe light
Panametrics-NDT C305 Olympus Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1")
Panametrics-NDT V304 Olympus Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25")
Penicillin Sigma-Aldrich Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
Perfluoropropane gas F2 Chemicals
Roswell Park Memorial Institute 1640 Gibco Thermo-Fisher Cell culture medium
Safe-Lock tube Eppendorf
Streptomycin Sigma-Aldrich Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
T 25 basic ULTRA-TURRAX IKA laboratory technology Dispersion tool
TDS 210 Tektronix Oscilloscope, used in window chamber setup
Transducer Precision Acoustics Ltd Used in window chamber setup
U-TLU Olympus Tube lens
VBA100-200 Vectawave Amplifier
Window chambers Custom made Used in window chamber setup
XLUMPLFLN20 XW Olympus 20x water dipping objective
XY(Z) translation stages Thorlabs

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References

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