Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Multi-tidsskala mikroskopi metoder for karakterisering av fluorescerende merket mikrobobler for ultralyd-utløst legemiddel frigjøring

Published: June 12, 2021 doi: 10.3791/62251
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 4,5,6, 3,6,7, 7, 1
1Physics of Fluids group, Department of Science and Technology, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 2BIOS Lab-on-a-Chip group, Max Planck Center Twente for Complex Fluid Dynamics, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 3Department of Biotechnology and Nanomedicine, SINTEF Industry, 4Department of Circulation and Medical Imaging, Norwegian University of Science and Technology, 5Department of Health Research, SINTEF Digital, 6Cancer Clinic, St. Olav’s Hospital, 7Department of Physics, Norwegian University of Science and Technology

Summary

De presenterte protokollene kan brukes til å karakterisere responsen til fluorescerende merkede mikrobobler designet for ultralydutløste legemiddelleveringsapplikasjoner, inkludert deres aktiveringsmekanismer så vel som deres bioeffekter. Dette papiret dekker en rekke in vitro - og in vivo-mikroskopiteknikker som utføres for å fange opp relevant lengde og tidsskalaer.

Abstract

Mikrobubble kontrastmidler holder stort løfte for legemiddelleveringsapplikasjoner med ultralyd. Innkapsling av legemidler i nanopartikler reduserer systemisk toksisitet og øker sirkulasjonstiden for stoffene. I en ny tilnærming til mikrobobleassistert legemiddellevering er nanopartikler innlemmet i eller på mikrobubble skall, noe som muliggjør lokal og utløst frigjøring av nanopartikkelnyttelasten med ultralyd. En grundig forståelse av frigjøringsmekanismene i det enorme ultralydparameterrommet er avgjørende for effektiv og kontrollert frigjøring. Dette settet med presenterte protokoller gjelder for mikrobobler med et skall som inneholder en fluorescerende etikett. Her er fokuset på mikrobobler lastet med poly (2-etyl-butylcyoacrylat) polymere nanopartikler, dopet med en modifisert Nil Rød fargestoff. Partiklene er festet i et denaturert kaseinskall. Mikroboblene produseres ved kraftig omrøring, og danner en spredning av perfluoropropangass i væskefasen som inneholder kasein og nanopartikler, hvorpå mikrobubble-skallet selvmonteringer. En rekke mikroskopiteknikker er nødvendig for å karakterisere nanopartikkelstabiliserte mikrobobler på alle relevante tidsskalaer av nanopartikkelutløsningsprosessen. Fluorescens av nanopartiklene muliggjør konfikal avbildning av enkle mikrobobler, og avslører partikkelfordelingen i skallet. In vitro ultra-høyhastighets bildebehandling ved hjelp av lysfeltmikroskopi med 10 millioner bilder per sekund gir innsikt i bobledynamikken som svar på ultralydinsonasjon. Til slutt visualiseres nanopartikkelutløsning fra bobleskallet best ved hjelp av fluorescensmikroskopi, utført ved 500.000 bilder per sekund. For å karakterisere legemiddellevering in vivo studeres den utløste frigjøringen av nanopartikler i vaskulaturen og deres ekstravasasjon utover endotellaget ved hjelp av intravital mikroskopi i svulster implantert i dorsale hudfoldvindukamre, over en tidsskala på flere minutter. Kombinasjonen av disse komplementære karakteriseringsteknikkene gir unik innsikt i oppførselen til mikrobobler og deres nyttelastutgivelse på en rekke tids- og lengdeskalaer, både in vitro og in vivo.

Introduction

Ultralyd er den mest brukte medisinske bildeteknikken. Det er ikke-invasivt, raskt, trygt, kostnadseffektivt og bærbart1,2,3. Imidlertid er blod en dårlig ultralydspredning, og kontrasten i blodbadet kan forbedres ved en intravenøs injeksjon av ultralydkontrastmidler3. Denne forbedrede blodbassengkontrasten muliggjør kvantifisering av organperfusjon for diagnostiske formål, for eksempel ved påvisning av koronararteriesykdom4 og metastatisk leversykdom5. Faktisk ble tumorvaskulatur vist seg å være en viktig prognostisk faktor6. En stor forskningsinnsats er nå rettet mot mikrobobleassistert, målrettet molekylær avbildning og skreddersømkontrastmidler for terapeutisk bruk.

Kommersielt tilgjengelige ultralydkontrastmidler består vanligvis av en suspensjon av belagte mikrobobler7,8 med diametre fra 1 μm til 10 μm9. Siden ultralydkontrastmiddelmikrobobler er litt mindre enn røde blodlegemer7, kan mikroboblene trygt nå selv de minste kapillærene uten å skape en okklusjon3. Mikrobobler har en dramatisk økt ultralyd backscattering koeffisient sammenlignet med vev10, på grunn av deres kompressible gasskjerne11. Videre er mikrobubble-ekkoet svært ikke-lineært, det vil si at spekteret inneholder harmonikk og subharmoni av kjørefrekvensen. I tillegg er ekkostyrken sterkt avhengig av resonansresponsen til boblen12. Mens vev sprer seg bare lineært, er et lite antall mikrobobler tilstrekkelig til å oppnå høy deteksjonsfølsomhet ved harmonisk avbildning13,14. Denne ikke-lineære kontrastgenerasjonen kan til og med være sterk nok til å spore enkeltbobler i kroppen15.

Skallet av ultralydkontrastmiddelet stabiliserer boblene mot oppløsning og koalescens, og øker dermed sirkulasjonstiden i blodbassenget16. Skallet kan bestå av lipider, polymerer eller denaturerte proteiner3,8. Det reduserer den interfaciale spenningen, og begrenser dermed effekten av Laplace trykkdrevet oppløsning17 og skaper en resistiv barriere mot gassdiffusjon18. For ytterligere å øke stabiliteten er kontrastmikroboblene vanligvis fylt med en høymolekylær gass med lav løselighet i blod11. Mikrobubble skallet dramatisk endrer responsen av mikrobubbles til ultralyd insonasjon11. Ubestrøket gassbobler har en karakteristisk resonansfrekvens som er omvendt proporsjonal med deres størrelse, og tilsetningen av et lipidbelegg øker resonansfrekvensen med hensyn til en ubestrøket buble på grunn av skallets indre stivhet. Videre sprer skallet energi gjennom dilatasjonsviskositet, noe som utgjør den dominerende kilden til demping for belagte bobler3. Det stabiliserende skallet har den ekstra fordelen at det kan funksjonaliseres, for eksempel ved å binde målretting av ligander til overflaten av mikrobobler. Denne målrettingen muliggjør mange bruksområder for disse boblene og spesielt molekylær avbildning med ultralyd14,19.

Mikrobubble kontrastmidler holder stort løfte for legemiddelleveringsapplikasjoner med ultralyd. Mikrobobler som svinger i innesperring av et blodkar kan forårsake mikrostreaming så vel som lokale normale og skjærspenninger på kapillærveggen3. Ved høyt akustisk trykk kan store amplitudeoscillasjoner føre til mikroboblekollaps i en voldelig prosess kalt inertiell kavitasjon, noe som igjen kan føre til brudd eller invaginering av blodkaret20. Disse voldelige fenomenene kan indusere bioeffekter som sonopermeation21, og forbedre ekstravasasjonen av terapeutiske legemidler inn i interstitiumet over endotelveggen, enten paracellulært eller transcellulært. Det kan også forbedre penetrasjonen av terapeutiske midler gjennom den ekstracellulære matrisen av stromarike svulster21,22 og biofilmer23,24, selv om denne mekanismen fortsatt er dårlig forstått26.

Ultralydmediert legemiddellevering har vist lovende resultater både preklinisk27,28 og i kliniske studier22. Videre, når de brukes med relativt lavfrekvent ultralyd (~ 1 MHz), har mikrobobler blitt rapportert å lokalt og forbigående øke blod-hjernebarrierens permeabilitet, og dermed gjøre det mulig for legemidler å komme inn i hjernen parenchyma, både i prekliniske og kliniske studier29,30,31,32,33,34.

Det er generelt to tilnærminger til ultralydmediert legemiddellevering: det terapeutiske materialet kan administreres samtidig med boblene, eller det kan festes til eller lastes i bobleskallet28,35,36. Den andre tilnærmingen har vist seg å være mer effektiv når det gjelder legemiddellevering37. Mikrobobler kan lastes med legemidler eller genetisk materiale innkapslet i nanopartikler (liposomer eller polymere nanokonstrukter) festet til skallet eller innlemmet direkte i mikrobubble skallet35,36. Nanopartikkelbelastede mikrobobler kan aktiveres ved (fokusert) ultralyd for å frigjøre nanopartikkelnyttelasten lokalt28,33,38,39,40. Hvis en slik mikrobubble er i direkte kontakt med en celle, har det vist seg in vitro at nyttelasten til og med kan deponeres på cellen cytoplasmatisk membran i en prosess som kalles sonoprinting34,35.

Ultralydparameterrommet for mikrobubble-insonasjon er omfattende, og de in vivo biologiske forholdene tilfører ytterligere kompleksitet. Dermed utgjør kombinasjonen av fokusert ultralyd og nanopartikkelbelastede mikrobobler en utfordring innen målrettet terapeutisk.

Målet med dette arbeidet er å gi protokoller som kan brukes til å avbilde, i detalj, responsen av mikrobobler som en funksjon av ultralydparametrene og å studere mekanismene som fører til skallbrudd og etterfølgende frigjøring av det fluorescerende merkede skallmaterialet. Dette settet med protokoller gjelder for mikrobobler med skall som inneholder et fluorescerende fargestoff. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av polymer-nanopartikkel-og-proteinstabiliserte mikrobobler utviklet ved SINTEF (Trondheim). Disse boblene er fylt med perfluoropropangass (C3F8) og nanopartiklene som stabiliserer skallet inneholder NR668, som er et lipofilt derivat av Nile Red fluorescerende fargestoff38,43. Nanopartiklene består av poly (2-etyl-butylcyoacrylat) (PEBCA) og er PEGylated. Funksjonalisering med polyetylenglykol (PEG) reduserer opsonisering og fagocytose ved det mononukleære fagocyttsystemet, og forlenger dermed sirkulasjonstiden14,44. Som et resultat øker PEGylation mengden nanopartikler som når målstedet, og forbedrer dermed effekten av behandlingen16. Figur 2 illustrerer hvordan bruk av fire mikroskopimetoder gjør det mulig for forskere å dekke alle relevante tids- og lengdeskalaer. Det skal bemerkes at den romlige oppløsningen som kan oppnås i optisk mikroskopi, bestemmes av diffraksjonsgrensen, som avhenger av bølgelengden til lys- og numerisk blenderåpning (NA) av målet og objektets belysningskilde45. For de aktuelle systemene er grensen for optisk oppløsning vanligvis 200 nm. I tillegg kan intravital mikroskopi brukes til å bilde på subcellulært nivå46. For nanopartikkel- og proteinstabiliserte mikrobobler som brukes i dette arbeidet, er minimumslengdeskalaen som er relevant for intravital mikroskopi, størrelsen på små kapillærer (≥10 μm). In vitro høyhastighets optisk bildebehandling (10 millioner bilder per sekund) og høyhastighets fluorescensavbildning (500 000 bilder per sekund) er beskrevet for enkle mikrobobler. Høyhastighets lysfeltavbildning ved nanosekund tidsskalaer er egnet til å studere den tidsavklarte radialdynamikken til de vibrerende boblene. I motsetning gir høyhastighets fluorescensmikroskopi direkte visualisering av frigjøringen av de fluorescerende merkede nanopartiklene. Videre kan strukturen til mikrobubble-skallet undersøkes ved hjelp av Z-stack tredimensjonal (3D) konfokal mikroskopi, og skanning av elektronmikroskopi (protokollen for sistnevnte er ikke inkludert i det nåværende arbeidet). Intravital mikroskopi består i å bruke multifotonmikroskopi til bildetumorer som vokser i dorsale vinduskamre for å gi sanntidsinformasjon om lokal blodstrøm og om skjebnen til fluorescerende merkede nanopartikler i vivo47. Kombinasjonen av disse mikroskopimetodene gir til slutt detaljert innsikt i oppførselen til terapeutiske mikrobubble-midler som respons på ultralyd, både in vitro og in vivo.

Protocol

MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Norske dyreforskningsmyndigheter. Detaljer om materialer som ble brukt i protokollen finnes i materialtabellen.

1. Produksjon av mikrobobler

MERK: I dette arbeidet er de mikroboblene av interesse protein- og nanopartikkelstabiliserte mikrobobler, som produksjonsprotokollen tidligere er beskrevet for, 28,33,48. Derfor har fabrikasjonsprotokollen blitt kort oppsummert her.

  1. Først, ved hjelp av en pipette, bland ultrapure vann med 0,5 wt% kasein i fosfatbufret saltvann (PBS) og 1 wt% av nanopartiklene merket med 0,21 wt% av fluorescerende fargestoff, NR668 (modifisert Nil Red), i et sterilt glasskrymp topp hetteglass (10 ml, diameter på 2 cm). De polymere nanopartiklene fremstilles ved hjelp av mini-emulsjonspolymeriseringsmetoden som beskrevet av Mørch et al. 38.
    MERK: Her fungerer fargestoffet som et modellmedisin for å muliggjøre visualisering av nanopartikkelfrigjøring. Når du arbeider med nanopartikkelløsningen, bruk labfrakk, vernebriller og hansker. Tørk bort søl av nanopartikkelløsningen umiddelbart med 100% aceton.
  2. Cap hetteglasset med gummihetten, bland litt, og legg hetteglasset i et ultralydbad i 10 minutter ved romtemperatur for å eliminere mulige aggregater. Plasser et dispersjonsverktøy med spissen av røreren ~ 0,5 cm fra bunnen av hetteglasset i glass. Bruk en glasspipette koblet til gassbeholderen, tilsett perfluoropropangassen til hoderommet på hetteglasset som inneholder løsningen til løsningen begynner å boble litt.
    MERK: Vikle selvforseglingsfilmen rundt bunnen av dispersjonsverktøyet for å unngå at hetteglasset glir under omrøring.
  3. Rør oppløsningen kraftig ved 1935 × g (24 000 o/min med en rotasjonsradius på 3 mm) i 4 minutter ved hjelp av dispersjonsverktøyet. Lukk hetteglasset med gummihetten, og forsegle hetteglasset for videre bruk.
    MERK: Omrøringen omslutter gassen i væsken. Mikrobubble-skallet monteres deretter selv uten å kreve noe aktivt trinn.
  4. Oppbevar den overskytende kasein- og nanopartikkelløsningen ved 4 °C, og rengjør dispersjonsverktøyet med 100 % aceton.

2. Bildebehandling av enkeltbobler

  1. Konfekt mikroskopi
    1. Prøvepreparering
      1. Fortynn bobleløsningen til bilde enkle mikrobobler som følger. Plasser en avtrekksnål (19 G-21 G) i et hetteglass med glasskrymp topp som inneholder mikroboblene som produseres ved å følge prosedyren som er beskrevet i avsnitt 1. Snu hetteglasset opp ned slik at store bobler kan bevege seg bort fra forseglingen på hetteglasset.
      2. Sett inn en annen kanylespiss (19 G) av en liten (~1 ml) sprøyte i hetteglasset, mens hetteglasset fortsatt er opp-ned. Fjern en liten mengde bobleoppheng, og overfør innholdet i sprøyten til et lite rør for enklere pipettering i neste trinn.
        MERK: Volumet på suspensjonen som skal trekkes ut, avhenger direkte av typen og konsentrasjonen av boblefjæringen. I dette tilfellet ble 0,2 ml ekstrahert.
      3. Bruk en pipette til å fortynne mikrobubble-suspensjonen (fra avsnitt 1) i filtrert PBS for å oppnå en konsentrasjon på ca. 2 × 105 til 6 × 105 mikrobobler/ml for å muliggjøre enkeltbobleavbildning.
        MERK: Avhengig av bobletypen anbefales det å vaske boblefjæringen for å fjerne fritt fluorescerende fargestoff. Dette er spesielt viktig med bobler som fluorescerende fargestoff er infundert i skallet. For å vaske bobler, fortynn boblefjæringen (f.eks. ved å ta 100 μL av bobleoppløsningen i 10 ml PBS), og sentrifuger den (vanligvis med hastigheter på 100 × g). Til slutt fjerner du supernatanten som inneholder mikroboblene med en pipette for videre analyse. Den resterende løsningen inneholder de frie fluorescerende partiklene og kan kastes. Vasketrinnet bør gjentas etter behov.
      4. Tilsett glyserol i blandingen for å øke viskositeten til mediet og eliminere bevegelsen indusert av brownsk bevegelse som ellers ville forstyrre den ganske langsomme konfokale Z-stack-avbildningen.
        MERK: Mengden glyserol avhenger av hvilken type boble som er avbildet (her~ 50%). For noen typer bobler kan glyserol ha en negativ effekt på stabiliteten49. Imidlertid ble det ikke observert merkbar endring i boblene over ca. 30 min under konfomisk avbildning. Videre kan glyserol endre den akustiske responsen til mikrobobler og kan derfor bare brukes med avbildningsmetoder der mikroboblene ikke er insonifisert.
      5. Plasser mikrobubble-fjæringen i et kammer med tynne vegger for optimal avbildning, for eksempel en kanalsklie.
    2. Imaging-protokoll
      1. Slå på det konfokale mikroskopet, og velg et passende mål og ønsket laser og skanner som skal brukes under konfokal mikroskopi.
        MERK: Her, bruk et 60x vann nedsenkingsmål for en oppløsning på 0,08 μm / piksel, og avhengig av boblestørrelsen, bilde et område på 256 x 256 piksler eller 128 x 128 piksler. I disse spesifikke eksperimentene bruker du en 488 nm laser og en Galvano-skanner. Utslippsbølgelengden avhenger av fluorescerende fargestoff og er vanligvis bredbånd.
      2. Finn en mikroboble i lyst felt, og bytt til konfokal mikroskopi. Still inn de ønskede topp- og bunnplanene i mellom hvilke det konfiske mikroskopet skal skannes. Skaff deg en Z-stabel for å observere 3D-strukturen; bruk en trinnstørrelse på 100 nm i Z-retningen.
  2. Mikroskopi i lyse felt
    1. Montering av det optiske systemet
      MERK: En skjematisk representasjon av mikroskopioppsettet for lysfelt vises i figur 3A. For å sikre uforstyrret ultralydutbredelse inneholder vannbadet to åpninger: en for en lyskilde og en for en ultralydtransduser. Det optiske systemet består av et (modulært) mikroskop, et høyhastighetskamera og matchende optikk. Siden perioden med mikrobobble svingninger vanligvis er i størrelsesorden 1 μs (ved hjelp av 1 MHz ultralyd), bør kameraet settes til å ta opp med en bildefrekvens på minst 5 millioner bilder per sekund. Her skal kameraet settes til å ta opp 10 millioner bilder per sekund (256 x 400 piksler) for 256 bilder (25,6 μs) for å fange alle detaljer om bobledynamikken, inkludert høyere harmonikk.
      1. Fest et vanninnlevelsesmål med passende forstørrelse, arbeidsavstand og IT til mikroskopet.
        MERK: Et mål om vanninnlevelse ble brukt til å gi en stabil arbeidsavstand til tross for gradvis fordampning av vannet. Her ble et vanninnlevelsesmål med en forstørrelse på 60x, en arbeidsavstand på 2 mm og en NA på 1 valgt.
      2. Bruk et strobelys med en toppeffekt på minst 1 kW for belysning og et rørobjektiv mellom mikroskopet og kameraet for å sikre at så lite omgivelseslys som mulig når sensoren til høyhastighetskameraet.
      3. Bruk en dimmbar halogenlyskilde for å fokusere på enkle mikrobobler og justering av det optiske og akustiske systemet for sanntidsavbildning.
    2. Montering av det akustiske systemet
      1. Bruk en programmerbar vilkårlig bølgeformgenerator og en effektforsterker (56 dB gevinst) for å drive svingeren med en jevn innhyllepning og bølgeform. Koble et oscilloskop til den vilkårlige bølgeformgeneratoren for å kontrollere signalet. Koble en personlig datamaskin til den vilkårlige bølgeformgeneratoren for å programmere den innkommende akustiske trykkbølgen ved hjelp av et skript skrevet internt.
      2. Bruk en puls-/forsinkelsesgenerator som hovedutløser for å synkronisere de optiske og akustiske systemene. Still inn utløserforsinkelsene på puls-/forsinkelsesgeneratoren og kameraprogramvaren slik at opptaket starter 16 μs etter ultralydoverføring slik at ultralydbølgen når boblene. Utløs lyskilden 1,5 μs før starten av opptaket for å sikre riktig belysning under bobleoscillasjonene (se figur 3B for tidsberegningsdiagrammet).
      3. Velg en passende svinger med en passende senterfrekvens. Plasser den i en åpning av vannbadet, slik at den er i en vinkel med hensyn til den optiske aksen for å minimere refleksjoner fra prøveholdermembranene og for å redusere stående bølgedannelse.
        MERK: Her ble en enkeltelementfokusert nedsenkningstransduser med en senterfrekvens på 2,25 MHz, en brennvidde på 1" og elementdiameter på 0,75" plassert i en vinkel på 35° med hensyn til den optiske aksen. Kalibreringen av overføringsfunksjonen må utføres med samme forsterker som brukes i det akustiske systemet. Kalibrer overføringsfunksjonen fra spenningsamplitude til trykkamplitude av transduseren ved hjelp av en fiberoptisk hydrofon som en funksjon av ultralydoverføringsfrekvensen.
    3. Velge prøveholder
      1. Bruk en prøveholder med optiske og akustisk gjennomsiktige membraner og et volum som er stort nok til å tillate avbildning av flere enkeltmikrobobler i samme prøve.
        MERK: Her ble det brukt en cellekulturkassett med et volum på 10 ml, membranområder på 25 cm2 og membrantykkelse på 175 μm. På grunn av akustiske refleksjoner på den nedre membranen, og forstyrrelser fra bølger reflektert av mikroskopmålet og den øvre membranen, kan in situ akustisk trykk avvike fra det som er programmert på den vilkårlige bølgeformgeneratoren. Plassering av svingeren i en vinkel med hensyn til prøveholdermembranene reduserer stående bølgedannelse, men kan øke refleksjoner fra membranene.
      2. Påse at prøven kan nedsenkes helt og bringes i fokus for både svingeren og mikroskopmålet. Bruk en aluminiumsstøtte festet til et 3D-mikroposisjoneringsstadium for å flytte prøveholderen uavhengig.
    4. Justering av de optiske og akustiske systemene
      1. For at 3D-oversettelsen skal justere oppsettet, fester du vannbadet til et XY-oversettelsesstadium og fester scenen til et optisk bord for å sikre at det ikke beveger seg under eksperimenter. Fyll deretter vannbadet med vann, og slå på den dimmbare halogenlyskilden. Under justeringen flytter du mikroskopmålet til siden for å forhindre ultralydrefleksjoner.
      2. Fest en nålhydrofon (0,2 mm) til prøveholderarmen, og plasser nålhydrofonen i vannbadet, med spissen i sikte. Slå på forsterkeren og den vilkårlige bølgeformgeneratoren; bruk enkeltpulser på 5 til 10 ultralydsykluser og en pulsrepetisjonsfrekvens på 15 Hz. Forsikre deg om at hydrofonspissen er sentrert og i fokus på mikroskopbildet. Beveg tanken i XY-retning og nålen i Z-retning til maksimal trykkamplitude er nådd.
      3. Juster fokuset på mikroskopet for å fokusere på tuppen av hydrofonen.
        MERK: Denne protokollen sikrer justeringen mellom mikroskopfokuset og svingerfokuset. Ikke endre posisjonen til mikroskopet og svingeren etter justering.
    5. Prøvepreparering
      1. Gjenta trinn 2.1.1.1 til og med 2.1.1.3 for å klargjøre prøveløsningen. Fortynn bobleløsningen for å muliggjøre enkeltboblebilder og utelukke akustiske interaksjoner mellom nærliggende bobler.
      2. Åpne uttaket på prøveholderen. Bruk en sprøyte til å injisere prøveløsningen i den andre åpningen på prøveholderen til den er helt fylt. Påse at det ikke er luftbobler inne i prøveholderen for å forhindre uønskede interaksjoner med ultralydfeltet.
      3. Lukk begge ventilene på prøveholderen, og plasser prøveholderen vinkelrett på den optiske aksen.
        MERK: Hold det fylte prøveholdernivået for å unngå at boblene skiftes til den ene siden av prøveholderen under flytting.
    6. Imaging-protokoll
      1. Programmer ønsket ultralyd kjørefrekvens og akustisk trykk i den vilkårlige bølgeformgeneratoren gjennom det nevnte interne skriftlige skriptet.
        MERK: Her var den akustiske trykkbølgen et enkelt utbrudd på 40 sykluser, med en 8-syklus gaussisk-konisk puls. Ultralydfrekvensene som ble brukt i disse eksperimentene var 1 MHz, 2 MHz eller 3 MHz, med akustiske trykkamplituder fra 81 kPa til 1200 kPa.
      2. Flytt prøveholderen som inneholder prøveløsningen, ved hjelp av XYZ-fasen for å finne enkle mikrobobler i fokus for mikroskopet. Start med et synsfelt i et hjørne av prøveholderen, og sørg for at kanten på mikroboblene er godt synlig og i fokus (se figur 3C for en ideell kameravisning).
      3. Fest enden av en optisk fiber som tidligere var koblet til halogenlyset til et strobelys, slik at den andre enden fortsatt er koblet til vannbadet. Utløs innspillingen.
      4. Gjenta trinn 2.2.6.2 til og med 2.2.6.3 så mange ganger som ønsket per ultralydinnstilling (frekvens og akustisk trykk), og flytt cellekulturkassetten som inneholder mikrobubbles minst 2 mm (i fokalplanet) fra forrige sted for å sikre at mikroboblene i synsfeltet ikke blir insonert i tidligere eksperimenter.
        MERK: Her ble hvert eksperiment gjentatt ~ 20 ganger. Når hele prøveholderen er insonifisert, tømmer du prøveholderen og fyller den på med en ny prøveløsning for senere eksperimenter.
    7. Dataanalyse
      1. Ta i bruk et programmeringsmiljø for å utføre dataanalyse i henhold til problemstillingen, og utfør kantdeteksjon etter behandling av bildene. Ved hjelp av en funksjon som måler egenskapene til bilderegioner, finner du centroiden til en boble og derivatet av intensitetsprofilen rundt hver boble for å oppdage boblens kontur (og dermed bobleradiusen R). Trekk ut relevante parametere fra radiusen over tid for enkle mikrobobler.
        MERK: I denne studien ble et programmeringsmiljø brukt til bildebehandling for å binarisere og filtrere opptak av enkle mikrobobler. Et internt skript ble brukt til å finne derivatet av intensitetsprofilen rundt hver boble.
  3. Fluorescensmikroskopi
    1. Montering av det optiske systemet
      1. Bygg oppsettet for fluorescensmikroskopi (figur 4A), med samme base som brukes i lysfeltmikroskopien som er beskrevet i avsnitt 2.2.
        MERK: Oppsettet som er beskrevet i avsnitt 2.3, kan kombineres med det som er beskrevet for lysfeltmikroskopi i avsnitt 2.2. Ved å kombinere både fluorescensmikroskopi og lysfeltmikroskopi kan du visualisere mikrobubblegasskjernen mens du forestiller deg nanopartikkelutløsningen.
      2. Still inn høyhastighetskameraet til å ta opp med 500 000 bilder per sekund (400 x 250 piksler) for 128 bilder (256 μs).
        MERK: Bildetiden er lengre enn i lysfelteksperimentene, da lysintensiteten er begrenset i fluorescens, og fordi tidsskalaen som partikkeltilførselen skjer over, er lengre enn bobledynamikken.
      3. Velg en laser med en effekt som er høy nok til å levere tilstrekkelig lys, og som har en passende eksitasjonsbølgelengde, og sørg for at den er kombinert med en acousto-optisk modulator for å unngå bleking av prøven.
        MERK: I denne studien ble en 5 W kontinuerlig bølgelaser med en eksitasjonsbølgelengde på 532 nm brukt til å begeistre fluorescensen til nanopartiklene.
      4. Plasser en strålesplitter, et dikroisk speil og et hakkfilter mellom laseren og mikroskopet for å lede eksitasjonslyset mot prøven samtidig som fluorescensutslippet kan nå kameraet.
    2. Montering av det akustiske systemet
      1. For å insonifisere mikroboblene, bruk samme akustiske oppsett som i avsnitt 2.2.2. Endre svingeren i disse spesifikke eksperimentene til en enkeltelements, fokusert nedsenkningstransduser med en senterfrekvens på 2,25 MHz, en brennvidde på 1,88", og elementdiameter på 1". Plasser den i en vinkel på 35° med hensyn til den optiske aksen for å minimere refleksjoner fra prøveholdermembranene og redusere stående bølgeformasjoner.
    3. Justering av de optiske og akustiske systemene
      1. Gjenta trinnene som er beskrevet i avsnitt 2.2.4.
    4. Prøvepreparering
      1. Klargjør prøveløsningen som beskrevet i pkt. 2.2.5.
    5. Imaging-protokoll
      1. Still inn ønsket ultralydkjøringsfrekvens og akustisk trykkamplitude på den vilkårlige bølgeformgeneratoren gjennom det nevnte interne skriftlige skriptet.
        MERK: Her ble den akustiske trykkbølgen programmert til å være et enkelt utbrudd av ultralyd på 140 sykluser, med en 10-syklus gaussisk-konisk puls. Lengre pulsvarigheter er generelt nødvendig for å indusere bioeffekter sammenlignet med de som kreves for å studere bobledynamikk. Ultralydfrekvensene som ble brukt i disse eksperimentene var 1 MHz, 2 MHz eller 3 MHz, med akustiske trykkamplituder fra 81 kPa til 1200 kPa.
      2. På puls-/forsinkelsesgeneratoren stiller du inn utløserforsinkelsen for laseren for fluorescerende eksitasjon av nanopartiklene fra mikroboblene under innspillingen.
        MERK: For disse spesifikke eksperimentene var utløserforsinkelsen mellom 20 μs og170 μs for en total varighet på 150 μs. Tidsberegningsdiagrammet vises i figur 4B.
      3. Flytt prøveholderen som inneholder prøveløsningen, ved hjelp av XYZ-fasen for å finne enkle mikrobobler i fokus for mikroskopet. Start med et synsfelt i et hjørne av prøveholderen. se figur 4C for en ideell kameravisning der grensesnittet til mikroboblene er tydelig synlig og i fokus. Utløs innspillingen.
      4. Gjenta trinn 2.3.5.3 så mange ganger som ønsket per ultralydinnstilling (frekvens og akustisk trykk), og flytt cellekulturkassetten som inneholder mikroboblene minst 2 mm (i det optiske planet) fra forrige sted for å sikre at mikrobobler innen synsfeltet ikke sonikeres i tidligere eksperimenter.
        MERK: I denne studien ble hvert eksperiment gjentatt ~ 10-20x. Når hele prøveholderen er insonifisert, tømmer du prøveholderen og fyller den på med en ny prøveløsning for senere eksperimenter. Hvilken avstand prøveholderen skal flyttes mellom eksperimenter, avhenger av den akustiske strålestørrelsen.
    6. Dataanalyse
      1. Analyser fluorescensmikroskopiopptakene i henhold til forskningsspørsmålet. For hver mikrobubble, visuelt avgjøre om levering av nanopartikler i fluorescens mikroskopi eksperimenter skjedde. Hvis det blir observert løsrivelse og avsetning av nanopartiklene fra gasskjernen på prøveholdermembranen for en enkelt mikroboble, må du manuelt angi at leveringen skjedde i programmeringsmiljøet.

3. Intravital mikroskopi

  1. Dorsal hudfold vindu kammer kirurgi (beskrevet tidligere26,47,50)
    1. Akklimatisere dyrene i en uke før du plasserer vinduskamrene. Selv om både kvinnelige og mannlige mus kan brukes, og alderen er uviktig, må du sørge for at musenes vekt er minst 22-24 g slik at huden er tilstrekkelig fleksibel.
    2. Utfør operasjonen under generell anestesi med intraoperativ og postoperativ smertestillende behandling. Bedøv dyret ved en subkutan injeksjon av fentanyl (0,05 mg/kg)/medetomidin (0,5 mg/kg)/midazolam (5 mg/kg)/vann (2:1:2:5) i en dose på 0,1 ml per 10 g vekt. Bruk en varmepute eller en varmelampe for å opprettholde dyrets kroppstemperatur.
    3. Trekk forsiktig på det doble hudlaget på baksiden av dyret slik at huden smøres mellom to symmetriske polyoksymetylenrammer i vinduskammeret. Fest kammeret ved å plassere to skruer som strekker seg gjennom det doble hudlaget og suturere langs den øvre kanten av kammeret.
    4. Fjern huden innenfor kammerets sirkulære ramme på den ene siden av hudfolden. Plasser et dekselglass med en diameter på 11,8 mm innenfor rammen der huden fjernes for å danne et vindu inn i vevet.
    5. Bruk en subkutan injeksjon av atipemazol (2,5 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) og vann (1:1:8) i en dose på 0,1 ml per 10 g som motgift for å avslutte anestesi. Plasser dyret i et oppvarmet gjenopprettingsstativ over natten. Suppler vannet til dyrene med 25 mg/ml enrofloxacin for å forhindre infeksjon på operasjonsstedet.
  2. Svulst modell skapelse
    1. Opprettholde kreftceller ved 37 °C og i en 5 % CO2-atmosfære i egnet kulturmedium supplert med 10 % foster bovint serum og 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin.
      MERK: Den menneskelige osteosarcoma (OHS) cellelinjen ble brukt i denne protokollen, men andre cellelinjer kan også brukes.
    2. På dagen etter trinn 3.1.5 bedøv dyret ved isofluran (5% under induksjon og 1-2% under vedlikehold) i et par minutter. Fjern dekselglasset, bruk 5 × 106 kreftceller i 30 μL cellekulturmedium, og erstatt dekkglasset.
    3. La svulstene vokse i 2 uker før avbildning, og overvåk dyrets vekt og helsestatus minst 3 ganger i uken i denne perioden.
  3. Montering av det optiske systemet
    1. Utfør intravital avbildning under ultralydbehandling (som beskrevet i tidligere arbeid26) med et egnet mikroskop og mål avhengig av problemstillingen som står på spill. Se figur 5A for en skjematisk representasjon av det eksperimentelle oppsettet.
      MERK: For dette spesifikke eksperimentet ble det brukt et multifotonmikroskop, utstyrt med et 20x vanndippingsmål (NA på 1,0 og arbeidsavstand på 2 mm) og en pulserende laser. Bilder ble anskaffet i resonansskanningsmodus med 31 bilder per sekund (512 x 512 piksler) med et synsfelt på 400 x 400 μm2. Eksitasjonsbølgelengden var 790 nm. Filtrene foran de to gallium arsenidfosfid detektorer var langpass 590 nm og band-pass 525/50 nm for påvisning av fluorescens.
  4. Montering av det akustiske systemet
    1. Monter en egnet ultralydtransduser i en bølgeleder (spesiallaget) plassert under målet i en vinkel på 45° med hensyn til den optiske aksen for å minimere refleksjoner fra dekkglasset i det dorsale vindusfoldvinduskammeret og for å redusere stående bølgeformasjoner. Fyll bølgelederen med destillert og avgasset vann. Påfør ultralyd koblingsgel på toppen av bølgelederen.
  5. Justering av de optiske og akustiske systemene
    1. Juster den optiske aksen etter fokuset på ultralydet. Plasser en fiberoptisk hydrofon i fokus for målet. Slå deretter på forsterkeren og den vilkårlige bølgeformgeneratoren for å begeistre svingeren med korte utbrudd (5-10 sykluser) med en pulsrepetisjonsfrekvens på 100 Hz, og flytt ultralydtransduseren til posisjonen der det høyeste trykket oppdages med hydrofonsignalet på oscilloskopet.
      MERK: Ikke endre plasseringen av svingeren etter justering.
  6. Imaging-protokoll
    1. Plasser den oppvarmede dyreholderen (spesialdesignet) koblet til et XY-posisjoneringsstadium mellom bølgelederen og målet, og tilsett mer koblingsgel. Bedøv dyret, og legg et hale venekateter. Plasser musen i den oppvarmede holderen, og fest vinduskammeret i holderen. Legg til en vanndråpe på toppen av dekselslippet i vinduskammeret, og flytt målet på plass for å avbilde tumorvevet.
    2. Figur 5B viser tidsberegningsdiagrammet for forsøkene som viser hendelsesrekkefølgen. Injiser fluorescerende merket 2 MDa dextran intravenøst (30 μL, 4 mg /ml fortynnet i saltvann) for å visualisere vaskulaturen, og flytt musen ved hjelp av XY-oversettelsesstadiet for å finne en posisjon med egnede blodkar. Registrer baseline bilder før ultralydbehandlingen. Juster bildefrekvens, synsfelt og lengde på opptak avhengig av problemstillingen og spesifikasjonene til mikroskopet og fargestoffene som skal avbildes.
      MERK: I disse eksperimentene ble 31 bilder per sekund registrert med et synsfelt på 400 x 400 μm2, og bildebehandling ble gjort kontinuerlig i 5 minutter.
    3. Still inn ønsket ultralydkjøringsfrekvens, pulslengde og akustisk trykkamplitude på den vilkårlige bølgeformgeneratoren.
      MERK: For disse eksperimentene ble en frekvens på 1 MHz brukt med en pulslengde på 10 ms og topp negative trykkamplituder mellom 0,2 MPa og 0,8 MPa. En pulsrepetisjonsfrekvens på 0,5 Hz eller 0,1 Hz ble brukt til å tillate nye mikrobobler å reperfusere inn i det behandlede området mellom ultralydpulser.
    4. Injiser 50 μL mikrobobler (2 × 108 til 5 × 108 mikrobobler/ml) intravenøst, og påfør ultralyd under avbildning, som beskrevet i26.
  7. Dataanalyse
    1. Avhengig av problemstillingen, analyser bilder med (åpen kildekode) bildebehandlingsprogramvare og et programmeringsmiljø, som beskrevet i26, for å bestemme blodkarparametere (diameter, forgrening, strømningshastighet og retning), opphopning av nanopartikler i karene, og kinetikk og penetrasjonsdybde for ekstravasasjon av dekstran og nanopartikler i tumorvev.

Representative Results

Mikroboblene, produsert som beskrevet i protokollen, ble analysert ved hjelp av ulike mikroskopimetoder og på ulike tidsskalaer.

Nanopartiklenes fluorescens i konfokal mikroskopi (figur 6A) indikerer at skallet har en ikke-jevn partikkelfordeling. Andre mikroskopimetoder kan brukes til boblekarakterisering. Figur 6B viser for eksempel mikrobubblens overordnede struktur ved hjelp av skanningselektronmikroskopi, som presentert i tidligere work34.

Radial dynamikk og fenomenologisk bobleoppførsel kan studeres ved hjelp av den beskrevne in vitro bright-field mikroskopimetoden der mikrobobler ble avbildet med 10 millioner bilder per sekund. Radiusen til enkle mikrobobler ble hentet ut over tid ved hjelp av et skript skrevet internt. Et eksempel på en slik radial respons er vist i figur 7.

En bildesekvens av typisk vellykket nanopartikkellevering, som beskrevet i pkt. 2.3.6, er vist i figur 8A. Nanopartiklene som er innebygd i mikrobubble-skallet, kan ses for å lyse opp på grunn av fluorescens når laserlyset når boblen. Drevet av ultralydinsonasjon løsner de fluorescerende nanopartiklene fra mikrobubbles gasskjernen og avsettes på membranen til prøveholderen. Til slutt er laseren slått av, og de fluorescerende nanopartiklene er ikke lenger begeistret. Mislykket levering av den fluorescerende merkede nyttelasten til mikrobubbles ser vanligvis ut som bildesekvensen vist i figur 8B, der fluorescerende nanopartikler lyser opp på skallet på mikrobubble som forblir intakt under ultralydeksponering.

Sanntids intravital multifotonmikroskopi under ultralyd ble brukt til å undersøke effekten av ultralyd og mikrobobler på nanopartikkeladferd i blodet, forbedring av permeabiliteten av tumorblodkar og forbedring av levering av nanopartikler. Omfanget og kinetikken til penetrasjon i den ekstracellulære matrisen som en funksjon av akustisk trykk, frekvens og pulslengder kan karakteriseres. Effekten av ultralydbehandlingen kan variere med hensyn til størrelsen og morfologien til karene og resulterende innesperring av boblen. Hvordan ultralydbehandlingen påvirker blodstrømmen og retningen kan bestemmes. Et eksempeleksperiment som viser ekstravasasjon av nanopartikler over tid, vises i figur 9 ved en mekanisk indeks (MI) på 0,826. Resultater av intravital multifotonmikroskopi belyser romlig og tidsmessig ekstravasasjon av nanopartikler under ultralydeksponering, noe som er svært gunstig for fullstendig forståelse av mekanismene som ligger til grunn for ultralydmediert levering av nanopartikler og for å optimalisere slike teknologier26.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av en mikrobubble med et skall av fluorescerende merkede polymere nanopartikler i denaturert kasein. Mikroboblene er vanligvis mellom 1 μm og 10 μm i diameter. Nanopartiklene har en diameter på for det meste mellom 100 nm og 200 nm38. Forkortelse: C3F8 = perfluoropropangass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt som viser relevante tids- og lengdeskalaer for lysfelt, fluorescens, konfokal og intravital mikroskopi.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk representasjon av lysfeltmikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentelt oppsett, (B) tidsberegningsdiagrammet og (C) en typisk innspilt ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer per sekund. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk fremstilling av fluorescensmikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentelt oppsett, (B) tidsberegningsdiagrammet og (C) en typisk innspilt ramme. Skalastang i (C) = 10 μm. Forkortelse: fps = rammer per sekund. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skjematisk representasjon av intravitale mikroskopieksperimenter. (A) Eksperimentelt oppsett, (B) tidsberegningsdiagrammet og (C) en typisk innspilt ramme. Skalastang i (C) = 50 μm. Grønn tilsvarer dextran-FITC og rød til nanopartikler. Forkortelse: GaAsP = gallium arsenid fosfid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: 3D-struktur av en enkelt nanopartikkel- og proteinstabilisert mikroboble. (A) Bruke konfokalmikroskopi til å vise nanopartiklene, og (B) bruke et skanningselektronmikroskop for å vise 3D-strukturen. (B) har blitt reprodusert med tillatelse fra34. Skalastang i (A) = 5 μm; skala bar i (B) = 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Typiske sfæriske svingninger av en radius på 2,89 μm nanopartikler og proteinstabiliserte mikrobobler som er insonifisert med en ultralydfrekvens på 1 MHz og en akustisk trykkamplitude på 142 kPa. (A-D) Bilder fra høyhastighetsopptaket og den tilsvarende bobleradiusen over tidskurven (bunnen). Skalastolper = 5 μm, og den røde linjen angir den opprinnelige radiusen. Belysningsprofilen (vilkårlige enheter) indikeres med gult. Forstørrelsen er 120x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Bildesekvens fra høyhastighets fluorescensmikroskopi. (A) Vellykket levering av fluorescerende merkede nanopartikler av en nanopartikkel- og proteinstabilisert mikrobubble insonert med en ultralydfrekvens på 2 MHz og en akustisk trykkamplitude på 600 kPa. (B) Mislykket levering av fluorescerende merkede nanopartikler av en nanopartikkel-og-protein-stabilisert mikrobubble insonifisert ved en ultralydfrekvens på 2 MHz og en akustisk trykkamplitude på 210 kPa. Skalastenger = 10 μm. Forstørrelsen er 120x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Intravital mikroskopi etter insonasjon av nanopartikkel- og proteinstabiliserte mikrobobler med en ultralydfrekvens på 1 MHz og en akustisk trykkamplitude på 800 kPa. (A) Nanopartikler i karet, og (B) en bildesekvens av området angitt av den hvite stiplede firkanten i (A) som viser ekstravasasjonen av dekstran (grønn) og nanopartikler (rødpartikler). Skalastenger = 50 μm. Forstørrelsen er 20x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Ulike optiske mikroskopimetoder ble kombinert for å få informasjon om de ulike trinnene i levering av nanopartikler fra overflaten av mikrobobler til det omkringliggende mediet. Avbildning av bobleoscillasjonene ble utført, samt avbildning av frigjøringen av nanopartiklene fra bobleskallet, ekstravasasjonen og penetrasjonen gjennom den ekstracellulære matrisen av svulster in vivo. In vitro-avbildning muliggjør screening av mange ultralydparametere sammenlignet med de mer komplekse in vivo-oppsettene . Fordelen med å kombinere dette spekteret av bildemodaliteter er den komplementære informasjonen som kan oppnås på forskjellige tidsskalaer - en funksjon som er avgjørende for å karakterisere og optimalisere mikroboblene for vellykket levering og for å oppnå terapeutisk effekt. Denne tilnærmingen er nyttig for å forstå leveringsmekanismene for alle mikrobobler, inkludert konstruksjoner med fluorescerende merkede nanopartikler og stoffer.

De mest kritiske trinnene i mikroskopimetodene som brukes til å studere enkle mikrobobler er som følger. For fluorescensmikroskopi bør nanopartiklene være fluorescerende merket for å muliggjøre visualisering av partikkelutløsningen. Videre bør prøveløsningen fortynnes nok til å isolere enkle mikrobobler for analyse i konfiskerings-, lysfelt- og fluorescensmikroskopimetoder. I tillegg er det viktig å velge en ultralyd kjørefrekvens og akustisk trykk for å begeistre boblene mest effektivt, nemlig ved resonans. Hvis forskningsspørsmålet gjelder levering av nanopartikkelnyttelasten, bør de aktuelle ultralydparametrene være en del av undersøkelsen. Ved siden av resonans bør disse boblene også kjøres på eller utenfor terskelen for nanopartikkelutløsning, vanligvis ved relativt høye akustiske trykkamplituder (MI > 0,3)51. For lysfeltmikroskopiavbildning er det viktig å velge et høyhastighetskamera med tilstrekkelig høy bildefrekvens for å minimere bevegelsesuskarphet og for å unngå alias.

Bright-field mikroskopi er hovedsakelig begrenset av bildefrekvensen og intensiteten til lyskilder som er tilgjengelige, da en høyere bildefrekvens vil gi en mer detaljert tids løst innsikt i bobledynamikken, men krever mer intens belysning på grunn av kortere eksponeringstider. For å studere partikkelutgivelse mer detaljert, kan bildefrekvensen for fluorescensavbildning i prinsippet økes ved å øke intensiteten til laserlyset. Imidlertid genererer absorpsjon av høyintensitets laserlyset av de fluorescerende merkede mikroboblene varme, selv med høye kvanteutbyttefarger. Denne varmen kan forstyrre forsøkene som står på spill, og i ekstreme tilfeller indusere foto-termisk kavitasjon52. Dermed er det i praksis en grense for den påførte laserfluensaen. Imidlertid kan intens laserbelysning også bevisst brukes til å indusere partikkelfrigjøring fra liposomer53. Temperatur påvirker bobledynamikk og ultralydrespons, avhengig av bobletype54. Derfor, hvis in vitro og intravitale metoder skal sammenlignes objektivt, bør in vitro-metodene som er diskutert i protokollen utføres ved 37 °C. En annen begrensning ved in vitro-metodene som er omtalt i dagens papir, er at boblene ikke er i et frifeltmiljø, da mikrobobler vil flyte under prøveholdermembranen. Videre er det en utvalgsbias når du ser på enkle mikrobobler. Men å utføre gjentatte eksperimenter på enkeltbobler gjør det mulig å undersøke effekten av størrelse og fjerning av den forvirrende faktoren - størrelsesfordelingen. Hvis bobleresponsen som en funksjon av størrelse kan forstås mens konsentrasjonen ikke er for høy for å forhindre boblebobleinteraksjoner, kan responsen til enhver vilkårlig boblepopulasjon beregnes. Til slutt gir både lysfelt- og fluorescensmikroskopimetoder innsikt i mikrobobler innviklet i et todimensjonalt (2D) bilde. Hvis forskningsspørsmålet krever mer enn 2D-bildebehandling, kan 3D-virkemåten til boblene løses ved å kombinere oppsettet som er beskrevet i protokollen, med et sidevisningsoppsett for flerplanavbildning55.

En alternativ metode for å studere mikrobobler er akustisk karakterisering56. Måling av ekkoet av en enkelt mikroboble krever imidlertid å finne og isolere en enkelt mikroboble i ultralydstrålen56, noe som utgjør en utfordring som vanligvis håndteres ved bruk av et smalt rør eller optisk eller akustisk pinsett57,58. For å størrelsesbobler akustisk, kan mikroboblene insoneres i det geometriske spredningsregimet ved frekvenser mye høyere enn resonansfrekvensen, noe som ikke induserer volumetriske mikrobubble oscillasjoner59. Bruken av et "akustisk kamera" er en slik metode for å avbilde radialdynamikken til enkle mikrobobler som respons på ultralyd, hvor en høyfrekvent ultralydsonde brukes til å bestemme boblens radiale respons på en lavfrekvent kjørebølge60. Ulempen med denne metoden er at den bare kan brukes til å bestemme den relative endringen av mikrobubble radiusen; Derfor er det nødvendig med en annen metode for å bestemme den absolutte bobleradiusen, for eksempel gjennom optisk bildebehandling61,62. Ulempen med metoder der mikrobobler er utsatt for ultralyd ved frekvenser høyere enn resonansfrekvensen, er at ved så høye frekvenser reduseres penetrasjonsdybden59, noe som begrenser brukervennligheten for in vivo-applikasjoner. Andre former for mikroskopi kan også brukes til å studere mikrobobler som skanning av elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi63. Den oppnåelige rom-temporale oppløsningen av disse alternative mikroskopiteknikkene er imidlertid generelt mer begrenset, og disse teknikkene har ulempen at avbildning utføres enten før eller etter ultralydeksponering ved off-line analyse og vanligvis presenterer en lav gjennomstrømning63. Et annet alternativ er å bruke en lett spredningsmetode, som kan brukes til å studere radial dynamikk av enkeltmikrobobler i sanntid, men har et lavt signal-til-støy-forhold sammenlignet med akustiske spredningsmetoder64.

Intravital mikroskopi i sanntid under ultralydeksponering er en kraftig metode for å skaffe seg ny innsikt i vaskulaturen, oppførselen til mikrobobler, nanopartikler eller andre molekyler (som dekstran i dette tilfellet) under ultralydeksponering. En generell begrensning når du utfører intravital mikroskopi i sanntid, er at bare et lite område av vevet er avbildet, og lysets penetrasjonsdybde i vev er begrenset. Hvis de avbildede fartøyene inneholder svært få mikrobobler og/eller nanopartikler innen synsfeltet, kan det innhentes lite eller ingen informasjon om nanopartikkeladferd og ekstravasasjon. I tillegg, på grunn av det begrensede synsfeltet, er en riktig justering mellom lys- og ultralydbanene avgjørende. Hvis ultralydtrykket er høyt nok til å indusere bobleødeleggelse, er det også viktig å velge en pulsrepetisjonsfrekvens som gjør at friske bobler kan reperfuse inn i synsfeltet mellom ultralydpulser. Videre, da ultralydet vil bli reflektert fra dekkglasset i vinduskammeret og målet, er det viktig å plassere svingeren i en vinkel for å redusere refleksjoner for å forhindre dannelse av stående bølger, noe som forvrenger det kalibrerte trykkfeltet. Et annet praktisk problem er at oppsettet må ha tilstrekkelig plass til å montere ultralydtransduseren og bølgelederen over eller under målet i mikroskopoppsettet. Svulstene i dorsal vinduskammeret vil ha en begrenset tykkelse på grunn av innesperringskammeret og dekselslippet; Om nødvendig kan imidlertid andre modeller brukes. Eksempler er hudfoldsvulster, for eksempel i pattedyrfettputen65 eller abdominal intravital avbildning av svulster i de forskjellige organene66. Slike svulster kan dyrkes ortopisk i riktig mikromiljø, og som sådan presentere et mer klinisk relevant tilfelle.

Metodene beskrevet i dette arbeidet opplyser potensialet til fluorescerende merkede mikrobobler for å studere det grunnleggende om legemiddelleveringsapplikasjoner ved hjelp av bobler og ultralyd. Denne kombinasjonen av mikroskopimetoder gir verdifull innsikt i mikrobubble responsen på ultralydinsonasjon og tilhørende akustisk parameterplass og presenterer et klart syn på mikrobubble og nyttelastadferd over et relevant spekter av tids- og lengdeskalaer.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 Tabor Electronics Arbitrary waveform generator (programmable)
2100 L ENI Amplifier, used in window chamber setup
2 MDa dextran Sigma-Aldrich
33522 A Agilent Technologies Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup
A1R Nikon Instruments Confocal microscope
ACE I SCHOTT Dimmable AC halogen light source
Atipemazol Orion Pharma Antidote to wake animal
Baytril Bayer Enrofloxacin
BD Neoflon 24 G Becton Dickinson & Company Tail vein catheter
BNC model 575 Berkely Nucleonics Corporation Pulse/delay generator
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Branson Ultrasonic bath
Channel slide Ibidi
CLINIcell 25 Laboratoires Mabio International Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm)
Cohlibri Lightline Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix Oscilloscope
Fentanyl Actavis Group HF Anaesthesia of mouse
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich Supplement for cell culture medium
Fiber-optic hydrophone Precision Acoustics Used for alignment
Flumanezil Fresenius Kabi Antidote to wake animal
Heated animal holder Custom design A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber
Hyper Vision HPV-X2 Shimadzu High-speed camera
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin open source image processing program
In vivo SliceScope Scientifica Multiphoton microscope
Isoflurane Baxter
ISOTON Beckman Coulter Filtered, phosphate-buffered saline solution
LUMPLFLN60XW Olympus Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)
MaiTai DeepSee Spectra-Physics Pulsed laser
MATLAB Mathworks Programming environment
Medetomidine Orion Pharma Anesthesia of mouse
Midazolam Accord Healthcare Limited Anesthesia of mouse
Milli-Q Merck Ultrapure water
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe PerkinElmer Strobe light
Panametrics-NDT C305 Olympus Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1")
Panametrics-NDT V304 Olympus Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25")
Penicillin Sigma-Aldrich Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
Perfluoropropane gas F2 Chemicals
Roswell Park Memorial Institute 1640 Gibco Thermo-Fisher Cell culture medium
Safe-Lock tube Eppendorf
Streptomycin Sigma-Aldrich Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
T 25 basic ULTRA-TURRAX IKA laboratory technology Dispersion tool
TDS 210 Tektronix Oscilloscope, used in window chamber setup
Transducer Precision Acoustics Ltd Used in window chamber setup
U-TLU Olympus Tube lens
VBA100-200 Vectawave Amplifier
Window chambers Custom made Used in window chamber setup
XLUMPLFLN20 XW Olympus 20x water dipping objective
XY(Z) translation stages Thorlabs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, T. L. Diagnostic ultrasound imaging: inside out. , Academic Press. (2004).
  2. Paefgen, V., Doleschel, D., Kiessling, F. Evolution of contrast agents for ultrasound imaging and ultrasound-mediated drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 197 (2015).
  3. Versluis, M., Stride, E., Lajoinie, G., Dollet, B., Segers, T. Ultrasound contrast agents modeling. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (9), 2117-2144 (2020).
  4. Coelho-Filho, O. R., Rickers, C., Kwong, R. Y., Jerosch-Herold, M. MR myocardial perfusion imaging. Radiology. 266 (3), 701-715 (2013).
  5. Pandharipande, P. V., Krinsky, G. A., Rusinek, H., Lee, V. S. Perfusion imaging of the liver: current challenges and future goals. Radiology. 234 (3), 661-673 (2005).
  6. Weidner, N., Carroll, P. R., Flax, J., Blumenfeld, W., Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. The American Journal of Pathology. 143 (2), 401-409 (1993).
  7. Quaia, E. Classification and safety of microbubble-based contrast agents. Contrast Media in Ultrasonography. Medical Radiology (Diagnostic Imaging). Quaia, E. , Springer. Berlin, Heidelberg. 3-14 (2005).
  8. Unger, E. C., Porter, T., Culp, W., Labell, R., Matsunaga, T., Zutshi, R. Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (9), 1291-1314 (2004).
  9. Blomley, M. J. K., Cooke, J. C., Unger, E. C., Monaghan, M. J., Cosgrove, D. O. Microbubble contrast agents: a new era in ultrasound. BMJ. 322 (7296), 1222-1225 (2001).
  10. Faez, T., et al. 20 years of ultrasound contrast agent modeling. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency control. 60 (1), 7-20 (2012).
  11. De Jong, N., Emmer, M., Van Wamel, A., Versluis, M. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Medical & Biological Engineering & Computing. 47 (8), 861-873 (2009).
  12. De Jong, N. Acoustic properties of ultrasound contrast agents. , (1993).
  13. Schneider, M. Characteristics of sonovueTM. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
  14. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  15. Averkiou, M. A., Powers, J., Skyba, D., Bruce, M., Jensen, S. Ultrasound contrast imaging research. Ultrasound Quarterly. 19 (1), 27-37 (2003).
  16. Snipstad, S., et al. Contact-mediated intracellular delivery of hydrophobic drugs from polymeric nanoparticles. Cancer Nanotechnology. 5 (1), 8 (2014).
  17. Epstein, P. S., Plesset, M. S. On the stability of gas bubbles in liquid-gas solutions. The Journal of Chemical Physics. 18 (11), 1505-1509 (1950).
  18. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  19. Deshpande, N., Needles, A., Willmann, J. K. Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Clinical Radiology. 65 (7), 567-581 (2010).
  20. Miller, M. W., Miller, D. L., Brayman, A. A. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Medicine & Biology. 22 (9), 1131-1154 (1996).
  21. Snipstad, S., et al. Sonopermeation to improve drug delivery to tumors: from fundamental understanding to clinical translation. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (12), 1249-1261 (2018).
  22. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  23. May, J. -N., et al. Multimodal and multiscale optical imaging of nanomedicine delivery across the blood-brain barrier upon sonopermeation. Theranostics. 10 (4), 1948-1959 (2020).
  24. Carmen, J. C., et al. Ultrasonic-enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Journal of Infection and Chemotherapy. 10 (4), 193-199 (2004).
  25. Runyan, C. M., et al. Low-frequency ultrasound increases outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa. The Journal of General and Applied Microbiology. 52 (5), 295-301 (2006).
  26. Yemane, P. T., et al. Effect of ultrasound on the vasculature and extravasation of nanoscale particles imaged in real time. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (11), 3028-3041 (2019).
  27. van Wamel, A., et al. Acoustic Cluster Therapy (ACT) enhances the therapeutic efficacy of paclitaxel and Abraxane® for treatment of human prostate adenocarcinoma in mice. Journal of Controlled Release. 236, 15-21 (2016).
  28. Snipstad, S., et al. Ultrasound improves the delivery and therapeutic effect of nanoparticle-stabilized microbubbles in breast cancer xenografts. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  29. Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
  30. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  31. Aslund, A. K. O., et al. Nanoparticle delivery to the brain-By focused ultrasound and self-assembled nanoparticle-stabilized microbubbles. Journal of Controlled Release. 220, 287-294 (2015).
  32. Downs, M. E., Buch, A., Karakatsani, M., Konofagou, E. E., Ferrera, V. P. Blood-brain barrier opening in behaving non-human primates via focused ultrasound with systemically administered microbubbles. Scientific Reports. 5, 15076 (2015).
  33. Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
  34. Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103 (2019).
  35. Lentacker, I., et al. Lipoplex-loaded microbubbles for gene delivery: a Trojan Horse controlled by ultrasound. Advanced Functional Materials. 17 (12), 1910-1916 (2007).
  36. De Temmerman, M., et al. mRNA-Lipoplex loaded microbubble contrast agents for ultrasound-assisted transfection of dendritic cells. Biomaterials. 32 (34), 9128-9135 (2011).
  37. Burke, C. W., Alexander, E., Timbie, K., Kilbanov, A. L., Price, R. J. Ultrasound-activated agents comprised of 5FU-bearing nanoparticles bonded to microbubbles inhibit solid tumor growth and improve survival. Molecular Therapy. 22 (2), 321-328 (2014).
  38. Mørch, Ý, et al. Nanoparticle-stabilized microbubbles for multimodal imaging and drug delivery. Contrast Media & Molecular Imaging. 10 (5), 356-366 (2015).
  39. Jamburidze, A., et al. Nanoparticle-coated microbubbles for combined ultrasound imaging and drug delivery. Langmuir. 35 (31), 10087-10096 (2019).
  40. Snipstad, S., et al. Sonopermeation enhances uptake and therapeutic effect of free and encapsulated cabazitaxel. Ultrasound in Medicine and Biology. , (2021).
  41. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  42. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
  43. Klymchenko, A. S., et al. Highly lipophilic fluorescent dyes in nano-emulsions: towards bright non-leaking nano-droplets. RSC Advances. 2 (31), 11876 (2012).
  44. Aslund, A. K. O., et al. Quantification and qualitative effects of different PEGylations on Poly (butyl cyanoacrylate) Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 14 (8), 2560-2569 (2017).
  45. Born, M., Wolf, E. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge; New York. (1999).
  46. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  47. Hak, S., Reitan, N. K., Haraldseth, O., de Lange Davies, C. Intravital microscopy in window chambers: a unique tool to study tumor angiogenesis and delivery of nanoparticles. Angiogenesis. 13 (2), 113-130 (2010).
  48. Fusser, M., et al. Cabazitaxel-loaded Poly (2-ethylbutyl cyanoacrylate) nanoparticles improve treatment efficacy in a patient derived breast cancer xenograft. Journal of Controlled Release. 293, 183-192 (2019).
  49. Abou-Saleh, R. H., et al. Molecular effects of glycerol on lipid monolayers at the gas-liquid interface: impact on microbubble physical and mechanical properties. Langmuir. 35 (31), 10097-10105 (2019).
  50. Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e55115 (2018).
  51. Luan, Y., et al. Lipid shedding from single oscillating microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (8), 1834-1846 (2014).
  52. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 1-8 (2014).
  53. Mathiyazhakan, M., et al. Non-invasive controlled release from gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes through pulse laser induced microbubble cavitation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 126, 569-574 (2015).
  54. Vos, H. J., Emmer, M., de Jong, N. Oscillation of single microbubbles at room versus body temperature. 2008 IEEE Ultrasonics Symposium. , 982-984 (2008).
  55. Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall-a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
  56. Sijl, J., et al. Acoustic characterization of single ultrasound contrast agent microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (6), 4091-4097 (2008).
  57. Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90 (11), 114103 (2007).
  58. Baresch, D., Garbin, V. Acoustic trapping of microbubbles in complex environments and controlled payload release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15490-15496 (2020).
  59. Maresca, D., et al. Acoustic sizing of an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (10), 1713-1721 (2010).
  60. Renaud, G., Bosch, J. G., vander Steen, A. F. W., de Jong, N. An "acoustical camera" for in vitro characterization of contrast agent microbubble vibrations. Applied Physics Letters. 100 (10), 101911 (2012).
  61. Renaud, G., Bosch, J. G., Van Der Steen, A. F. W., De Jong, N. Low-amplitude non-linear volume vibrations of single microbubbles measured with an "acoustical camera.". Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (6), 1282-1295 (2014).
  62. Luan, Y., et al. Combined optical sizing and acoustical characterization of single freely-floating microbubbles. Applied Physics Letters. 109 (23), (2016).
  63. Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: Fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10 (1), 011501 (2016).
  64. Guan, J., Matula, T. J. Using light scattering to measure the response of individual ultrasound contrast microbubbles subjected to pulsed ultrasound in vitro. The Journal of the Acoustical Society of America. 116 (5), 2832-2842 (2004).
  65. Sofias, A. M., Åslund, A. K. O., Hagen, N., Grendstad, K., Hak, S. Simple and robust intravital microscopy procedures in hybrid TIE2GFP-BALB/c transgenic mice. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 486-493 (2020).
  66. Ritsma, L., Steller, E. J. A., Ellenbroek, S. I. J., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. M., van Rheenen, J. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).

Tags

Bioengineering Utgave 172 ultralyd ultralydkontrastmidler legemiddellevering lysfeltmikroskopi fluorescensmikroskopi intravital mikroskopi konfektmikroskopi
Multi-tidsskala mikroskopi metoder for karakterisering av fluorescerende merket mikrobobler for ultralyd-utløst legemiddel frigjøring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nawijn, C., Segers, T., Lajoinie,… More

Nawijn, C., Segers, T., Lajoinie, G., Mørch, Ý., Berg, S., Snipstad, S., de Lange Davies, C., Versluis, M. Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release. J. Vis. Exp. (172), e62251, doi:10.3791/62251 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter