Summary
De presenterade protokollen kan användas för att karakterisera svaret av fluorescerande märkta mikrobubblor utformade för ultraljud-utlösta läkemedelsleveransapplikationer, inklusive deras aktiveringsmekanismer samt deras bioeffects. Detta dokument täcker en rad in vitro- och in vivo-mikroskopitekniker som utförs för att fånga relevanta längd- och tidsskalor.
Abstract
Microbubble kontrastmedel håller stort löfte för läkemedelsleverans applikationer med ultraljud. Inkapsling av läkemedel i nanopartiklar minskar systemisk toxicitet och ökar cirkulationstiden för drogerna. I en ny metod för mikrobubble-assisterad läkemedelsleverans, nanopartiklar införlivas i eller på microbubble skal, vilket möjliggör lokal och utlöst frisättning av nanopartikel nyttolasten med ultraljud. En grundlig förståelse av frisättningsmekanismerna inom det stora ultraljudsparameterutrymmet är avgörande för effektiv och kontrollerad frisättning. Denna uppsättning presenterade protokoll är tillämpliga på mikrobubblor med ett skal som innehåller en fluorescerande etikett. Här ligger fokus på mikrobubblor laddade med poly(2-etyl-butylcyanoakrylat) polymera nanopartiklar, dopade med ett modifierat Nile Red-färgämne. Partiklarna fixeras i ett denaturerat kaseinskal. Mikrobubblorna produceras genom kraftig omrörning och bildar en spridning av perfluorpropangas i vätskefasen som innehåller kasein och nanopartiklar, varefter mikrobubbleskalet självmonteras. En mängd olika mikroskopitekniker behövs för att karakterisera nanopartikelstabiliserade mikrobubblor vid alla relevanta tidsskalor i nanopartikelfrisättningsprocessen. Fluorescens av nanopartiklarna möjliggör konfokal avbildning av enstaka mikrobubblor, vilket avslöjar partikelfördelningen i skalet. In vitro ultra-höghastighets avbildning med ljusfält mikroskopi vid 10 miljoner bilder per sekund ger insikt i bubbla dynamiken som svar på ultraljuds insonation. Slutligen visualiseras nanopartikelfrisättning från bubbelskalet bäst med hjälp av fluorescensmikroskopi, utförd vid 500 000 bilder per sekund. För att karakterisera läkemedelsleverans in vivo studeras den utlösta frisättningen av nanopartiklar inom vaskulaturen och deras extravasation bortom endotelskiktet med intravital mikroskopi i tumörer implanterade i dorsala hudveck fönsterkammare, över en tidsskala på flera minuter. Kombinationen av dessa kompletterande karakteriseringstekniker ger unik inblick i beteendet hos mikrobubblor och deras nyttolastutgivning på en rad tids- och längdskalor, både in vitro och in vivo.
Introduction
Ultraljud är den mest använda medicinska bildtekniken. Det är icke-invasivt, snabbt, säkert, kostnadseffektivt och bärbart1,2,3. Blod är dock en dålig ultraljudsspridare, och kontrasten i blodpoolen kan förbättras genom en intravenös injektion av ultraljud kontrastmedel3. Denna förbättrade blodpoolkontrast möjliggör kvantifiering av organperfusion för diagnostiska ändamål, t.ex. vid påvisande av kranskärlssjukdom4 och metastaserad leversjukdom5. Tumör vaskulatur visade sig vara en viktig prognostisk faktor6. En stor forskningsinsats riktas nu mot mikrobubble-assisterade, riktade molekylära avbildningar och skräddning av kontrastmedel för terapeutisk användning.
Kommersiellt tillgängliga ultraljud kontrastmedel består vanligtvis av en suspension av belagda mikrobubblor7,8 med diametrar som sträcker sig från 1 μm till 10 μm9. Eftersom ultraljud kontrastmedel mikrobubblor är något mindre än röda blodkroppar7, kan mikrobubblorna säkert nå även de minsta kapillärerna utan att skapa en ocklusion3. Microbubbles har en dramatiskt ökad ultraljud backscattering koefficient jämfört med vävnad10, på grund av deras komprimerbara gas core11. Dessutom är mikrobubbleekoet mycket ickelinjärt, dvs. Dessutom är ekostyrkan starkt beroende av den resonanta reaktionen från bubblan12. Medan vävnaden endast sprider sig linjärt, är ett litet antal mikrobubblor tillräckliga för att uppnå en hög detektionskänslighet vid harmonisk avbildning13,14. Denna icke-linjära kontrastgenerering kan till och med vara tillräckligt stark för att spåra enstaka bubblor i kroppen15.
Skalet av ultraljud kontrastmedel stabiliserar bubblorna mot upplösning och coalescence, vilket ökar deras cirkulationstid i blodpoolen16. Skalet kan bestå av lipider, polymerer eller denaturerade proteiner3,8. Det minskar den interfacial spänningen, vilket begränsar effekten av Laplace tryckdriven upplösning17 och skapar en resistiv barriär mot gasspridning18. För att ytterligare öka stabiliteten fylls kontrastmikrobubblorna vanligtvis med en gas med hög molekylvikt med låg löslighet i blod11. Microbubble skal förändrar dramatiskt svaret av microbubbles till ultraljud insonation11. Obelagda gasbubblor har en karakteristisk resonansfrekvens som är omvänt proportionell mot deras storlek och tillsatsen av en lipidbeläggning ökar resonansfrekvensen med avseende på en obestruken bubbla på grund av skalets inneboende styvhet. Dessutom avleder skalet energi genom dilatationell viskositet, vilket utgör den dominerande källan till dämpning för belagda bubblor3. Stabiliseringsskalet har den extra fördelen att det kan funktionaliseras, t.ex. genom att binda inriktningen på ligands till ytan av mikrobubblor. Denna inriktning möjliggör många tillämpningar för dessa bubblor och i synnerhet molekylär avbildning med ultraljud14,19.
Microbubble kontrastmedel håller stort löfte för läkemedelsleverans applikationer med ultraljud. Mikrobubblor som oscillerar i inneslutningen av ett blodkärl kan orsaka mikroströming samt lokala normala och skjuvningsspänningar på kapillärväggen3. Vid högt akustiskt tryck kan stora amplitudsvängningar leda till mikrobubble kollaps i en våldsam process som kallas inertiell kavitation, vilket i sin tur kan leda till bristning eller invagination av blodkärlet20. Dessa våldsamma fenomen kan inducera bioeffects såsom sonopermeation21, förbättra extravasation av terapeutiska läkemedel i interstitium över endotelväggen, antingen paracellulärt eller transcellularly. det kan också förbättra penetrationen av terapeutiska medel genom den extracellulära matrisen av stroma-rika tumörer21,22 och biofilmer23,24, även om denna mekanism fortfarande är dåligt förstådd26.
Ultraljudsmedierad läkemedelsleverans har visat lovande resultat både prekliniskt27,28 och i kliniska prövningar22. Dessutom, när de används med relativt lågfrekvent ultraljud (~ 1 MHz), mikrobubblor har rapporterats för att lokalt och tillfälligt öka blod - hjärnbarriären permeabilitet, vilket gör det möjligt för läkemedel att komma in i hjärnan parenkym, både i prekliniska och kliniska studier29,30,31,32,33,34.
Det finns i allmänhet två metoder för ultraljudsmedierad läkemedelsleverans: det terapeutiska materialet kan administreras tillsammans med bubblorna, eller det kan fästas vid eller laddas i bubbelskalet28,35,36. Det andra tillvägagångssättet har visat sig vara mer effektivt när det gäller läkemedelsleverans37. Mikrobubblor kan laddas med läkemedel eller genetiskt material inkapslat i nanopartiklar (liposomer eller polymera nanokonstruktioner) som fästs på skalet eller införlivas direkt i mikrobubbleskalet35,36. Nanopartikelbelastade mikrobubblor kan aktiveras med (fokuserad) ultraljud för att lokalt frigöra nanopartikelns nyttolast28,33,38,39,40. Om en sådan mikrobubble är i direkt kontakt med en cell har det visats in vitro att nyttolasten till och med kan deponeras på cellens cytoplasmiska membran i en process som kallas sonoprinting34,35.
Ultraljud parameter utrymme för microbubble insonation är omfattande, och in vivo biologiska villkor ytterligare lägga komplexitet. Således utgör kombinationen av fokuserad ultraljud och nanopartikel-laddade mikrobubblor en utmaning inom området riktade terapier.
Syftet med detta arbete är att tillhandahålla protokoll som kan användas för att i detalj avbilda svaret från mikrobubblor som en funktion av ultraljudsparametrarna och att studera mekanismerna som leder till skalbrott och efterföljande frisättning av det fluorescerande märkta skalmaterialet. Denna uppsättning protokoll är tillämpliga på mikrobubblor med skal som innehåller ett fluorescerande färgämne. Figur 1 visar en schematisk representation av de polymera nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor som utvecklats vid SINTEF (Trondheim, Norge). Dessa bubblor är fyllda med perfluorpropangas (C3F8) och nanopartiklarna som stabiliserar skalet innehåller NR668, som är ett lipofilt derivat av Nile Red fluorescerande färgämne38,43. Nanopartiklarna består av poly(2-etyl-butylcyanoakrylat) (PEBCA) och är PEGylated. Funktionalisering med polyetylenglykol (PEG) minskar opsonization och fagocytos genom det mononukleära fagocytsystemet, vilket förlänger cirkulationstiden14,44. Som ett resultat ökar PEGylation mängden nanopartiklar som når målplatsen och förbättrar därmed effekten av behandlingen16. Figur 2 illustrerar hur användningen av fyra mikroskopimetoder gör det möjligt för forskare att täcka alla relevanta tids- och längdskalor. Det bör noteras att den rumsliga upplösning som kan uppnås i optisk mikroskopi bestäms av diffraktionsgränsen, som beror på våglängden hos målets och objektbelysningskällans våglängd45. För de system som finns till hands är den optiska upplösningsgränsen vanligtvis 200 nm. Dessutom kan intravital mikroskopi användas för att avbilda på subcellulär nivå46. För de nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor som används i detta arbete är den minsta längdskala som är relevant för intravital mikroskopi storleken på små kapillärer (≥10 μm). In vitro höghastighets optisk avbildning (10 miljoner bilder per sekund) och höghastighetsfluorescensavbildning (500 000 bilder per sekund) experiment beskrivs för enstaka mikrobubblor. Höghastighets ljusfältsavbildning vid nanosekunders tidsskalor är lämplig för att studera den tidsupplösta radiella dynamiken hos de vibrerande bubblorna. Höghastighetsfluorescensmikroskopi möjliggör däremot direkt visualisering av frisättningen av de fluorescerande märkta nanopartiklarna. Dessutom kan mikrobubbleskalets struktur undersökas med hjälp av Z-stack tredimensionell (3D) konfokal mikroskopi och scanningelektronmikroskopi (protokollet för den senare ingår inte i det aktuella arbetet). Intravital mikroskopi består i att använda multifoton mikroskopi för att avbilda tumörer som växer i dorsala fönsterkammare för att ge realtidsinformation om lokalt blodflöde och om ödet för fluorescerande märkta nanopartiklar i vivo47. Kombinationen av dessa mikroskopi metoder ger i slutändan detaljerad inblick i beteendet hos terapeutiska microbubble agenter som svar på ultraljud, både in vitro och in vivo.
Protocol
OBS: Alla försök godkändes av de norska djurforskningsmyndigheterna. Information om material som användes i protokollet finns i materialregistret.
1. Produktion av mikrobubblor
OBS: I detta arbete är mikrobubblorna av intresse protein- och nanopartikelstabiliserade mikrobubblor, för vilka produktionsprotokollet tidigare har beskrivits28,33,48. Därför har tillverkningsprotokollet sammanfattats kortfattat här.
- Blanda först ultrapurvatten med 0,5 wt% kasein i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 1 wt% av nanopartiklarna märkta med 0,21 wt% av det fluorescerande färgämnet, NR668 (modifierad Nile Red), i en steril glaspress toppflaska (10 ml, diameter på 2 cm). De polymera nanopartiklarna framställs med hjälp av miniemulsionspolymeriseringsmetoden enligt Mørch met al. 38.
OBS: Här fungerar färgämnet som ett modellläkemedel för att möjliggöra visualisering av nanopartikelfrisättning. När du arbetar med nanopartikellösningen, bär en labbrock, skyddsglasögon och handskar. Torka bort eventuella spill av nanopartikellösningen omedelbart med 100% aceton. - Kapa injektionsflaskan med gummilocket, blanda något och placera injektionsflaskan i ett ultraljudsbad i 10 minuter vid rumstemperatur för att eliminera eventuella aggregat. Placera ett dispersionsverktyg med omrörarens spets ~0,5 cm från glasflaskans botten. Använd en glaspipett ansluten till gasbehållaren och tillsätt perfluorpropangasen till huvudutrymmet på injektionsflaskan som innehåller lösningen tills lösningen börjar bubbla något.
OBS: Linda självförseglingsfilm runt botten av spridningsverktyget för att förhindra att glasflaskan glider under omrörning. - Rör om lösningen kraftigt vid 1935 × g (24 000 varv/min med en rotationsradie på 3 mm) i 4 minuter med dispersionsverktyget. Stäng injektionsflaskan med gummilocket och försegla injektionsflaskan för vidare användning.
OBS: Omrörningen fastnar gasen i vätskan. Mikrobubbleskalet monteras därefter själv utan att det krävs något aktivt steg. - Förvara överskottsväskan och nanopartikellösningen vid 4 °C och rengör spridningsverktyget med 100% aceton.
2. Imaging singelbubblor
- Konfokal mikroskopi
- Provberedning
- Späd ut bubbellösningen för att avbilda enstaka mikrobubblor enligt följande. Placera en ventilationsnål (19 G-21 G) i en glaspressflaska som innehåller de mikrobubblor som produceras genom att följa det förfarande som beskrivs i avsnitt 1. Vänd injektionsflaskan upp och ner så att stora bubblor kan röra sig bort från injektionsflaskans tätning.
- Sätt in en annan nålspets (19 G) av en liten (~ 1 ml) spruta i injektionsflaskan, medan injektionsflaskan fortfarande är upp och ner. Ta bort en liten mängd bubbelfjädring och överför innehållet i sprutan till ett litet rör för enklare pipettering i nästa steg.
OBS: Fjädringens volym att extrahera direkt beror på bubblans typ och koncentration. I detta fall extraherades 0,2 mL. - Späd mikrobubblefjädringen (från avsnitt 1) i filtrerad PBS med hjälp av en pipett för att uppnå en koncentration på cirka 2 × 105 till 6 × 105 mikrobubblor/ml för att möjliggöra enbubbla.
OBS: Beroende på bubbeltyp rekommenderas att tvätta bubbelfjädringen för att ta bort fritt fluorescerande färgämne. Detta är särskilt viktigt med bubblor för vilka det fluorescerande färgämnet infunderas i skalet. För att tvätta bubblor, späd bubbelfjädringen (t.ex. genom att ta 100 μL av bubbellösningen i 10 ml PBS) och centrifugera den (vanligtvis vid hastigheter i storleksordningen 100 × g). Slutligen ta bort supernatanten som innehåller mikrobubblorna med en pipett för ytterligare analys. Den återstående lösningen innehåller de fria fluorescerande partiklarna och kan kasseras. Tvättsteget bör upprepas vid behov. - Tillsätt glycerol till blandningen för att öka viskositeten hos mediet och eliminera rörelsen inducerad av Brownian rörelse som annars skulle störa den ganska långsamma confocal Z-stack imaging.
OBS: Mängden glycerol beror på vilken typ av bubbla som avbildas (här, ~ 50%). För vissa typer av bubblor, glycerol kan ha en negativ effekt på stabilitet49. Ingen märkbar förändring observerades dock i bubblorna över cirka 30 min under confocal imaging. Dessutom kan glycerol ändra den akustiska reaktionen av mikrobubblor och kan därför endast användas med avbildningsmetoder där mikrobubblorna inte är insonifierade. - Placera mikrobubblefjädringen i en kammare med tunna väggar för optimal avbildning, t.ex. en kanalbild.
- Bildprotokoll
- Slå på det konfokala mikroskopet och välj ett lämpligt mål och önskad laser och skanner som ska användas under konfokal mikroskopi.
OBS: Här använder du ett 60x vattensänkningsmål för en upplösning på 0,08 μm/pixel och, beroende på bubbelstorleken, avbilda en region på 256 x 256 pixlar eller 128 x 128 pixlar. I dessa specifika experiment, använd en 488 nm laser och en Galvano scanner. Emissionsvåglängden beror på det fluorescerande färgämnet och är vanligtvis bredband. - Hitta en mikrobubbla i ljusfält och byt till konfokal mikroskopi. Ställ in önskade övre och nedre plan mellan vilka det konfokala mikroskopet skannas. Skaffa en Z-stack för att observera 3D-strukturen; använd en stegstorlek på 100 nm i Z-riktningen.
- Slå på det konfokala mikroskopet och välj ett lämpligt mål och önskad laser och skanner som ska användas under konfokal mikroskopi.
- Provberedning
- Ljusfältsmikroskopi
- Montering av det optiska systemet
OBS: En schematisk representation av inställningen för ljusfältsmikroskopi visas i figur 3A. För att säkerställa ostörd ultraljudsutbredning innehåller vattenbadet två öppningar: en för en ljuskälla och en för en ultraljudsgivare. Det optiska systemet består av ett (modulärt) mikroskop, en höghastighetskamera och matchande optik. Eftersom perioden för mikrobubble svängningar vanligtvis är i storleksordningen 1 μs (med 1 MHz ultraljud), bör kameran ställas in för att spela in med en framerate på minst 5 miljoner bilder per sekund. Här ska kameran ställas in på 10 miljoner bilder per sekund (256 x 400 pixlar) för 256 bildrutor (25,6 μs) för att fånga alla detaljer i bubbeldynamiken inklusive högre övertoner.- Fäst ett vattensänkningsmål med lämplig förstoring, arbetsavstånd och NA i mikroskopet.
OBS: Ett vattensänkningsmål användes för att ge ett stabilt arbetsavstånd trots gradvis avdunstning av vattnet. Här valdes ett vattensänkningsmål med en förstoring på 60x, ett arbetsavstånd på 2 mm och en NA på 1. - Använd ett stroboskopljus med en toppeffekt på minst 1 kW för belysning och en rörlins mellan mikroskopet och kameran för att säkerställa att så lite omgivande ljus som möjligt når höghastighetskamerans sensor.
- Använd en dimbar halogenljuskälla för att fokusera på enstaka mikrobubblor och inriktning av det optiska och akustiska systemet för realtidsavbildning.
- Fäst ett vattensänkningsmål med lämplig förstoring, arbetsavstånd och NA i mikroskopet.
- Montering av det akustiska systemet
- Använd en programmerbar godtycklig vågformsgenerator och en effektförstärkare (56 dB vinst) för att driva givaren med en jämn omslutning och vågform. Anslut ett oscilloskop till den godtyckliga vågformsgeneratorn för att kontrollera signalen. Anslut en persondator till den godtyckliga vågformsgeneratorn för att programmera den inkommande akustiska tryckvågen med hjälp av ett skript skrivet internt.
- Använd en puls-/fördröjningsgenerator som huvudutlösare för att synkronisera de optiska och akustiska systemen. Ställ in avtryckarfördröjningarna på puls-/fördröjningsgeneratorn och kameraprogramvaran så att inspelningen startar 16 μs efter ultraljudsöverföring så att ultraljudsvågen kan nå bubblorna. Utlösa ljuskällan 1,5 μs före inspelningens början för att säkerställa korrekt belysning under bubbelsvängningarna (se figur 3B för tidsschemat).
- Välj en lämplig givare med lämplig centerfrekvens. Placera den i en öppning av vattenbadet, så att den är i en vinkel med avseende på den optiska axeln för att minimera reflektioner från provhållarmembranen och för att minska stående vågbildning.
OBS: Här placerades en enelement fokuserad nedsänkningsgivare med en mittfrekvens på 2,25 MHz, ett brännvidd på 1" och elementdiameter på 0,75" i en vinkel på 35° med avseende på den optiska axeln. Kalibreringen av överföringsfunktionen måste utföras med samma förstärkare som används i akustiksystemet. Kalibrera överföringsfunktionen från spänningsamplitud till tryckamplitud hos givaren med hjälp av en fiberoptisk hydrofon som en funktion av ultraljudsöverföringsfrekvensen.
- Välja provhållare
- Använd en provhållare med optiskt och akustiskt transparenta membran och en volym som är tillräckligt stor för att möjliggöra avbildning av flera enskilda mikrobubblor i samma prov.
OBS: Här användes en cellodlingskassett med en volym på 10 ml, membranområden på 25 cm2 och membrantjocklek på 175 μm. På grund av akustiska reflektioner på det nedre membranet och störningar från vågor som reflekteras av mikroskopmålet och det övre membranet, kan det akustiska in situ-trycket skilja sig från det som programmeras på den godtyckliga vågformsgeneratorn. Att placera givaren i en vinkel med avseende på provhållarmembranen minskar stående vågbildning, men kan öka reflektioner från membranen. - Se till att provet kan sänkas helt och placeras i fokus för både givaren och mikroskopmålet. Använd ett aluminiumstöd som är fäst vid ett 3D-mikropositioneringssteg för att flytta provhållaren självständigt.
- Använd en provhållare med optiskt och akustiskt transparenta membran och en volym som är tillräckligt stor för att möjliggöra avbildning av flera enskilda mikrobubblor i samma prov.
- Justering av de optiska och akustiska systemen
- Om 3D-översättningen justerar inställningen fäster du vattenbadet i ett XY-översättningsstadium och fäster scenen på ett optiskt bord för att säkerställa att det inte rör sig under experiment. Fyll sedan vattenbadet med vatten och slå på den dimbara halogenljuskällan. Under justeringen flyttar du mikroskopmålet åt sidan för att förhindra ultraljudsreflektioner.
- Fäst en nålhydrofon (0,2 mm) på provhållarens arm och placera nålens hydrofon i vattenbadet, med spetsen i siktfältet. Slå på förstärkaren och den godtyckliga vågformsgeneratorn; använd enstaka pulser på 5 till 10 ultraljudscykler och en pulsrepetitionsfrekvens på 15 Hz. Se till att hydrofonspetsen är centrerad och i fokus på mikroskopbilden. Flytta tanken i XY-riktningen och nålen i Z-riktningen tills den maximala tryckamplituden har uppnåtts.
- Justera mikroskopets fokus för att fokusera på hydrofonens spets.
OBS: Detta protokoll säkerställer justeringen mellan mikroskopfokus och givarens fokus. Ändra inte mikroskopets och givarens position efter justering.
- Provberedning
- Upprepa steg 2.1.1.1 till och med 2.1.1.3 för att förbereda provlösningen. Späd ut bubbellösningen för att möjliggöra enbubbla avbildning och för att utesluta akustiska interaktioner mellan närliggande bubblor.
- Öppna provhållarens utlopp. Injicera provlösningen i provhållarens andra öppning med en spruta tills den är helt fylld. Se till att det inte finns några luftbubblor inuti provhållaren för att förhindra oönskade interaktioner med ultraljudsfältet.
- Stäng provhållarens båda ventilerna och placera provhållaren vinkelrätt mot den optiska axeln.
OBS: Håll den fyllda provhållarnivån för att förhindra att bubblorna flyttas till ena sidan av provhållaren under förflyttningen.
- Bildprotokoll
- Programmera önskad ultraljudskörningsfrekvens och akustiskt tryck i den godtyckliga vågformsgeneratorn genom ovannämnda interna skriftliga skript.
OBS: Här var den akustiska tryckvågen en enda sprängning på 40 cykler, med en 8-cykel Gaussian-avsmalnande puls. Ultraljud frekvenser som används i dessa experiment var 1 MHz, 2 MHz eller 3 MHz, med akustiska tryck amplituder som sträcker sig från 81 kPa till 1200 kPa. - Flytta provhållaren som innehåller provlösningen med XYZ-scenen för att lokalisera enstaka mikrobubblor i mikroskopets fokus. Börja med ett synfält i ett hörn av provhållaren och se till att mikrobubblornas kant är tydligt synlig och i fokus (se figur 3C för en idealisk kameravy).
- Fäst änden av en optisk fiber som tidigare var ansluten till halogenljuset till ett stroboskopljus, så att den andra änden fortfarande är ansluten till vattenbadet. Utlösa inspelningen.
- Upprepa steg 2.2.6.2 till 2.2.6.3 så många gånger som önskas per ultraljudsinställning (frekvens och akustiskt tryck), flytta cellodlingskasetten som innehåller mikrobubblorna minst 2 mm (i fokalplanet) från föregående plats för att säkerställa att mikrobubblorna i synfältet inte är insonifierade i tidigare experiment.
OBS: Här upprepades varje experiment ~ 20 gånger. När hela provhållaren är insonifierad tömmer du provhållaren och fyller på den med färsk provlösning för efterföljande experiment.
- Programmera önskad ultraljudskörningsfrekvens och akustiskt tryck i den godtyckliga vågformsgeneratorn genom ovannämnda interna skriftliga skript.
- Dataanalys
- Anta en programmeringsmiljö för att utföra dataanalys enligt forskningsfrågan och utföra kantidentifiering efter bearbetning av bilderna. Använd en funktion som mäter egenskaper hos bildregioner och hitta centroiden i en bubbla och derivatan av intensitetsprofilen runt varje bubbla för att upptäcka bubblans kontur (och därmed bubbelradien R). Extrahera relevanta parametrar från radien över tid för enskilda mikrobubblor.
OBS: I den aktuella studien användes en programmeringsmiljö för bildbehandling för att binarize och filtrera inspelningar av enskilda mikrobubblor. Ett internt skript användes för att hitta derivatan av intensitetsprofilen runt varje bubbla.
- Anta en programmeringsmiljö för att utföra dataanalys enligt forskningsfrågan och utföra kantidentifiering efter bearbetning av bilderna. Använd en funktion som mäter egenskaper hos bildregioner och hitta centroiden i en bubbla och derivatan av intensitetsprofilen runt varje bubbla för att upptäcka bubblans kontur (och därmed bubbelradien R). Extrahera relevanta parametrar från radien över tid för enskilda mikrobubblor.
- Montering av det optiska systemet
- Fluorescensmikroskopi
- Montering av det optiska systemet
- Bygg upp inställningen för fluorescensmikroskopi (figur 4A), med samma bas som används i den ljusfältsmikroskopi som beskrivs i avsnitt 2.2.
Obs: Den inställning som beskrivs i avsnitt 2.3 kan kombineras med den som beskrivs för ljusfältsmikroskopi i avsnitt 2.2. Genom att kombinera både fluorescensmikroskopi och ljusfältsmikroskopi möjliggör visualisering av mikrobubblegaskärnan samtidigt som nanopartikeln avbildas. - Ställ in höghastighetskameran på 500 000 bilder per sekund (400 x 250 pixlar) för 128 bildrutor (256 μs).
OBS: Avbildningstiden är längre än i ljusfältsexperimenten eftersom ljusintensiteten är begränsad i fluorescens och eftersom den tidsskala över vilken partikeltillförseln sker är längre än bubbeldynamiken. - Välj en laser med en effekt som är tillräckligt hög för att ge tillräckligt med ljus och som har en lämplig excitationsvåglängd och se till att den är kopplad till en acoustooptisk modulator för att undvika blekning av provet.
OBS: I denna studie användes en 5 W kontinuerlig våglaser med en excitation våglängd på 532 nm för att excitera fluorescensen av nanopartiklarna. - Placera en stråldelare, dichroisk spegel och skårfilter mellan lasern och mikroskopet för att rikta excitationsljuset mot provet samtidigt som fluorescensemissionen kan nå kameran.
- Bygg upp inställningen för fluorescensmikroskopi (figur 4A), med samma bas som används i den ljusfältsmikroskopi som beskrivs i avsnitt 2.2.
- Montering av det akustiska systemet
- För att medsonifiera mikrobubblorna använder du samma akustiska inställning som i avsnitt 2.2.2. Ändra givaren i dessa specifika experiment till en enda element, fokuserad nedsänkningsgivare med en mittfrekvens på 2,25 MHz, ett brännvidd på 1,88", och elementdiameter på 1". Placera den i en vinkel på 35° med avseende på den optiska axeln för att minimera reflektioner från provhållarmembranen och minska stående vågformationer.
- Justering av de optiska och akustiska systemen
- Upprepa stegen som beskrivs i avsnitt 2.2.4.
- Provberedning
- Förbered provlösningen enligt beskrivningen i avsnitt 2.2.5.
- Bildprotokoll
- Ställ in önskad ultraljudskörningsfrekvens och akustisk tryckamplitud på den godtyckliga vågformsgeneratorn genom ovannämnda interna skriftliga skript.
OBS: Här var den akustiska tryck vågen programmerad att vara en enda sprängning av ultraljud av 140 cykler, med en 10-cykel Gaussian-avsmalnande puls. Längre pulslängder krävs i allmänhet för att inducera bioeffekter jämfört med de som krävs för att studera bubbeldynamik. Ultraljud frekvenser som används i dessa experiment var 1 MHz, 2 MHz eller 3 MHz, med akustiska tryck amplituder som sträcker sig från 81 kPa till 1200 kPa. - På puls-/fördröjningsgeneratorn ställer du in avtryckarfördröjningen för lasern för fluorescerande excitation av nanopartiklarna från mikrobubblorna under inspelningen.
OBS: För dessa specifika experiment var utlösarfördröjningen mellan 20 μs och170 μs under en total varaktighet av 150 μs. Tidsdiagrammet visas i figur 4B. - Flytta provhållaren som innehåller provlösningen med XYZ-scenen för att lokalisera enstaka mikrobubblor i mikroskopets fokus. Börja med ett synfält i ett hörn av provhållaren. se Figur 4C för en idealisk kameravy där mikrobubblornas gränssnitt är tydligt synligt och i fokus. Utlösa inspelningen.
- Upprepa steg 2.3.5.3 så många gånger som önskas per ultraljudsinställning (frekvens och akustiskt tryck), flytta cellodlingskassetten som innehåller mikrobubblorna minst 2 mm (i det optiska planet) från föregående plats för att säkerställa att mikrobubblor i synfältet inte ljuder i tidigare experiment.
OBS: I denna studie upprepades varje experiment ~ 10-20x. När hela provhållaren är insonifierad tömmer du provhållaren och fyller på den med färsk provlösning för efterföljande experiment. Vilket avstånd som ska flyttas provhållaren mellan experimenten beror på den akustiska strålstorleken.
- Ställ in önskad ultraljudskörningsfrekvens och akustisk tryckamplitud på den godtyckliga vågformsgeneratorn genom ovannämnda interna skriftliga skript.
- Dataanalys
- Analysera fluorescensmikroskopiinspelningarna enligt forskningsfrågan. För varje mikrobubble, visuellt avgöra om leverans av nanopartiklarna i fluorescensmikroskopi experiment inträffade. Om avlossning och deponering av nanopartiklarna från gaskärnan till provhållarmembranet observeras för en enda mikrobubble, ange manuellt att leveransen inträffade i programmeringsmiljön.
- Montering av det optiska systemet
3. Intravital mikroskopi
- Dorsal hudfold fönsterkammare kirurgi (beskrivs tidigare26,47,50)
- Acklimatisera djuren i en vecka innan du placerar fönsterkamrarna. Även om både kvinnliga och manliga möss kan användas, och åldern är oviktig, se till att mössens vikt är minst 22-24 g så att huden är tillräckligt flexibel.
- Utför operationen under generell anestesi med intraoperativ och postoperativ smärtstillande behandling. Bedöva djuret genom en subkutan injektion av fentanyl (0,05 mg/kg)/medetomidin (0,5 mg/kg)/midazolam (5 mg/kg)/vatten (2:1:2:5) vid en dos på 0,1 ml per 10 g vikt. Använd en värmedyna eller en värmelampa för att bibehålla djurets kroppstemperatur.
- Dra försiktigt på det dubbla lagret av hud på djurets baksida så att huden är inklämd mellan två symmetriska polyoxymetylenramar i fönsterkammaren. Fixera kammaren genom att placera två skruvar som sträcker sig genom det dubbla hudskiktet och suturing längs kammarens övre kant.
- Ta bort huden inom kammarens cirkulära ram på ena sidan av hudvecket. Placera ett täckglas med en diameter av 11,8 mm inom ramen där huden avlägsnas för att bilda ett fönster in i vävnaden.
- Använd en subkutan injektion av atipemazol (2,5 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) och vatten (1:1:8) vid en dos av 0, 1 ml per 10 g som motgift för att avsluta anestesin. Placera djuret i ett uppvärmt återhämtningsställ över natten. Komplettera vattnet för djuren med 25 mg/ml enrofloxacin för att förhindra infektion på operationsstället.
- Skapande av tumörmodell
- Håll cancerceller vid 37 °C och i en 5% CO2 atmosfär i lämpligt odlingsmedium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum och 100 U/mL penicillin och 100 mg/ml streptomycin.
OBS: Den mänskliga osteosarkom (OHS) cellinjen användes i detta protokoll, men andra cellinjer kan också användas. - Dagen efter steg 3.1.5 bedövar du djuret med isofluran (5% under induktion och 1-2% under underhåll) i ett par minuter. Ta bort täckglaset, applicera 5 × 106 cancerceller i 30 μL cellodlingsmedium och byt ut täckglaset.
- Låt tumörerna växa i 2 veckor före avbildning och övervaka djurens vikt och hälsostatus minst 3 gånger per vecka under denna period.
- Håll cancerceller vid 37 °C och i en 5% CO2 atmosfär i lämpligt odlingsmedium kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum och 100 U/mL penicillin och 100 mg/ml streptomycin.
- Montering av det optiska systemet
- Utför intravital avbildning under ultraljudsbehandling (som beskrivs i tidigare arbete26) med ett lämpligt mikroskop och mål beroende på forskningsfrågan som står på spel. Se figur 5A för en schematisk representation av den experimentella installationen.
OBS: För detta specifika experiment användes ett multifotonmikroskop, utrustat med ett 20x vattendippmål (NA på 1,0 och arbetsavstånd på 2 mm) och en pulsad laser. Bilder förvärvades i resonans skanningsläge vid 31 bilder per sekund (512 x 512 pixlar) med ett synfält på 400 x 400 μm2. Excitation våglängden var 790 nm. Filtren framför de två gallium arsenid fosfind detektorer var lång-passera 590 nm och band-passera 525/50 nm för detektion av fluorescens.
- Utför intravital avbildning under ultraljudsbehandling (som beskrivs i tidigare arbete26) med ett lämpligt mikroskop och mål beroende på forskningsfrågan som står på spel. Se figur 5A för en schematisk representation av den experimentella installationen.
- Montering av det akustiska systemet
- Montera en lämplig ultraljudsgivare i en vågledare (specialtillverkad) placerad under målet i en vinkel på 45° med avseende på den optiska axeln för att minimera reflektioner från täckglaset i den dorsala hudveckfönsterkammaren och för att minska stående vågformationer. Fyll vågledaren med destillerat och avgasat vatten. Applicera ultraljud koppling gel ovanpå vågledaren.
- Justering av de optiska och akustiska systemen
- Justera den optiska axeln med ultraljudets fokus. Placera en fiberoptisk hydrofon i målets fokus. Slå sedan på förstärkaren och den godtyckliga vågformsgeneratorn för att excitera givaren med korta bursts (5-10 cykler) med en pulsrepetitionsfrekvens på 100 Hz och flytta ultraljudsgivaren till den position där det högsta trycket detekteras med hydrofonsignalen på oscilloskopet.
OBS: Ändra inte givarens position efter justering.
- Justera den optiska axeln med ultraljudets fokus. Placera en fiberoptisk hydrofon i målets fokus. Slå sedan på förstärkaren och den godtyckliga vågformsgeneratorn för att excitera givaren med korta bursts (5-10 cykler) med en pulsrepetitionsfrekvens på 100 Hz och flytta ultraljudsgivaren till den position där det högsta trycket detekteras med hydrofonsignalen på oscilloskopet.
- Bildprotokoll
- Placera den uppvärmda djurhållaren (specialdesignad) ansluten till ett XY-positioneringssteg mellan vågledaren och målet och tillsätt mer kopplingsgel. Bedöva djuret och placera en svansveterkateter. Placera musen i den uppvärmda hållaren och fixera fönsterkammaren i hållaren. Lägg till en vattendroppe ovanpå täcksedeln i fönsterkammaren och flytta målet på plats för att avbilda tumörvävnaden.
-
Figur 5B visar tidsdiagrammet för experimenten som visar händelseordningen. Injicera fluorescerande märkta 2 MDa dextran intravenöst (30 μL, 4 mg/ml utspädd i saltlösning) för att visualisera vaskulaturen och flytta musen med XY-översättningssteget för att hitta en position med lämpliga blodkärl. Spela in baslinjebilder före ultraljudsbehandlingen. Justera bildhastighet, synfält och registreringslängd beroende på forskningsfrågan och specifikationerna för mikroskopet och färgämnena som ska avbildas.
OBS: I dessa experiment registrerades 31 bilder per sekund med ett synfält på 400 x 400 μm2, och avbildning gjordes kontinuerligt i 5 min. - Ställ in önskad ultraljudskörningsfrekvens, pulslängd och akustisk tryckamplitud på den godtyckliga vågformsgeneratorn.
OBS: För dessa experiment användes en frekvens på 1 MHz med en pulslängd på 10 ms och topp undertrycksamplituder mellan 0,2 MPa och 0,8 MPa. En puls repetition frekvens på 0,5 Hz eller 0,1 Hz användes för att tillåta nya microbubbles att reperfuse in i det behandlade området mellan ultraljud pulser. - Injicera 50 μL mikrobubblor (2 × 108 till 5 × 108 mikrobubblor/ml) intravenöst och applicera ultraljud vid avbildning, enligt beskrivningen i26.
- Dataanalys
- Beroende på forskningsfrågan, analysera bilder med (öppen källkod) bildbehandling programvara och en programmeringsmiljö, som beskrivs i26, för att bestämma blodkärl parametrar (diameter, förgrening, flödeshastighet, och riktning), ackumulering av nanopartiklar i kärlen, och kinetik och penetrationsdjup av extravasation av dextran och nanopartiklar i tumörvävnad.
Representative Results
Mikrobubblorna, som produceras enligt beskrivningen i protokollet, analyserades med hjälp av olika mikroskopimetoder och vid olika tidsskalor.
Nanopartiklarnas fluorescens i konfokal mikroskopi (figur 6A) indikerar att skalet har en ojämn partikelfördelning. Andra mikroskopimetoder kan användas för bubbelkarakterisering. Figur 6B visar till exempel mikrobubbelns övergripande struktur med hjälp av scanningelektronmikroskopi, som presenteras i tidigare arbete34.
Radiell dynamik och fenomenologiska bubbla beteende kan studeras med hjälp av den beskrivna in vitro ljusfält mikroskopi metoden där mikrobubblor avbildades med 10 miljoner bilder per sekund. Radien av enskilda mikrobubblor extraherades med tiden med hjälp av ett skript skrivet internt. Ett exempel på ett sådant radiellt svar visas i figur 7.
En bildsekvens av typisk lyckad nanopartikelleverans, som beskrivs i avsnitt 2.3.6, visas i figur 8A. Nanopartiklarna som är inbäddade i mikrobubbleskalet kan ses lysa upp på grund av fluorescens när laserljuset når bubblan. Drivna av ultraljudsorsonation lossnar fluorescerande nanopartiklar från mikrobubblornas gaskärna och deponeras på provhållarens membran. Slutligen stängs lasern av och de fluorescerande nanopartiklarna är inte längre upphetsade. Misslyckad leverans av den fluorescerande märkta nyttolasten av mikrobubblorna ser vanligtvis ut som den bildsekvens som visas i figur 8B, där de fluorescerande nanopartiklarna lyser upp på skalet på mikrobubbeln som förblir intakt under ultraljudsexponering.
Realtid intravital multifoton mikroskopi under ultraljud användes för att undersöka effekterna av ultraljud och mikrobubblor på nanopartiklar beteende i blodet, förbättring av permeabiliteten av tumör blodkärl och förbättring av leveransen av nanopartiklar. Omfattningen och kinetiken av penetration i den extracellulära matrisen som en funktion av akustiskt tryck, frekvens och pulslängder kan karakteriseras. Effekten av ultraljudsbehandlingen kan variera med avseende på kärlens storlek och morfologi och den resulterande inneslutningen av bubblan. Hur ultraljudsbehandlingen påverkar blodflödet och riktningen kan bestämmas. Ett exempelexperiment som visar extravasation av nanopartiklar över tid visas i figur 9 vid ett mekaniskt index (MI) på 0,826. Resultaten av intravital multifoton mikroskopi belyser rumsliga och tidsmässiga extravasation av nanopartiklar under ultraljud exponering, vilket är mycket fördelaktigt för fullständig förståelse av mekanismerna bakom ultraljud-medierad leverans av nanopartiklar och att optimera sådan teknik26.
Figur 1: Schematisk representation av en mikrobubbel med ett skal av fluorescerande märkta polymera nanopartiklar i denaturerade kasein. Mikrobubblorna är vanligtvis mellan 1 μm och 10 μm i diameter. Nanopartiklarna har en diameter mestadels mellan 100 nm och 200 nm38. Förkortning: C3F8 = perfluorpropangas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Schematisk översikt som visar relevanta tids- och längdskalor för ljusfält, fluorescens, konfokal och intravital mikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Schematisk representation av experiment med ljusfältsmikroskopi. (A) Experimentell installation, (B) tidsschemat och (C) en typisk inspelad bildruta. Skalstång i (C) = 10 μm. Förkortning: fps = bildrutor per sekund. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Schematisk framställning av fluorescensmikroskopiexperiment. (A) Experimentell inställning, (B) tidsschemat och (C) en typisk inspelad ram. Skalstång i (C) = 10 μm. Förkortning: fps = bildrutor per sekund. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Schematisk representation av intravitala mikroskopiexperiment. (A) Experimentell installation, (B) tidsschemat och (C) en typisk inspelad ram. Skalstång i (C) = 50 μm. Grönt motsvarar dextran-FITC och rött till nanopartiklar. Förkortning: GaAsP = galliumarsenidfosfid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6: 3D-struktur hos en enda nanopartikel- och proteinstabiliserad mikrobubbel. B) har reproducerats med tillstånd från34. Skalstång i (A) = 5 μm; skalstång i (B) = 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Typiska sfäriska svängningar av en 2,89 μm radie nanopartikel-och-protein-stabiliserad mikrobubble insonifierad vid en ultraljudsfrekvens på 1 MHz och en akustisk tryckamplitud på 142 kPa. (A-D) Bilder från höghastighetsregistreringen och motsvarande bubbelradie över tidskurvan (nederkant). Skalningsstaplar = 5 μm och den röda linjen anger den ursprungliga radien. Belysningsprofilen (godtyckliga enheter) indikeras med gult. Förstoringen är 120x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Bildsekvens från höghastighetsfluorescensmikroskopi. (A) Lyckad leverans av fluorescerande märkta nanopartiklar av en nanopartikel- och proteinstabiliserad mikrobubbel som är insonifierad vid en ultraljudsfrekvens på 2 MHz och en akustisk tryckamplitud på 600 kPa. (B) Misslyckad leverans av fluorescerande märkta nanopartiklar av en nanopartikel- och proteinstabiliserad mikrobubbel som är insonifierad vid en ultraljudsfrekvens på 2 MHz och en akustisk tryckamplitud på 210 kPa. Skalstänger = 10 μm. Förstoringen är 120x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Intravital mikroskopi efter insonation av nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor med en ultraljudsfrekvens på 1 MHz och en akustisk tryckamplitud på 800 kPa. (A) Nanopartiklar i kärlet, och (B) en bildsekvens av det område som indikeras av den vita streckade kvadraten i (A) som visar extravasationen av dexppartiklar (grön) och nanopartiklar (röd). Skalstänger = 50 μm. Förstoringen är 20x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Olika optiska mikroskopimetoder kombinerades för att få information om de olika stegen i leveransen av nanopartiklar från ytan av mikrobubblor till det omgivande mediet. Imaging av bubbla svängningar utfördes, liksom imaging av frisättningen av nanopartiklarna från bubbla skal, extravasation och penetration genom extracellular matrisen av tumörer in vivo. In vitro-avbildning möjliggör screening av många ultraljudsparametrar jämfört med de mer komplexa in vivo-installationerna . Fördelen med att kombinera detta utbud av bildframställning modaliteter är den kompletterande information som kan erhållas på olika tidsskalor - en funktion som är avgörande för att karakterisera och optimera mikrobubblorna för framgångsrik leverans och för att erhålla terapeutisk effekt. Detta tillvägagångssätt är användbart för att förstå leveransmekanismerna för alla mikrobubblor, inklusive konstruktioner med fluorescerande märkta nanopartiklar och droger.
De mest kritiska stegen i mikroskopimetoderna som används för att studera enskilda mikrobubblor är följande. För fluorescensmikroskopi bör nanopartiklarna märkas fluorescerande för att möjliggöra visualisering av partikelutsläppet. Dessutom bör provlösningen spädas ut tillräckligt för att isolera enstaka mikrobubblor för analys i konfokala, ljusa fält och fluorescensmikroskopimetoder. Dessutom är det viktigt att välja en ultraljudskörningsfrekvens och akustiskt tryck för att excitera bubblorna mest effektivt, nämligen vid deras resonans. Om forskningsfrågan gäller leverans av nanopartikel nyttolasten, bör lämpliga ultraljudsparametrar vara en del av undersökningen. Förutom resonans bör dessa bubblor också drivas vid eller över tröskelvärdet för nanopartikelfrisättning, vanligtvis vid relativt höga akustiska tryckamplituder (MI > 0,3)51. För ljusfältsmikroskopiavbildning är det viktigt att välja en höghastighetskamera med en tillräckligt hög bildhastighet för att minimera rörelseoskärpa och undvika aliasing.
Ljusfältsmikroskopi begränsas huvudsakligen av bildbildsbildsbildhastigheten och intensiteten hos tillgängliga ljuskällor, eftersom en högre framerate skulle ge en mer detaljerad tidsupplöst inblick i bubbeldynamiken, men kräver mer intensiv belysning på grund av kortare exponeringstider. För att studera partikelutsläpp mer i detalj kan ramhastigheten för fluorescensavbildning i princip ökas genom att öka laserljusets intensitet. Absorptionen av det högintensiva laserljuset av de fluorescerande märkta mikrobubblorna genererar dock värme, även med färgämnen med hög kvantutbyte. Denna värme kan störa de experiment som står på spel, och i extrema fall inducera foto-termisk kavitation52. Således finns det i praktiken en gräns för den applicerade laserfluensen. Men intensiv laserbelysning kan också avsiktligt användas för att inducera partikelutsläpp från liposomer53. Temperaturen påverkar bubbeldynamik och ultraljudsrespons, beroende på bubbeltyp54. Om in vitro- och intravitala metoder ska jämföras objektivt bör därför de in vitro-metoder som diskuteras i protokollet utföras vid 37 °C. En annan begränsning av de in vitro-metoder som diskuteras i det aktuella papperet är att bubblorna inte är i en frifältsmiljö, eftersom mikrobubblor kommer att flyta under provhållarmembranet. Dessutom finns det en urvalsförskjutning när du avbildar enstaka mikrobubblor. Att utföra upprepade experiment på enskilda bubblor gör det dock möjligt att undersöka effekten av storlek och avlägsnande av den förvirrande faktorn - storleksfördelningen. Om bubbelresponsen som en funktion av storlek kan förstås medan koncentrationen inte är för hög för att förhindra bubbelbubblainteraktioner, kan svaret från någon godtycklig bubbelpopulation beräknas. Slutligen ger både ljusfälts- och fluorescensmikroskopimetoder insikt i mikrobubblor invecklade i en tvådimensionell (2D) bild. Om forskningsfrågan kräver mer än 2D-avbildning kan bubblornas 3D-beteende lösas genom att kombinera installationen som beskrivs i protokollet med en sidovyinställning för multiplansavbildning55.
En alternativ metod för att studera mikrobubblor är akustisk karakterisering56. Att mäta ekot från en enda mikrobubble kräver dock att man lokaliserar och isolerar en enda mikrobubble i ultraljudsstrålen56, vilket utgör en utmaning som vanligtvis hanteras genom användning av ett smalt rör eller optiska eller akustiska pincett57,58. För att storleksanpassa bubblor akustiskt kan mikrobubblorna insonifieras i den geometriska spridningsregimen vid frekvenser som är mycket högre än deras resonansfrekvens, vilket inte inducerar volymetriska mikrobubble svängningar59. Användningen av en "akustisk kamera" är en sådan metod för att avbilda den radiella dynamiken hos enstaka mikrobubblor som svar på ultraljud, där en högfrekvent ultraljudssond används för att bestämma bubblans radiella svar på en lågfrekvent körvåg60. Nackdelen med denna metod är att den endast kan användas för att bestämma den relativa förändringen av mikrobubbleradien. Därför behövs en annan metod för att bestämma den absoluta bubbelradien, t.ex. genom optisk avbildning61,62. Nackdelen med metoder där mikrobubblor utsätts för ultraljud vid frekvenser högre än deras resonansfrekvens är att vid så höga frekvenser minskar penetrationsdjupet59, vilket begränsar användbarheten för in vivo-applikationer. Andra former av mikroskopi kan också användas för att studera mikrobubblor som scanningelektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi63. Den uppnåeliga spatio-temporal upplösningen av dessa alternativa mikroskopi tekniker är dock i allmänhet mer begränsad, och dessa tekniker har nackdelen att imaging utförs antingen före eller efter ultraljud exponering genom off-line analys och vanligtvis presenterar en låg genomströmning63. Ett annat alternativ är att använda en ljusspridningsmetod, som kan användas för att studera radiell dynamik hos enskilda mikrobubblor i realtid, men har ett lågt signal-brusförhållande jämfört med akustiska spridningsmetoder64.
Intravital mikroskopi i realtid under ultraljudsexponering är en kraftfull metod för att få ny insikt om vaskulaturen, beteendet hos mikrobubblor, nanopartiklar eller andra molekyler (såsom dextran i detta fall) under ultraljudsexponering. En allmän begränsning när man utför intravital mikroskopi i realtid är att endast ett litet område av vävnaden avbildas, och ljusets penetrationsdjup i vävnaden är begränsat. Om de avbildade kärlen innehåller mycket få mikrobubblor och/eller nanopartiklar inom synfältet kan lite eller ingen information om nanopartiklarnas beteende och extravasation erhållas. Dessutom, på grund av det begränsade synfältet, är en korrekt justering mellan ljus- och ultraljudsvägarna avgörande. Om ultraljudstrycket är tillräckligt högt för att inducera bubbeldestruktion är det också viktigt att välja en pulsrepetitionsfrekvens som gör att färska bubblor kan reperfusera in i synfältet mellan ultraljudspulser. Dessutom, eftersom ultraljudet kommer att reflekteras från täckglaset i fönsterkammaren och målet, är det viktigt att placera givaren i en vinkel för att minska reflektioner för att förhindra bildandet av stående vågor, vilket förvränger det kalibrerade tryckfältet. En annan praktisk fråga är att installationen måste ha tillräckligt med utrymme för att montera ultraljudsgivaren och vågledaren över eller under målet i mikroskopinställningen. Tumörerna i dorsala fönsterkammaren kommer att ha en begränsad tjocklek på grund av den begränsande kammaren och täckslipen; Om det behövs kan dock andra modeller användas. Exempel är hudveckstumörer, till exempel i bröstfett pad65 eller buken intravital avbildning av tumörer i de olika organen66. Sådana tumörer kan odlas orthotopically i lämplig mikromiljön, och som sådan, presentera ett mer kliniskt relevant fall.
De metoder som beskrivs i detta arbete upplysa potentialen hos fluorescerande märkta mikrobubblor att studera grunderna för läkemedelsleveransapplikationer med hjälp av bubblor och ultraljud. Denna kombination av mikroskopi metoder ger värdefull inblick i microbubble svar på ultraljud insonation och dess tillhörande akustiska parameter utrymme och presenterar en tydlig bild av microbubble och nyttolast beteende över ett relevant intervall av tid och längd skalor.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 | Tabor Electronics | Arbitrary waveform generator (programmable) | |
| 2100 L | ENI | Amplifier, used in window chamber setup | |
| 2 MDa dextran | Sigma-Aldrich | ||
| 33522 A | Agilent Technologies | Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup | |
| A1R | Nikon Instruments | Confocal microscope | |
| ACE I | SCHOTT | Dimmable AC halogen light source | |
| Atipemazol | Orion Pharma | Antidote to wake animal | |
| Baytril | Bayer | Enrofloxacin | |
| BD Neoflon 24 G | Becton Dickinson & Company | Tail vein catheter | |
| BNC model 575 | Berkely Nucleonics Corporation | Pulse/delay generator | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Branson | Ultrasonic bath | |
| Channel slide | Ibidi | ||
| CLINIcell 25 | Laboratoires Mabio International | Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm) | |
| Cohlibri | Lightline | Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm) | |
| DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | Oscilloscope | |
| Fentanyl | Actavis Group HF | Anaesthesia of mouse | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | Supplement for cell culture medium | |
| Fiber-optic hydrophone | Precision Acoustics | Used for alignment | |
| Flumanezil | Fresenius Kabi | Antidote to wake animal | |
| Heated animal holder | Custom design | A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber | |
| Hyper Vision HPV-X2 | Shimadzu | High-speed camera | |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin | open source image processing program | |
| In vivo SliceScope | Scientifica | Multiphoton microscope | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| ISOTON | Beckman Coulter | Filtered, phosphate-buffered saline solution | |
| LUMPLFLN60XW | Olympus | Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm) | |
| MaiTai DeepSee | Spectra-Physics | Pulsed laser | |
| MATLAB | Mathworks | Programming environment | |
| Medetomidine | Orion Pharma | Anesthesia of mouse | |
| Midazolam | Accord Healthcare Limited | Anesthesia of mouse | |
| Milli-Q | Merck | Ultrapure water | |
| MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe | PerkinElmer | Strobe light | |
| Panametrics-NDT C305 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1") | |
| Panametrics-NDT V304 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25") | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
| Perfluoropropane gas | F2 Chemicals | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 | Gibco Thermo-Fisher | Cell culture medium | |
| Safe-Lock tube | Eppendorf | ||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
| T 25 basic ULTRA-TURRAX | IKA laboratory technology | Dispersion tool | |
| TDS 210 | Tektronix | Oscilloscope, used in window chamber setup | |
| Transducer | Precision Acoustics Ltd | Used in window chamber setup | |
| U-TLU | Olympus | Tube lens | |
| VBA100-200 | Vectawave | Amplifier | |
| Window chambers | Custom made | Used in window chamber setup | |
| XLUMPLFLN20 XW | Olympus | 20x water dipping objective | |
| XY(Z) translation stages | Thorlabs |
References
- Szabo, T. L. Diagnostic ultrasound imaging: inside out. , Academic Press. (2004).
- Paefgen, V., Doleschel, D., Kiessling, F. Evolution of contrast agents for ultrasound imaging and ultrasound-mediated drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 197 (2015).
- Versluis, M., Stride, E., Lajoinie, G., Dollet, B., Segers, T. Ultrasound contrast agents modeling. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (9), 2117-2144 (2020).
- Coelho-Filho, O. R., Rickers, C., Kwong, R. Y., Jerosch-Herold, M. MR myocardial perfusion imaging. Radiology. 266 (3), 701-715 (2013).
- Pandharipande, P. V., Krinsky, G. A., Rusinek, H., Lee, V. S. Perfusion imaging of the liver: current challenges and future goals. Radiology. 234 (3), 661-673 (2005).
- Weidner, N., Carroll, P. R., Flax, J., Blumenfeld, W., Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. The American Journal of Pathology. 143 (2), 401-409 (1993).
- Quaia, E. Classification and safety of microbubble-based contrast agents. Contrast Media in Ultrasonography. Medical Radiology (Diagnostic Imaging). Quaia, E. , Springer. Berlin, Heidelberg. 3-14 (2005).
- Unger, E. C., Porter, T., Culp, W., Labell, R., Matsunaga, T., Zutshi, R. Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (9), 1291-1314 (2004).
- Blomley, M. J. K., Cooke, J. C., Unger, E. C., Monaghan, M. J., Cosgrove, D. O. Microbubble contrast agents: a new era in ultrasound. BMJ. 322 (7296), 1222-1225 (2001).
- Faez, T., et al. 20 years of ultrasound contrast agent modeling. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency control. 60 (1), 7-20 (2012).
- De Jong, N., Emmer, M., Van Wamel, A., Versluis, M. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Medical & Biological Engineering & Computing. 47 (8), 861-873 (2009).
- De Jong, N. Acoustic properties of ultrasound contrast agents. , (1993).
- Schneider, M. Characteristics of sonovueTM. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Averkiou, M. A., Powers, J., Skyba, D., Bruce, M., Jensen, S. Ultrasound contrast imaging research. Ultrasound Quarterly. 19 (1), 27-37 (2003).
- Snipstad, S., et al. Contact-mediated intracellular delivery of hydrophobic drugs from polymeric nanoparticles. Cancer Nanotechnology. 5 (1), 8 (2014).
- Epstein, P. S., Plesset, M. S. On the stability of gas bubbles in liquid-gas solutions. The Journal of Chemical Physics. 18 (11), 1505-1509 (1950).
- Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
- Deshpande, N., Needles, A., Willmann, J. K. Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Clinical Radiology. 65 (7), 567-581 (2010).
- Miller, M. W., Miller, D. L., Brayman, A. A. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Medicine & Biology. 22 (9), 1131-1154 (1996).
- Snipstad, S., et al. Sonopermeation to improve drug delivery to tumors: from fundamental understanding to clinical translation. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (12), 1249-1261 (2018).
- Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
- May, J. -N., et al. Multimodal and multiscale optical imaging of nanomedicine delivery across the blood-brain barrier upon sonopermeation. Theranostics. 10 (4), 1948-1959 (2020).
- Carmen, J. C., et al. Ultrasonic-enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Journal of Infection and Chemotherapy. 10 (4), 193-199 (2004).
- Runyan, C. M., et al. Low-frequency ultrasound increases outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa. The Journal of General and Applied Microbiology. 52 (5), 295-301 (2006).
- Yemane, P. T., et al. Effect of ultrasound on the vasculature and extravasation of nanoscale particles imaged in real time. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (11), 3028-3041 (2019).
- van Wamel, A., et al. Acoustic Cluster Therapy (ACT) enhances the therapeutic efficacy of paclitaxel and Abraxane® for treatment of human prostate adenocarcinoma in mice. Journal of Controlled Release. 236, 15-21 (2016).
- Snipstad, S., et al. Ultrasound improves the delivery and therapeutic effect of nanoparticle-stabilized microbubbles in breast cancer xenografts. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
- Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Aslund, A. K. O., et al. Nanoparticle delivery to the brain-By focused ultrasound and self-assembled nanoparticle-stabilized microbubbles. Journal of Controlled Release. 220, 287-294 (2015).
- Downs, M. E., Buch, A., Karakatsani, M., Konofagou, E. E., Ferrera, V. P. Blood-brain barrier opening in behaving non-human primates via focused ultrasound with systemically administered microbubbles. Scientific Reports. 5, 15076 (2015).
- Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
- Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103 (2019).
- Lentacker, I., et al. Lipoplex-loaded microbubbles for gene delivery: a Trojan Horse controlled by ultrasound. Advanced Functional Materials. 17 (12), 1910-1916 (2007).
- De Temmerman, M., et al. mRNA-Lipoplex loaded microbubble contrast agents for ultrasound-assisted transfection of dendritic cells. Biomaterials. 32 (34), 9128-9135 (2011).
- Burke, C. W., Alexander, E., Timbie, K., Kilbanov, A. L., Price, R. J. Ultrasound-activated agents comprised of 5FU-bearing nanoparticles bonded to microbubbles inhibit solid tumor growth and improve survival. Molecular Therapy. 22 (2), 321-328 (2014).
- Mørch, Ý, et al. Nanoparticle-stabilized microbubbles for multimodal imaging and drug delivery. Contrast Media & Molecular Imaging. 10 (5), 356-366 (2015).
- Jamburidze, A., et al. Nanoparticle-coated microbubbles for combined ultrasound imaging and drug delivery. Langmuir. 35 (31), 10087-10096 (2019).
- Snipstad, S., et al. Sonopermeation enhances uptake and therapeutic effect of free and encapsulated cabazitaxel. Ultrasound in Medicine and Biology. , (2021).
- De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
- Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
- Klymchenko, A. S., et al. Highly lipophilic fluorescent dyes in nano-emulsions: towards bright non-leaking nano-droplets. RSC Advances. 2 (31), 11876 (2012).
- Aslund, A. K. O., et al. Quantification and qualitative effects of different PEGylations on Poly (butyl cyanoacrylate) Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 14 (8), 2560-2569 (2017).
- Born, M., Wolf, E. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge; New York. (1999).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Hak, S., Reitan, N. K., Haraldseth, O., de Lange Davies, C. Intravital microscopy in window chambers: a unique tool to study tumor angiogenesis and delivery of nanoparticles. Angiogenesis. 13 (2), 113-130 (2010).
- Fusser, M., et al. Cabazitaxel-loaded Poly (2-ethylbutyl cyanoacrylate) nanoparticles improve treatment efficacy in a patient derived breast cancer xenograft. Journal of Controlled Release. 293, 183-192 (2019).
- Abou-Saleh, R. H., et al. Molecular effects of glycerol on lipid monolayers at the gas-liquid interface: impact on microbubble physical and mechanical properties. Langmuir. 35 (31), 10097-10105 (2019).
- Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e55115 (2018).
- Luan, Y., et al. Lipid shedding from single oscillating microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (8), 1834-1846 (2014).
- Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 1-8 (2014).
- Mathiyazhakan, M., et al. Non-invasive controlled release from gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes through pulse laser induced microbubble cavitation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 126, 569-574 (2015).
- Vos, H. J., Emmer, M., de Jong, N. Oscillation of single microbubbles at room versus body temperature. 2008 IEEE Ultrasonics Symposium. , 982-984 (2008).
- Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall-a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
- Sijl, J., et al. Acoustic characterization of single ultrasound contrast agent microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (6), 4091-4097 (2008).
- Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90 (11), 114103 (2007).
- Baresch, D., Garbin, V. Acoustic trapping of microbubbles in complex environments and controlled payload release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15490-15496 (2020).
- Maresca, D., et al. Acoustic sizing of an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (10), 1713-1721 (2010).
- Renaud, G., Bosch, J. G., vander Steen, A. F. W., de Jong, N. An "acoustical camera" for in vitro characterization of contrast agent microbubble vibrations. Applied Physics Letters. 100 (10), 101911 (2012).
- Renaud, G., Bosch, J. G., Van Der Steen, A. F. W., De Jong, N. Low-amplitude non-linear volume vibrations of single microbubbles measured with an "acoustical camera.". Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (6), 1282-1295 (2014).
- Luan, Y., et al. Combined optical sizing and acoustical characterization of single freely-floating microbubbles. Applied Physics Letters. 109 (23), (2016).
- Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: Fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10 (1), 011501 (2016).
- Guan, J., Matula, T. J. Using light scattering to measure the response of individual ultrasound contrast microbubbles subjected to pulsed ultrasound in vitro. The Journal of the Acoustical Society of America. 116 (5), 2832-2842 (2004).
- Sofias, A. M., Åslund, A. K. O., Hagen, N., Grendstad, K., Hak, S. Simple and robust intravital microscopy procedures in hybrid TIE2GFP-BALB/c transgenic mice. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 486-493 (2020).
- Ritsma, L., Steller, E. J. A., Ellenbroek, S. I. J., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. M., van Rheenen, J. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
