Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري لديناميكيات الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للفأر

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

نقدم إعداد شرائح أنسجة البنكرياس الحادة واستخدامها في المجهر المجهري للمسح بالليزر البؤري لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في وقت واحد في عدد كبير من الخلايا الحية ، على مدى فترات زمنية طويلة ، وبدقة مكانية زمانية عالية.

Abstract

شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفئران هي إعداد فريد من نوعه في الموقع مع الاتصالات بين الخلايا المحفوظة وبنية الأنسجة التي تنطوي على تغييرات أقل بكثير من المستحضر من الجزر المعزولة أو الأسيني أو القنوات أو الخلايا المشتتة الموصوفة في الدراسات النموذجية في المختبر. من خلال الجمع بين شريحة أنسجة البنكرياس الحادة وتصوير الكالسيوم للخلايا الحية في المجهر الضوئي بالليزر البؤري (CLSM) ، يمكن دراسة إشارات الكالسيوم في عدد كبير من خلايا الغدد الصماء والإفرازات الخارجية في وقت واحد ، بدقة خلية واحدة أو حتى دون الخلية. تسمح الحساسية بالكشف عن التغيرات وتمكن من دراسة الموجات بين الخلايا والاتصال الوظيفي وكذلك دراسة اعتماد الاستجابات الفسيولوجية للخلايا على توطينها داخل الجزيرة وعلاقة paracrine مع الخلايا الأخرى. أخيرا ، من منظور رعاية الحيوان ، فإن تسجيل الإشارات من عدد كبير من الخلايا في وقت واحد يقلل من عدد الحيوانات المطلوبة في التجارب ، مما يساهم في مبدأ استبدال 3R وتقليله وصقله.

Introduction

البنكرياس الثدييات هو إفرازات كبيرة وغدة صماء. يشكل الجزء الخارجي 96-99٪ من إجمالي حجم البنكرياس ويتكون من الأسيني والقنوات. يتكون جزء الغدد الصماء من عدد كبير من جزر لانغرهانز التي تمثل 1-4٪ المتبقية من إجمالي حجم البنكرياس1. يفرز الجزء الخارجي إنزيمات هضمية رئيسية تكسر البوليمرات الغنية بالطاقة في الطعام ، بالإضافة إلى سائل غني بالبيكربونات ، والذي يتحد مع إفرازات الجهاز الهضمي الأخرى لتوفير بيئة مناسبة لعمل الإنزيمات. يفرز جزء الغدد الصماء الهرمونات التي تنظم التوزيع والتخزين والإطلاق بين الأكل للمغذيات الغنية بالطاقة. على الرغم من أن الأنسجة الخارجية متخلفة نسبيا والغدد الصماء متطورة نسبيا عند الولادة ، إلا أن الأولى سرعان ما تتضخم في الأخيرة عند الفطام2،3،4. تميزت الدراسات المبكرة لوظيفة البنكرياس بولادة علم وظائف الأعضاء الحديث ، وقد أعقبت التطورات المنهجية الرئيسية في هذا المجال اختراقات علمية رئيسية5. يعد العمل مع البنكرياس تحديا تقنيا بسبب البنية المعقدة للغدة ، ولكنه أيضا دافع كبير بسبب أمراض مثل سرطان البنكرياس والتهاب البنكرياس والسكري التي تشكل تهديدات كبيرة للصحة العامة ، والتي تحتاج إلى نهج علاجية جديدة.

تم تطوير الجزر المعزولة6 و acini7,8 وشظايا القنوات واستخدامها لعقود كطرق قياسية ذهبية بسبب مزاياها مقارنة بخطوط الخلايا وخلايا الغدد الصماء الأولية المشتتة و acinar و ductal cells 9,10. على الرغم من التحسن الملحوظ في وظيفة مجموعات الخلايا المعزولة ، إلا أن هذه الطرق لا تزال تنطوي على إجهاد ميكانيكي وإنزيمي كبير ، وتعزل الخلايا عن الأنسجة المحيطة ، وبالتالي تفتقر إلى تفاعلات paracrine والدعم الميكانيكي ، والأهم من ذلك ، أنها مصحوبة بتغييرات كبيرة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي11,12,13 . تم تطوير شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفئران في عام 2001 بدافع الحاجة المتصورة لتطوير منصة تجريبية مشابهة لشرائح الدماغ والغدة النخامية والغدة الكظرية مع الاتصالات المحفوظة بين الخلايا ، وتفاعلات paracrine ، واللحمة المتوسطة ، وبنية الأنسجة ، وكذلك بدون بعض أهم أوجه القصور في الطريقة القياسية الذهبية في أبحاث الجزر في ذلك الوقت - الجزر المعزولة12 ، 14. ومن بين أوجه القصور هذه الأضرار التي لحقت بالطبقات الخارجية، وعدم إمكانية الوصول إلى مناطق الجزر الأساسية، والحاجة إلى الزراعة مع تأثيرات مهمة محتملة على هوية الخلية وعلم وظائف الأعضاء12،15. علاوة على ذلك ، تتيح طريقة شرائح الأنسجة إجراء دراسات على النماذج الحيوانية ذات بنية الجزر المختلة بشكل كبير حيث يستحيل عزل الجزر ، أو عندما يكون محصول الجزر منخفضا للغاية من خلال العزل التقليدي16،17،18،19،20،21.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الشريحة أكثر ملاءمة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثناء تطور مرض السكري والتهاب البنكرياس ، على سبيل المثال ، لأنها تمكن من إلقاء نظرة عامة أفضل على الأنسجة بأكملها ومتوافقة أيضا مع دراسة الاختلافات الإقليمية. الأهم من ذلك ، على الرغم من التركيز المبكر على جزء الغدد الصماء ، فإن طريقة شريحة الأنسجة تمكن بطبيعتها من دراسة مكونات الإفرازات9،22،23. خلال العقد الأول بعد إدخالها ، تم استخدام الطريقة للدراسات الكهروفسيولوجية لخلايا بيتا14،24،25،26،27،28،29 وألفا30،31 وكذلك لفحص النضج المورفولوجي والوظيفي للبنكرياس2،3 . بعد عقد من الزمان في عام 2013 ، تم تكييف الطريقة بنجاح لتصوير الكالسيوم في الخلايا الحية للخلايا الجزرية باستخدام CLSM لتوصيف استجاباتها للجلوكوز32 ، وأنماط الاتصال الوظيفية 33 ، والعلاقة بين إمكانات الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا من خلال الجمع بين صبغة الكالسيوم الفلورية مع صبغة غشاء محتمل34. في وقت لاحق من نفس العام ، تم استخدام الطريقة أيضا لتقييم ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا الأسينار22,35. على مدى السنوات التالية ، تم استخدام شرائح أنسجة البنكرياس في عدد من الدراسات المختلفة وتكييفها بنجاح مع الخنازير والأنسجة البشرية9،36،37،38،39،40،41. ومع ذلك ، إذا أخذنا معا ، فإن تصوير الكالسيوم - في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية بشكل عام وفي الجزر بشكل خاص - لا يزال يتم تنفيذه في الغالب من قبل هذه المجموعة. قد يكمن أحد الأسباب الرئيسية لذلك في الجمع بين إعداد شريحة الأنسجة الصعبة تقنيا ، والحاجة إلى مجهر بؤري ، وتحليل البيانات المعقدة إلى حد ما. والهدف الرئيسي من هذه الورقة هو جعل هذه الطريقة القوية في متناول المستخدمين المحتملين الآخرين.

هناك بالفعل بعض المقالات المنهجية الممتازة التي تتعامل بالتفصيل مع إعداد شرائح الأنسجة واستخدام الشرائح للدراسات الهيكلية والإفرازات ، ولكن ليس لتصوير الكالسيوم البؤري9،42،43. لذلك ، تركز هذه الورقة على بعض النصائح والحيل الإضافية أثناء إعداد الشرائح ، وعلى الخطوات الحاسمة لتحميل الصبغة بنجاح ، والحصول على الصور ، وكذلك على الخطوات الرئيسية لتحليل بيانات الكالسيوم الأساسية. ولذلك، ينبغي النظر إلى هذه المساهمة على أنها مكملة للطريقة المذكورة أعلاه وليست بديلا لها. وبالمثل ، يجب النظر إلى تصوير الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية على أنه نهج تجريبي يستخدم للإجابة على أسئلة محددة ، وبالتالي فهو مكمل بدلا من أن يكون بديلا مطلقا لنهج تصوير الكالسيوم الأخرى في فسيولوجيا البنكرياس مثل القنوات المعزولة أو الأسيني ، والجزر المعزولة ، والمواد العضوية ، والجزر المزروعة في الغرفة الأمامية للعين ، والتسجيلات في الجسم الحي11،44،45،46،47،48. ربما يكون أفضل دليل على وعد تصوير الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية هو التسجيلات الناجحة الأخيرة لديناميات الكالسيوم في الخلايا الوسيطة الجزرية مثل pericytes49 و macrophages50 ، وكذلك في الخلايا القنية23.

Protocol

ملاحظة: أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في البحوث. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل إدارة جمهورية سلوفينيا لسلامة الأغذية والقطاع البيطري ووقاية النباتات (رقم التصريح: 34401-35-2018/2).

1. إعداد شرائح أنسجة البنكرياس

ملاحظة: يتطلب إعداد شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للفئران لتصوير الكالسيوم باستخدام CLSM عددا من الأدوات والحلول المختلفة ويستمر في سلسلة من الخطوات الحرجة المعروضة تخطيطيا في الشكل 1 والموضحة بالتفصيل أدناه.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل. تمثيل تخطيطي لجميع الخطوات في عملية إعداد شريحة أنسجة البنكرياس ، بدءا من حقن الأغاروز في القناة الصفراوية المشتركة ، تليها استخراج البنكرياس وتقطيعه. يمكن استخدام الشرائح المحضرة لتقييم جدوى الأنسجة باستخدام مجموعة Live/Dead أو ملطخة بمستشعر الكالسيوم. بمجرد تلطيخها ، تكون جاهزة للتصوير. ثم يتم استخدام التسجيلات التي تم الحصول عليها من عملية التصوير لتحليل البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد الحلول
    ملاحظة: يجب إعداد جميع المحاليل مسبقا ويمكن تخزينها في الثلاجة عند 4-8 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. لإعداد وتخزين شرائح الأنسجة ، هناك حاجة إلى ما يقرب من 0.5 لتر من المحلول خارج الخلية (ECS) مع 6 mM الجلوكوز و 0.3 L من المخزن المؤقت 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES). ليوم واحد من تصوير الكالسيوم مع نظام perifusion المحدد في 1-2 مل / دقيقة معدل التدفق ، هناك حاجة إلى حوالي 0.5 لتر من ECS.
    1. محلول خارج الخلية مع جلوكوز 6 ملليمتر
      1. تحضير 1 لتر من ECS يحتوي على 125 mM NaCl ، 26 mM NaHCO 3 ، 6 mM glucose ، 6 mM حمض اللبنيك ،3 mM myo-inositol ، 2.5 mM KCl ، 2 mM Na pyruvate ، 2 mM CaCl 2 ، 1.25 mM NaH 2 PO4 ، 1 mM MgCl 2 ،و 0.5 mM حمض الأسكوربيك. اخلطي جيدا حتى تذوب جميع المكونات تماما. خذ 50 ميكرولتر من ECS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل ، وضعه على مقياس التناضح وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتحقق من الأسمولية.
        ملاحظة: يجب أن يكون الأسمولية 300-320 mOsm. لتحفيز خلايا بيتا ، استخدم المحاليل ذات تركيزات الجلوكوز الأعلى. لضمان قيمة الأس الهيدروجيني الفسيولوجي 7.4 أثناء التقطيع والتجارب ، قم باستمرار بفقاعة ECS مع الكاربوجين (أي خليط غاز من 95٪ O 2 و 5٪ CO2) عند الضغط الجوي. يمكن إعداد نظام فقاعي بسيط عن طريق توصيل أحد طرفي أنبوب السيليكون مقاس 5 مم بمصدر الكاربوجين (أي أسطوانة غاز مضغوطة) والطرف الآخر من الأنابيب الموضوعة مباشرة في الزجاجة التي تحتوي على ECS.
      2. بدلا من ذلك ، قم بإعداد مخزون 10x يحتوي على 1250 mM NaCl و 260 mM NaHCO3 و 30 mM myo-inositol و 25 mM KCl و 20 mM Na pyruvate و 12.5 mM NaH2PO4 و 5 mM حمض الأسكوربيك. عندما تكون هناك حاجة إلى ECS يحتوي على 6 mM الجلوكوز ، امزج 100 مل من المخزون مع 2 مل من 1 M CaCl 2 ، و 1 مل من 1 M MgCl 2 ، و 0.455 مل من 13.2 M من حمض اللاكتيك ، و 1.08 g من الجلوكوز ، واملأ بالماء المقطر المزدوج حتى 1 لتر. إذا لزم الأمر، استخدم كميات مختلفة من الجلوكوز للحصول على تركيزات الجلوكوز الأخرى.
    2. مخزن مؤقت HEPES مع جلوكوز 6 ملليمتر
      1. تحضير 0.5 لتر من المحلول المخزن مؤقتا ب HEPES (HBS) الذي يحتوي على 150 mM NaCl و 10 mM HEPES و 6 mM glucose و 5 mM KCl و 2 mM CaCl 2 و 1 mM MgCl2 ؛ المعايرة إلى الرقم الهيدروجيني = 7.4 مع 1 M NaOH.
        ملاحظة: في حالة عدم توفر الكاربوجين، يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت لكافة الخطوات بدلا من ECS.
    3. أغاروز (1.9٪ ث / ث)
      1. قم بتسخين حمام مائي إلى 40 درجة مئوية.
      2. أضف 0.475 جم من الأغاروز منخفض الانصهار و 25 مل من ECS الذي يحتوي على 6 ملليمترات من الجلوكوز إلى قارورة Erlenmeyer ، وضع القارورة في فرن الميكروويف بأقصى طاقة لبضع ثوان حتى تبدأ في الغليان. أخرجي القارورة من الفرن وقومي بتدويرها عدة مرات ، حتى يذوب الأغاروز تماما. انقل القارورة مع الأغاروز السائل إلى الحمام المائي المسخن مسبقا عند 40 درجة مئوية لتبريد الأغاروز إلى درجة الحرارة المطلوبة وإبقائه سائلا حتى الحقن. قم بتأمين القارورة بحلقة رصاص مثبتة.
        ملاحظة: يمكن تحضير الأغارو مسبقا وحفظه في الثلاجة. قبل الاستخدام ، قم بتسخين الأغاروز في فرن الميكروويف حتى يتم تسييله ، وانقل قارورة Erlenmeyer إلى حمام مائي تم تسخينه مسبقا إلى 40 درجة مئوية. يمكن إعادة استخدام الأغاروز حتى 5x. إذا أعيد استخدامه بعد 5x ، فسيصبح كثيفا وأصعب في الحقن.
  2. حقن البنكرياس مع الأغاروز
    ملاحظة: يشرح القسمان 1.2 و 1.3 إعداد شرائح الأنسجة التي يمكن استخدامها لأغراض تجريبية مختلفة مثل تصوير الكالسيوم والفيزيولوجيا الكهربية والكيمياء النسيجية المناعية ودراسات الإفراز والدراسات الهيكلية / التشريحية الدقيقة.
    1. املأ حقنة سعة 5 مل بالأغاروز السائل من قارورة Erlenmeyer في الحمام المائي من الخطوة 1.1.3.2 ، وقم بإزالة أي فقاعات ، وقم بتركيب إبرة 30 جم. حماية الإبرة مع غطاء، والحفاظ على حقنة مملوءة مرة أخرى في حمام مائي مع إبرة متجهة لأسفل وكامل حجم الأغاروز تحت سطح الماء. قم بتأمين المحقنة بحلقة رصاص مثبتة بطريقة تضغط الحلقة على المحقنة على جدار الحمام المائي.
      ملاحظة: احرص على عدم دفع أي أغاروز إلى الإبرة لأنها ستتصلب بسرعة وتسد الإبرة. إذا كانت درجة حرارة الغرفة منخفضة ، وإذا تم إجراء الحقن من قبل شخص أقل خبرة ، فقم بزيادة درجة حرارة الحمام المائي حتى 42 درجة مئوية لكسب بعض الوقت الإضافي للحقن.
    2. املأ دلو الثلج بالثلج ، وضع الزجاجة التي تحتوي على ECS فيه. قم بفقاعة ECS باستمرار عند 1.5 مل / دقيقة باستخدام الكاربوجين عند الضغط الجوي ودرجة حرارة الغرفة لضمان الأوكسجين ودرجة الحموضة 7.4.
    3. التضحية بفأر عن طريق إعطاء تركيز عال من ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم. بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات.
    4. من خلال العمل تحت المجهر المجسم، يمكنك الوصول إلى البطن عن طريق بضع البطن (الشكل 2A). اقلب الأمعاء بلطف إلى الجانب الأيسر من الماوس (من المنظور التشريحي للماوس) لفضح القناة الصفراوية المشتركة. استخدم الملقط لرفع الجزء الاثني عشر قليلا ، وابحث عن حليمة الاثني عشر الرئيسية في Vater. قم بتثبيت القناة الصفراوية الشائعة في الحليمة الاثني عشر باستخدام مرقئ (الشكل 2B ، C) لمنع تسرب الأغاروز من القناة إلى الاثني عشر.
      ملاحظة: لمنع تسرب الأغاروز إلى الاثني عشر وإلى أعلى ولأسفل في الجهاز الهضمي ، ضع المرقأ بطريقة تشبك أيضا الاثني عشر بالقرب من الحليمة وبعيدة. من الأفضل استخدام مرقئ منحني لهذا الغرض.
    5. باستخدام ملقط حاد صغير ، يمكنك الوصول إلى أسفل القناة الصفراوية الشائعة ، وكسر الغشاء الذي يربط القناة بأنسجة البنكرياس. للحصول على تحكم بصري أفضل وحقن أسهل ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والنسيج الضام من القناة.
    6. ضع القناة عموديا على ملقط كبير (الشكل 2D) ، وحقن الأغاروز السائل المحضر في الجزء القريب من القناة الصفراوية الشائعة (الشكل 2D). تأكد من الضغط على المحقنة بقوة لأن الأغاروز لزج. استمر في ملء البنكرياس حتى يصبح أبيض اللون ومنتفخا قليلا أو لمدة 20-30 ثانية على الأقل.
      ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في إعداد الشرائح. إذا كان هناك أي مكامن خلل في شجرة البنكرياس القنية ، فقم برفع البنكرياس بلطف أو سحبه بعيدا عن المحقنة لتسويتها. لا تقرر متى تتوقف عن الحقن بناء على الحجم الذي يتم حقنه من المحقنة لأن التدفق العكسي عند نقطة الحقن والتسرب الأمامي إلى الاثني عشر عادة ما يكون أعلى بكثير من الحجم الذي يتم حقنه في شجرة البنكرياس القنوية. الأهم من ذلك ، يمكن إجراء الحقن الناجحة مع تغييرات غير ملحوظة عمليا في حجم الحقنة.
    7. قم بإزالة المحقنة ، وصب ببطء 20 مل من ECS المثلج البارد عند 0-4 درجة مئوية من الزجاجة على البنكرياس لتبريد الأنسجة وتصلب الأغاروز.
    8. استخرج البنكرياس بلطف باستخدام الملقط والمقص الناعم المقطوع. ضع البنكرياس المستخرج في طبق بتري 100 مم يحتوي على ~ 40 مل من ECS البارد المثلج ، وحركه بلطف لغسله. انقل البنكرياس إلى طبق بتري طازج 100 مم يحتوي على ~ 40 مل من ECS المثلج.
    9. من الجزء المحقون جيدا من البنكرياس ، والذي يبدو أبيض (الشكل 3A) ، قطع ما يصل إلى 6 كتل من الأنسجة ، بحجم 0.1-0.2 سم3 ، باستخدام ملقط ومقص صعب. قم بمسحها من أي نسيج ضام ودهني.
    10. املأ طبق بتري غير لزج غير لزج 35 مم بحوالي 5 مل من الأغاروز السائل عند 40 درجة مئوية ، وانقل كتل الأنسجة إليه ، وضع طبق بتري على الفور على الجليد لتبريده وتصلب الأغارو.
      ملاحظة: تحدد الطريقة التي يتم بها احتجاز كتل البنكرياس في الأغاروز الطريقة التي يتم قطعها بها أثناء التقطيع. يمكن للتجريبيين ذوي الخبرة محاولة ضبط موضع الكتل خلال اللحظات القليلة التي تسبق تصلب الأغاروز عند وضعها على الجليد.
    11. بعد أن يتصلب الأغاروز مع كتل الأنسجة ، اقلب طبق بتري رأسا على عقب على سطح أملس مستو مثل غطاء طبق بتري 100 مم ، وقم بإزالة الأغاروز عن طريق القطع بلطف بنصف شفرة حلاقة في الهامش بين الجدار الجانبي لطبق بتري والأغاروس. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع مكعبات الأغاروز الفردية ، التي يحتوي كل منها على كتلة أنسجة واحدة ، مع الحرص على أن تكون كل كتلة أنسجة محاطة بالأغاروس. قم بلصق كتل الأغاروز على لوحة عينة الاهتزاز باستخدام غراء سيانوكريليت (الشكل 3B).

Figure 2
الشكل 2: حقن الأغاروز في القناة الصفراوية المشتركة . (أ) فتح تجويف البطن ، وكشف الأعضاء في التجويف البريتوني. (ب) الجزء المكبر من المساحة المحاط بالمستطيل في اللوحة A. تشير البقعة البيضاء على الاثني عشر (المشار إليها بالسهم) إلى أمبولة فاتر. يشار إلى جزر لانغرهانس برؤوس السهام. (ج) قم بتثبيت أمبولة فاتر بواسطة مرقئ منحني ، وارفعها قليلا لفضح القناة الصفراوية المشتركة (السهم) وتمديدها بلطف. (د) تعليب القناة الصفراوية المشتركة وحقن محلول الأغاروز بنسبة 1.9٪ باستخدام حقنة 5 مل وإبرة 30 جم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تشريح
    1. املأ غرفة القطع في الاهتزاز ب ~ 0.15 لتر من ECS البارد المثلج ، وقم بالفقاعة باستمرار باستخدام مادة كربونية. أحط غرفة القطع بالثلج ، وأضف مكعبي ثلج (~ 10 مل لكل منهما) مصنوعين من ECS مع 6 ملليمتر جلوكوز في غرفة القطع. قم بتركيب شفرة الحلاقة للقطع على الاهتزاز ، وقم بتثبيت لوحة العينة بمسامير باستخدام كتل الأغاروز في مكانها.
    2. اضبط القطاعة على قطع كتل الأغاروز عند 0.05 إلى 1 مم / ثانية و 70 هرتز إلى شرائح بسماكة 140 ميكرومتر بمساحة سطح تتراوح بين 20-100 مم2. بالنسبة لإعدادات مقسم طريقة العرض، اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
    3. مباشرة بعد كل خطوة قطع ، أوقف القطاعة مؤقتا ، واجمع الشرائح بلطف باستخدام فرشاة طلاء ناعمة ، وانقلها إلى طبق بتري 100 مم مملوء ب 40 مل من المخزن المؤقت HEPES مع جلوكوز 6 ملليمتر في درجة حرارة الغرفة (الشكل 3C).
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشرائح في مخزن HEPES المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة على الأقل، ويجب استبدال المخزن المؤقت كل 2 ساعة.

Figure 3
الشكل 3: تحضير أنسجة البنكرياس وتقطيعها إلى شرائح . (أ) البنكرياس الفأر المستخرج بعد حقن الأغاروز. يشير النسيج الأبيض على اليسار إلى جزء جيد الحقن (جزء الاثني عشر) ، في حين أن الجزء الأكثر احمرارا على اليمين يظهر الجزء غير المحقون بشكل كاف من البنكرياس (الجزء الطحالي). (ب) تقطيع الاهتزاز لكتلتين من أنسجة البنكرياس المضمنة في الأغاروز. (ج) شريحة أنسجة البنكرياس الحادة مع جزر لانغرهانز المشار إليها برؤوس السهام. شريط المقياس = 3000 ميكرومتر (D) شريحة أنسجة البنكرياس الحادة تحت المجهر الضوئي مع جزيرة لانغرهانز المشار إليها برأس السهم ، تشير العلامة النجمية إلى قناة البنكرياس. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. فحص حي / ميت باستخدام LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit لخلايا الثدييات

ملاحظة: بالنسبة لبعض التجارب ، من المفيد التحقق من صلاحية الخلايا في الشرائح (الشكل 4) عن طريق الفحص الحي / الميت على النحو التالي.

  1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإذابة القوارير مع كواشف مجموعة LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit ، وإعداد حلول عمل من الكالسين AM قبل الاستخدام مباشرة. استخدم الحلول في غضون يوم واحد.
  2. في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، امزج 5 ميكرولتر من 4 mM calcein AM (المكون A) ، و 20 ميكرولتر من 2 mM ethidium homodimer-1 (EthD-1 ، المكون B) ، و 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (D-PBS) من Dulbecco لإعداد محلول عمل يحتوي على حوالي 2 ميكرومتر كالسين AM و 4 ميكرومتر EthD-1. دوامة بدقة.
  3. باستخدام فرشاة طلاء ناعمة، انقل شرائح الأنسجة برفق إلى طبق بتري سعة 3 مل مع مخزن HEPES العازل الطازج لتخفيف نشاط إستراز المصل. قم بإزالة المخزن المؤقت HEPES ، وقم بتغطية الشرائح ب 100-200 ميكرولتر (أو أكثر إذا لزم الأمر) من حل العمل من الخطوة 2.2.
  4. احتضن الشرائح لمدة 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في طبق بتري مغلق. قم بتصوير شرائح الأنسجة باستخدام مرشحات الإثارة / الانبعاثات على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.

3. تحميل صبغة الكالسيوم

ملاحظة: يجب حماية أصباغ الفلورسنت من التعرض للضوء أثناء العملية الكاملة لإعداد وتحميل الصبغة ، وكذلك أثناء التعامل مع شرائح الأنسجة الملطخة. يمكن استخدام رقائق القصدير لتغطية الأنابيب أو أطباق بتري التي تحتوي على صبغة الكالسيوم.

  1. إعداد الصبغة
    1. إذابة محتويات قارورة واحدة (50 ميكروغرام) من صبغة مؤشر Ca 2+ النفاذة للخلية (الإثارة / الانبعاثات 495/523 نانومتر ؛ انظر جدول المواد) ، 7.5 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 2.5 ميكرولتر من polaxamer (محلول20٪ في DMSO ؛ جدول المواد) في 6.667 مل من HBS تحتوي على 6 مللي متر جلوكوز في أنبوب غطاء لولبي 15 مل.
      ملاحظة: يحتوي هذا الحل النهائي على 6 ميكرومتر من صبغة مؤشر Ca2+ و 0.11٪ DMSO و 0.037٪ polaxamer.
    2. شفط وطرد الحل في أنبوب الغطاء اللولبي بشكل متكرر باستخدام ماصة لمدة 20 ثانية ؛ غمر الأنبوب في غرفة حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 ثانية ، ودوامة لمدة 30 ثانية لتحسين الذوبان. Aliquot 3.333 مل من محلول صبغة مؤشر Ca2+ النهائي المعد في الخطوة 3.1.1 في أطباق بتري سعة 5 مل.
  2. تحميل الصبغة
    1. انقل شرائح الأنسجة المحضرة من طبق بتري سعة 60 مل مع HBS إلى 5 مل من أطباق بتري المملوءة بمحلول الصبغة عن طريق رفع كل شريحة أنسجة بلطف باستخدام فرشاة طلاء رقيقة وناعمة ووضعها في محلول الصبغة. احتضان ما يصل إلى 10 شرائح الأنسجة لكل طبق بتري.
    2. ضع طبق بتري المحمل بالشرائح على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة مضبوطة على الحركة المدارية عند 40 دورة في الدقيقة لمدة 50 دقيقة. احتضن الشرائح الموجودة في محلول الصبغة المعرضة للهواء المحيط في درجة حرارة الغرفة ، ولكن محمية من الضوء عن طريق تغطية طبق بتري بورق القصدير.
  3. تخزين الشرائح
    1. انقل شرائح الأنسجة الملطخة من طبق بتري سعة 5 مل إلى طبق بتري سعة 60 مل مملوء ب HBS الخالي من الصبغة عن طريق رفعها بلطف باستخدام فرشاة طلاء ناعمة وناعمة. يخزن ما يصل إلى 20 شريحة لكل طبق بتري.
      ملاحظة: استخدم شرائح الأنسجة للتصوير في هذه المرحلة. ستحتفظ شرائح الأنسجة بصبغة مؤشر Ca2+ لعدة ساعات. يمكن تحسين بقاء الشرائح والاحتفاظ بالصبغة عن طريق وضع طبق بتري في حاوية معزولة ، محاطة بالثلج. هذا مهم بشكل خاص إذا كان سيتم نقل الشرائح المحملة بالصبغة. بالإضافة إلى ذلك ، تبادل HBS كل 2 ساعة.

4. تصوير الكالسيوم

  1. إعداد المجهر البؤري
    1. اختر تكبيرا موضوعيا مناسبا اعتمادا على اهتمام الدراسة. حدد 20x و 25x (فتحة العددية [NA] 0.77-1.00) لتصور جزيرة كاملة أو عدة acini في وقت واحد أو قنوات أكبر. حدد تكبيرات أعلى لدراسة الديناميكيات داخل الخلايا.
    2. اختر وضع الاكتساب للتصوير بالفاصل الزمني (على سبيل المثال، الفاصل الزمني أو xyt أو الوضع المشابه). اضبط الثقب على 100-200 ميكرومتر.
    3. اضبط مسار الضوء للفلوروفورات الخضراء: الإثارة عند 488 نانومتر ، وجمع الانبعاثات عند 500-700 نانومتر. يفضل اختيار أجهزة الكشف ذات الكفاءة الكمومية العالية (على سبيل المثال ، فوسفيد زرنيخيد الغاليوم) على كاشفات المضاعف الضوئي.
  2. إعداد غرفة التسجيل ونظام التسريب
    1. قم بتركيب غرفة التسجيل على المرحلة التي يتم التحكم في درجة حرارتها من المجهر ونظام التآوي (إما الإعداد القائم على الجاذبية أو القائم على المضخة التمعجية ، الحجم 1 مل). ضع المدخل والمخرج على الحواف البعيدة لغرفة التسجيل لتجنب تعرج البيرفوسات داخل الغرفة، واضبط التدفق الداخل والخارج على قيم متساوية (1-2 ملليلتر/دقيقة). تجنب الانجراف من ارتفاع الغضروف المفصلي السائل والقطرات في perifusate.
    2. اضبط التحكم في درجة حرارة نظام التسريب على 37 درجة مئوية.ابدأ عملية الترسيب باستخدام المحلول غير المحفز ، وقم بإعداد المحاليل المحفزة. قم بتغيير الحلول عبر الصمامات الآلية أو عن طريق تبديل الحلول التي تغذي نظام التروية يدويا.
  3. سجل ديناميكيات الكالسيوم
    1. انقل شريحة نسيج واحدة إلى غرفة التسجيل. شل حركة شريحة الأنسجة بوزن بلاتيني على شكل حرف U مع شبكة نايلون مشدودة (على سبيل المثال ، من جوارب النايلون). تجنب وضع خيوط النايلون فوق هيكل الاهتمام.
    2. حدد موقع جزيرة / acinus / قناة باستخدام خيار brightfield. قم بتشغيل التصوير المباشر لوضع الهياكل المدروسة في مجال الرؤية ، وإعداد معلمات التصوير. قم بتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق ضبط طاقة الليزر وتضخيم الكاشف ومتوسط / ربط الخط للسماح بتصور الخلايا مع الحفاظ على الحد الأدنى من طاقة الليزر.
    3. اضبط المستوى البؤري للتسجيل على ~ 15 ميكرومتر تحت سطح القطع (الشكل 5) لتجنب التسجيل من الخلايا التي يحتمل أن تكون تالفة على سطح القطع.
    4. الحصول على الصور. اضبط تردد أخذ العينات على 1-2 هرتز للكشف عن التذبذبات الفردية في البداية، واستخدم ماسحا ضوئيا رنينا قادرا على خط سريع في المتوسط (8-20) بمعدل اكتساب أعلى (>10 هرتز) لتسجيل نشاط Ca 2+ داخل الخلايا ([Ca2+]IC). اسمح بفاصل زمني (على سبيل المثال، 30٪ من إجمالي وقت أخذ العينات) بين إضاءات النقاط المتتالية لمنع السمية الضوئية. سجل صورة عالية الدقة (على سبيل المثال، 1024 × 1024 بكسل، بمتوسط خط > 50) قبل الحصول على السلاسل الزمنية (انظر القسم 5).
      ملاحظة: تردد أخذ العينات من 1-2 هرتز أقل من معيار Nyquist لتردد الاكتساب لمعظم الخلايا، وسيتم أخذ عينات أقل من شكل الإشارة بشكل افتراضي.
    5. ارجع إلى مخطط عبر الإنترنت ، إذا كان متوفرا في برنامج التصوير ، للحصول على تعليقات فورية حول استجابة التحضير ، والإضاءة الزائدة ، والتبييض الضوئي ، والانجراف الميكانيكي. في حالة ارتفاع معدل التبييض أثناء الاقتناء ، أوقف التسجيل وقلل من طاقة الليزر مع زيادة كسب الكاشف للحفاظ على نسبة الإشارة إلى الضوضاء. في حالة الانجراف الميكانيكي ، تحقق من وجود توتر بين الأنابيب / الكابلات ومرحلة المجهر وكذلك تسرب السائل أو تغيرات الحجم في غرفة التسجيل. اختياريا ، حاول تصحيح الانجراف أثناء الاكتساب يدويا ؛ ومع ذلك ، لاحظ أن هذا سيؤدي بطبيعته إلى نتائج محدودة.
      ملاحظة: خلايا الغدد الصماء غير متجانسة للغاية عند تركيزات قريبة من العتبة. هناك حاجة إلى طول كاف من التحفيز للكشف عن نطاق تأخيرات التنشيط / التعطيل في الخلايا الفردية. هذا مهم بشكل خاص للكشف الدقيق عن الاستجابات خارج نطاق الاستجابات باتباع بروتوكولات محفزة للغاية.
    6. استخدم تصوير الكالسيوم للتمييز الوظيفي بين الخلايا الداخلية والخلايا الخارجية (الشكل 6). لتسجيل النشاط العابر أثناء التنشيط وإلغاء التنشيط، قم بتطبيق المحفزات دون إيقاف التسجيل.
    7. احفظ البيانات بعد انتهاء التجربة (فكر في استخدام وظيفة الحفظ التلقائي). اسمح بفترة تبريد قبل إيقاف تشغيل طاقة الليزر حتى لا تتلف أشعة الليزر أثناء إجراء إيقاف التشغيل.

5. تحليل البيانات

  1. افحص التسجيل بصريا نوعيا عن طريق إعادة تشغيل فيديو الفاصل الزمني. تحقق من انجراف الخلايا من مجال الرؤية أو المستوى البصري. في حالة حدوث انحراف داخل المستوى البصري ، استخدم المكون الإضافي لتصحيح الانجراف في ImageJ.
  2. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) باستخدام برنامج المجهر أو برنامج تابع لجهة خارجية. استخدم الصورة عالية الدقة أو الحد الأقصى للإسقاط أو متوسط الإطار كمرجع لتحديد عائد الاستثمار. أعد تشغيل التصوير بالفاصل الزمني لتصور الخلايا المستجيبة غير المرئية في الصور المرجعية. ضع عائد الاستثمار بحيث لا تتداخل المنطقة المحددة من عائد الاستثمار مع الخلايا المجاورة لتجنب التداخل بين عائد الاستثمار.
  3. تصدير بيانات السلاسل الزمنية كمتوسط قيمة عائد الاستثمار لكل إطار. تصدير إحداثيات عائد الاستثمار.
  4. تصحيح بيانات السلاسل الزمنية للتبييض (الشكل 7 ألف) باستخدام مزيج من الملاءمة الأسية والخطية، كما هو موضح في
    Equation 1(1)
    حيث يشير x(t) إلى إشارة التألق عند نقطة زمنية t ؛ xcorr(t) الإشارة المصححة في النقاط الزمنية المقابلة ؛ و a و b و c معلمات الملاءمة المحسوبة كأقل مجموع من المربعات بين corr(t) و x(t).
  5. تحليل مرحلة التنشيط والتعطيل للاستجابة (الشكل 7B). احسب المشتقة الأولى من بيانات السلسلة الزمنية، وحدد ذروة المشتق وحضيضه المقابل للتنشيط والتعطيل، على التوالي. بدلا من ذلك ، حدد يدويا بداية الزيادة التدريجية. حفظ وتصدير أوقات التنشيط/إلغاء التنشيط وإحداثيات الخلايا المقابلة.
  6. تحليل مرحلة الهضبة (الشكل 7C). اكتشاف التذبذبات الفردية عن طريق تحديد عتبة البيانات الخام أو عن طريق تحديد المشتقة الأولى من بيانات السلاسل الزمنية. حدد بداية ونهاية التذبذب الفردي على أنه الوقت المقابل لسعة نصف التذبذب.
    1. احسب مدة وتواتر التذبذبات الفردية لكل خلية. احسب القيمة العكسية للفاصل الزمني بين السنبلة (مناسبة لأنماط النشاط العادية). بدلا من ذلك ، اقسم عدد التذبذبات على الفاصل الزمني للسجل (مناسب لأنماط النشاط غير المنتظمة).
    2. احسب الوقت النشط. عبر عن الوقت النشط كمجموع المدد ، واقسم هذه القيمة على الفاصل الزمني. بدلا من ذلك ، اضرب التردد والمدة التي تتوافق مع التذبذب.
      ملاحظة: إن قسمة مجموع المدد على الفاصل الزمني يوفر نتائج قوية، ولكن له تمييز إحصائي منخفض حيث يتم الحصول على نقطة بيانات واحدة لكل خلية. إن ضرب تواتر ومدة التذبذب يوفر دقة زمنية من التذبذب إلى التذبذب.

Representative Results

حقن محلول الأغاروز في قناة البنكرياس هو الخطوة الأكثر أهمية في إعداد شريحة أنسجة البنكرياس. يمكن التعرف على الحقن الناجح عن طريق تبييض أنسجة البنكرياس ، كما هو موضح على الجانب الأيسر من الشكل 3A ، في حين يتم عرض جزء حقن غير كامل من البنكرياس على الجانب الأيمن من الشكل 3A. يمكن التعرف على جزر لانغرهانس بالعين المجردة أو تحت المجهر المجسم، وهذا يساعد في قطع الأجزاء المناسبة من البنكرياس لتضمينها لاحقا في كتل الأغاروز (الشكل 3 ب). في شريحة أنسجة البنكرياس الفأرية المقطوعة حديثا ، يمكن تمييز جزر Langerhans بسهولة عن الأنسجة الخارجية المحيطة واللحمة المتوسطة كبقع بيضاء تحت المجهر المجسم (الشكل 3C) أو كهياكل بنية تحت المجهر الضوئي (الشكل 3D). يمكن استخدام شرائح أنسجة البنكرياس لأنواع متميزة من التجارب لمدة 12 ساعة على الأقل بعد التقطيع. بالإضافة إلى التقييم المورفولوجي الإجمالي تحت المجهر المجسم ، والمجهر الضوئي ، والاستجابات الوظيفية للخلايا أثناء تصوير الكالسيوم ، يمكن تقييم صلاحية شرائح أنسجة البنكرياس (الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4: صلاحية الخلايا داخل شريحة الأنسجة. تم تحديد صلاحية الخلايا باستخدام فحص الأحياء / الأموات. الخلايا الحية ملطخة بواسطة Calcein AM (كما هو موضح باللون الأخضر) ، في حين أن الخلايا الميتة ملطخة ب ethidium homodimer-1 (كما هو موضح باللون الأحمر). تشير الخطوط الصفراء إلى موضع المقطع العرضي X-Y من مكدس Z المعروض في الأسفل واليمين. العمق الكامل ل Z-stack هو 88 ميكرومتر .

بالنسبة لتجارب تصوير الكالسيوم ، يحتاج مؤشر الكالسيوم الفلورسنت إلى اختراق بضع طبقات من الخلايا. يعرض الشكل 5A التحميل الناجح لصبغة مؤشر Ca2+ القابلة للنفاذ الخلوي في شريحة أنسجة البنكرياس التي يمكن من خلالها التعرف على الخلايا الجزرية الفردية والخلايا الأسينارية. في المقابل ، فإن الشرائح في الشكل 5B-D ليست مثالية بسبب الاختراق غير الناجح للصبغة (الشكل 5B) ، ونقص الخلايا الجزرية (الشكل 5C) ، والكثير من الأنسجة الميتة على السطح (الشكل 5D). يمكن التخلص من هذه الشرائح ، أو التحقق من وجود جزر إضافية يتم قطعها أو تلوينها بشكل أفضل (انظر الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها) ، أو استخدامها لتسجيل استجابات الخلايا الإفرازية.

Figure 5
الشكل 5: أمثلة على المستحضرات القابلة للاستخدام وغير القابلة للاستخدام . (أ) مثال على التحضير الناجح لشريحة أنسجة البنكرياس مع خلايا ملطخة جيدا في جزر لانغرهانز ، وكذلك الخلايا القنوية والأنسجة الأسينية المحيطة. (ب) مثال على شريحة أنسجة ملطخة بشكل سيء. (ج) مثال على جزيرة لانغرهانس التي توقفت هيكليا. (د) مثال على جزيرة لانغرهانس التي تحتوي على العديد من الخلايا الميتة والكثير من الحطام. يعرض جدول البحث "التوهج ، التوهج السفلي" على اليمين 0 كثافة باللون الأخضر والتشبع باللون الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر النتائج التمثيلية من تصوير الكالسيوم باستخدام صبغة مؤشر Ca2+ القابلة للنفاذ الخلوي في الشكل 6. في الشكل 6 أ ، يتم تقديم صورة عالية الدقة لشريحة أنسجة البنكرياس ، تحتوي على جزيرة من Langerhans ، وأنسجة acinar ، وقناة البنكرياس. للحصول على تمييز أفضل ، يتم تلوين الجزء الصماء والإفرازات والأقنية من شريحة أنسجة البنكرياس المعروضة في الشكل 6A في الشكل 6B. يمكن أن يؤدي استخدام المحفزات المناسبة إلى التمييز وظيفيا بين الخلايا الجزرية المختلفة ، أو الخلايا الجزرية وغير الجزرية51. عادة ما تستجيب خلايا بيتا لتحفيز النبض المربع بواسطة الجلوكوز مع زيادة عابرة في [Ca2+] IC تليها تذبذبات الكالسيوم السريعة على هضبة مستدامة (الشكل 6C ، اللوحة العلوية).

نظرا لأن جميع خلايا بيتا مقترنة في تزامن وظيفي واحد كبير ، فإن هذه التذبذبات متزامنة أيضا بشكل جيد للغاية بين الخلايا المختلفة عن طريق نشر موجات IC [Ca2 +] 32,34,52,53,54 (الشكل 7C). قد تكون تذبذبات IC الأبطأ [Ca2+] مع فترة 5-15 دقيقة وراء التذبذبات السريعة أو حتى تكون النوع السائد من reponse55,56. وقد يكشف نفس البروتوكول البسيط عن أنواع أخرى من الاستجابات، لا سيما في محيط الجزر الصغيرة (الشكل 6C، اللوحة السفلية). نظرا لأن هذه الخلايا لا تتزامن مع خلايا بيتا وتستجيب بتذبذبات أسرع وأكثر انتظاما موجودة بالفعل في ظروف الجلوكوز المنخفضة أو مع انخفاض النشاط ، فإن هذه الاستجابات توحي بشدة بالخلايا غير بيتا21،32،57،58. ومع ذلك ، فإن توصيفها الوظيفي النهائي يتطلب بروتوكولات أكثر تعقيدا مع خطوات تحفيز إضافية أو نهج بديلة ، والتي تتم مناقشتها أدناه. يتم عرض الاستجابات النموذجية للخلايا الأسينارية والقنوية في الشكل 6D والشكل 6E ، على التوالي. ارجع إلى الأدبيات لمزيد من التفاصيل حول الخلايا الأسينية والقنوية22،23،35.

Figure 6
الشكل 6: النتائج التمثيلية لديناميات الكالسيوم في أنواع متميزة من خلايا البنكرياس . (أ) صورة عالية الدقة لجزيرة لانغرهانس مع الأنسجة المحيطة بها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (B) تحديد أجزاء متميزة من أنسجة البنكرياس مع أنسجة أسينار مبينة باللون الأصفر ، وجزيرة لانجرهانز تظهر باللون الأحمر ، وجزء من شجرة الأقنية باللون الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (C) الآثار النموذجية لديناميات الكالسيوم في خلايا بيتا والخلايا غير المفترضة أثناء التحفيز باستخدام الجلوكوز 12 ملليمتر ؛ تم استخدام الجلوكوز 3 mM للظروف غير المحفزة. يتم وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها للتمييز الأكثر تحديدا للخلايا غير بيتا في قسم المناقشة. (د) أثر نموذجي لديناميات الكالسيوم للخلايا الأسينار التي تحفزها 25 نانومتر أستيل كولين. (ه) أثر نموذجي لديناميات الكالسيوم للخلايا القنية التي يحفزها حمض تشينوديوكسيكوليك 1 ملليمتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد التصوير الناجح للكالسيوم ، يتم تصدير البيانات أولا وتصحيحها للتبييض عن طريق مزيج من الملاءمة الأسية والخطية ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. وترد في الشكل 7 ألف سلسلة زمنية قبل تصحيح التبييض وبعده. بعد ذلك ، يمكن تحليل العديد من المعلمات في مرحلة التنشيط والتعطيل للاستجابة وكذلك مرحلة الهضبة. يمكن قياس التأخير في بداية زيادة [Ca2+] IC بعد التحفيز كما هو موضح في التأخيرA في الشكل 7B وعدم التجانس في التأخير بين الخلايا الفردية (التأخيرA1). يمكن استخدام نفس المعلمات (تأخيرD وتأخيرD1) لوصف مرحلة إلغاء التنشيط. بعد الزيادة الأولية العابرة [Ca 2+] IC ، تتميز مرحلة الهضبة في معظم خلايا بيتا البنكرياسية في الجزيرة بتذبذبات IC عالية التردد منتظمة نسبيا [Ca2+]. يمكن وصف مرحلة الهضبة من خلال تحليل المعلمات الوظيفية الكلاسيكية. ويعرض الشكل 7C العرض التخطيطي لفترات تذبذبات [Ca2+] IC وترددها ونسبتها المئوية للوقت النشط. في تصوير الكالسيوم بمعدلات اكتساب أعلى من 10 هرتز ، يمكن أيضا التعرف بوضوح على موجات الكالسيوم المنتشرة بشكل متكرر عبر الجزيرة (الشكل 7C).

Figure 7
الشكل 7: تحليل بيانات السلاسل الزمنية . (أ) تصحيح بيانات السلاسل الزمنية للتبييض الضوئي. (ب) تحليل حالات التأخير في التنشيط بعد التحفيز وتعطيل التنشيط بعد التوقف عن التحفيز باستخدام الجلوكوز 12 ملليمتر. يشار إلى مدة التحفيز بالشريط الرمادي الفاتح المظلل في الصورة. (ج) تحليل عدة بارامترات لمرحلة الهضبة: أولا) مدة التذبذب المحددة عند نصف الارتفاع، ثانيا) تواتر التذبذبات التي تحددها فترات التذبذب البيني. III) الوقت النشط كنتاج لتكرار ومدة التذبذبات. I-IV) التأخير بين التذبذبات في أي موجة معينة من التذبذبات التي تنتشر عبر جزيرة لانغرهانز التي تحددها التأخيرات (Δt) في الوقت الذي تصل فيه خلية واحدة إلى نصف ارتفاع التذبذب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

طريقة شريحة أنسجة البنكرياس هي طريقة تجريبية سريعة لدراسة مورفولوجيا وفسيولوجيا أجزاء الغدد الصماء والإفرازات الخارجية من البنكرياس في إعداد أكثر حفظا في الموقع. وقد سبق الإشارة إلى العديد من المزايا في المقدمة. تجدر الإشارة إلى أنه بشكل عام (أي ليس فقط لتصوير الكالسيوم) ، فإن نهج الشريحة لدراسة فسيولوجيا البنكرياس يوفر الوقت لأنه لا ينطوي على فترة نقاهة بعد العزلة. هذا الأخير ليس ضروريا للغاية مع جميع أنواع التجارب واستخدامات الجزر المعزولة من أنواع مختلفة ، ولكنه يستخدم عادة لزيادة النقاء ، واستعادة الجدوى والوظائف ، وأحيانا لجمع الجزر من عدة جهات مانحة 59,60,61,62,63,64 . ومع ذلك ، في سياق تصوير الكالسيوم ، تم العثور على استجابات خلايا بيتا تعتمد على مدة وظروف الزرع ، وهذا مصدر مهم للاختلاف الذي يجب مراعاته عند استخدام الجزر المعزولة15,65. يجب النظر في نفس المشكلة بالنسبة لشرائح الأنسجة إذا أصبحت ثقافتها طويلة الأجل خيارا مستخدما على نطاق واسع في المستقبل22,36. تتميز طريقة شريحة الأنسجة أيضا بغلة عالية وبالتالي من المحتمل أن تقلل من معاناة الحيوانات وتزيد من القوة الإحصائية. علاوة على ذلك ، حيث يمكن تحضير العديد من الشرائح من واحد ولأن الشرائح تبقى على قيد الحياة لفترات طويلة ، بما في ذلك نفس الحيوان أو حتى نفس الجزيرة في كل من المجموعات التجريبية والضابطة يصبح ممكنا.

نظرا للحفاظ على البنية الأصلية والاتصالات من خلية إلى خلية ، ولأنها متوافقة مع عدد من التحليلات الهيكلية ، والفيزيولوجيا الكهربية ، وطرق التصوير ، وفحوصات إفراز الهرمونات ، فإن هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة وظائف البنكرياس التي تعتمد على التفاعلات غير المضطربة بين الخلايا الفردية ، على سبيل المثال ، الحساسية للإفراز ، paracrine والتفاعلات المناعية بين أنواع الخلايا المختلفة ، أنماط النشاط الكهربائي ، وخصائص ديناميكيات الكالسيوم ، وإفراز الهرمونات المختلفة. بالنسبة لتصوير الكالسيوم على وجه التحديد ، تتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام الشرائح في تعرض قلب الجزيرة وإمكانية الحصول على إشارات من العديد من أنواع الخلايا المختلفة بدقة عالية. اعتمادا على متطلبات التجربة وعمر الحيوانات ، يمكن أن يختلف السمك ، ويمكن نقل الشرائح ، أو الحصول عليها من الحيوانات مع مراسلين مشفرين وراثيا. وكما هو موضح بمزيد من التفصيل أدناه، فإن النهجين الأخيرين يمكنان أيضا من تحديد وتوصيف وظيفي محدد للاستجابات من الخلايا غير بيتا 31,66. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة الجزر من أجزاء محددة جيدا من العضو للاختلافات في الاستجابة أو القابلية للأمراض. على الرغم من أنها لا تتطلب فترة حضانة للتعافي ، إلا أنه يمكن احتضانها بسهولة بعوامل دوائية مختلفة ، وأحماض دهنية ، ونسبة عالية من الجلوكوز ، والسيتوكينات.

الأهم من ذلك ، نظرا لأن الدقة العالية قابلة للتحقيق بالاقتران مع دقة أحادية الخلية أو حتى دون الخلوية ، فإن تصوير الكالسيوم البؤري في شرائح هو أحد أنسب الطرق لتحليل موجات الكالسيوم ، والاتصال الوظيفي ، والأدوار الوظيفية المختلفة للخلايا في أجزاء متميزة من جزيرة54,67. على الرغم من عدد من المزايا ، فإن نهج شريحة الأنسجة له قيود مهمة. أولا ، لا يزال مدمرا جزئيا على الأقل لبنية الجزيرة والإفرازات ، خاصة على السطح المقطوع ، وهناك حاجة إلى احتياطات ، مثل درجة الحرارة المنخفضة ، والتبادل المتكرر للحلول ، والتلاعب اللطيف والسريع ، أثناء التحضير لمنع حدوث أضرار إنزيمية ميكانيكية وداخلية إضافية. ثانيا ، لا تزال أنماط توصيل المغذيات والإفرازات أقل شأنا من الطريق في الجسم الحي ، ويتم فصل المستحضر عن التعصيب الجهازي ، وردود الفعل بين الأعضاء ، مثل بين الجزيرة وأنسجتها المستهدفة ، مستحيلة ، على عكس النهج في الجسم الحي. ثالثا ، الحد الأقصى لسمك الشريحة محدود بالأوكسجين ، وتوصيل المغذيات ، وتنظيم درجة الحموضة عند ~ 200 ميكرومتر9. علاوة على ذلك ، يحتاج كل من إعداد الشرائح والتصوير إلى الكثير من التدريب ، وتتطلب التحليلات المتعمقة لبيانات الكالسيوم من سلاسل زمنية طويلة ومن العديد من الخلايا معرفة متخصصة لا يتم تضمينها في كثير من الأحيان في مجموعة أدوات عالم فسيولوجي كلاسيكي وتتطلب مساعدة من الفيزيائيين أو علماء البيانات. ميزة الحفاظ على التفاعلات المثلية وغير المتجانسة يمكن أن تعقد أيضا تحليل العينات بسبب وجود إشارات من خلايا أخرى في المناطق ذات الاهتمام. اعتمادا على البروتوكولات ، يمكن أن يؤدي تنشيط الخلايا الأخرى إلى تحفيز إضافي غير مباشر أو تثبيط خلية مرصودة.

ولا يمكن حل هذه المشكلة بشكل قاطع إلا من خلال نهج إزالة الالتفاف، وبروتوكولات التحفيز الأكثر تعقيدا بما في ذلك المواد التي تمنع بعض الآثار غير المباشرة، وباستخدام محددة بالضربة القاضية، ومن خلال المقارنة الدقيقة للنتائج مع نتائج الدراسات الأخرى التي تستخدم منهجيات أكثر اختزالا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت قياسات الإفراز ضرورية ، فيجب أن يؤخذ في الاعتبار أن بعض الشرائح قد تفتقر إلى الجزر ، وأن الكتلة الإجمالية لأنسجة الغدد الصماء في شريحة واحدة عادة ما تكون منخفضة. يتضمن إعداد شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للتصوير العديد من الخطوات الحاسمة التي تمت مناقشتها في الأقسام التالية وملخصة في الجدول 1 ، حيث يمكن للقارئ أيضا العثور على نصائح قصيرة ولكنها مهمة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا ، عند تحضير محلول الأغاروز ، يجب أن يذوب مسحوق الأغاروز تماما ، وإلا فإن الجسيمات غير الذائبة قد تعيق الحقن. حافظ على محلول الأغاروز المتجانس عند 37-45 درجة مئوية لمنع تصلب الأغاروز بسبب درجة الحرارة المنخفضة جدا من ناحية ولمنع تلف الأنسجة بسبب درجات الحرارة المرتفعة جدا من ناحية أخرى. بعد الاستخدام ، يمكن تخزين الأغاروز المتبقي عند 4 درجات مئوية وإعادة تسخينه ، على الرغم من أن إعادة التسخين المتكررة يمكن أن تؤدي إلى زيادة الكثافة بسبب تبخر الماء ، مما يجعل الحقن صعبا أو مستحيلا في النهاية.

الخطوة الحاسمة التالية في التحضير هي تثبيت الحليمة الاثني عشر الرئيسية بشكل صحيح. تشير البقعة البيضاء على الاثني عشر إلى تقاطع القناة الصفراوية المشتركة والاثني عشر. سيؤدي المشبك الذي يتم وضعه بالقرب جدا إلى انسداد بعض فروع البنكرياس الجانبية للقناة المشتركة ، مما يؤدي إلى تعطيل حقن هذه الأجزاء ، في حين أن المشبك الذي يتم وضعه بعيدا جدا سيؤدي إلى تسرب الأغاروز عبر مسار المقاومة السفلي مباشرة إلى الاثني عشر. قبل تقليب القناة الصفراوية المشتركة ، يمكن إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بعناية للحصول على تصور أفضل للقناة وتحكم أكبر أثناء الحقن. قد تؤدي الدقة غير الكافية أثناء إزالة الأنسجة المحيطة إلى ثقب القناة. اختيار قطر الإبرة المستخدمة لحقن الأغاروز مهم أيضا. في الفئران ، يفضل استخدام إبرة 30 جم ؛ تتطلب الإبر الأصغر (32 أو 33 جم) مزيدا من الجهد بسبب اللزوجة العالية لمحلول الأغاروز وهي أكثر عرضة للانسداد. ومع ذلك ، إذا تم استخدامها مع محلول أغاروز منخفض الكثافة ، فيمكن أن تكون مفيدة جدا في سلالات الفئران الأصغر والحيوانات الأصغر سنا. خلال الأيام الأولى بعد الولادة ، يمكن بدلا من ذلك حقن الأغاروز تحت المحفظة بدلا منداخل القناة 2. من المرجح أن يؤدي استخدام الإبر ذات القطر الأكبر في الفئران إلى إتلاف القناة الصفراوية الشائعة. يمكن أن يحدث هذا أيضا مع قطر الإبرة الصحيح ، ويمكن أن يساعد الملقط في الحفاظ على الإبرة في مكانها أثناء الحقن. قد تكون الإبر ذات القطر الأكبر هي الحل الوحيد في حالة القنوات الأكبر ، كما هو الحال في الفئران. إذا كانت الإبرة ضيقة جدا بحيث لا تضمن وجود ختم محكم يمنع التسرب الخلفي، فقد يتم وضع رباط حولها عند الدخول بنجاح إلى القناة.

يستغرق حقن الأغاروز بعض الجهد بسبب لزوجة المحلول ، وبمجرد بدء عملية الحقن ، لا ينبغي مقاطعته لأن محلول الأغاروز منخفض الانصهار قد يتصلب في الإبرة أو أكبر أجزاء شجرة الأقنية قبل اكتمال الحقن. سيؤدي ذلك إلى ضعف اختراق الأنسجة ودعم أسوأ أثناء القطع. يجب دائما تعليب القناة عند النقطة التي تنضم فيها القناة الكبدية اليسرى والقناة الكيسية لتشكيل القناة الصفراوية المشتركة. إذا تم ثقب القناة الصفراوية المشتركة ، فحاول مرارا وتكرارا أن تقصف بالقرب من الاثني عشر. عندما يتم تثبيت البنكرياس بما فيه الكفاية بمحلول الأغاروز واستخراجه من التجويف البريتوني ، يتم قطع قطع صغيرة من الأنسجة المحقونة جيدا. قبل تضمينها في الأغاروز ، من الضروري إزالة جميع الأنسجة الدهنية والضامة لأن بقاياها تجعل التقطيع أكثر تحديا. وينطبق الشيء نفسه على الأوعية الدموية وبقايا القنوات ، إلا عندما تكون محور التجربة. في هذه الحالة ، تأكد من وضعها بطريقة يتم فيها الحصول على المقطع العرضي المطلوب. عند تضمين الأنسجة في الأغاروز ، تأكد من أن درجة الحرارة مناسبة (37 درجة مئوية) ، وأن الأنسجة محاطة بالكامل بالأغاروز ، حيث يمكن للقوى أثناء تقطيع الاهتزاز أن تمزق أنسجة البنكرياس من كتل الأغاروز.

يمكن أن يساعد تجفيف كتل الأنسجة بسرعة قبل وضعها في الأغاروز عن طريق وضعها لفترة وجيزة على منديل ورقي في منع ضعف الاتصال بين الأنسجة والأغاروز خلال هذه الخطوة. أثناء تصلب كتل الأغاروز ، ضع طبق بتري أفقيا ، ومنع الاتصال بين أنسجة البنكرياس والجزء السفلي من طبق بتري. إذا لم يتم حقن البنكرياس بالكامل ، فستكون عملية القطع صعبة. لذلك ، حاول تقليل سرعة القطع للحصول على شرائح الأنسجة. لتقليل تلف الخلايا أثناء تقطيع الاهتزاز ، استبدل ECS (ومكعبات الثلج المصنوعة من ECS) في غرفة التقطيع بانتظام. هذا الأخير سوف يقلل من نشاط إنزيمات البنكرياس التي يتم إطلاقها من الأنسجة الأسينية أثناء التقطيع. سمك الشرائح له أهمية حاسمة أيضا. بالنسبة لديناميات الكالسيوم والتجارب الكهروفسيولوجية ، عادة ما يتم قطع شرائح 140 ميكرومتر ؛ ومع ذلك ، وفقا للهدف من الدراسة ، يمكن أن يتراوح سمك الشريحة من 90 ميكرومتر إلى 200 ميكرومتر. ضع في اعتبارك أنه في الشرائح الأكثر سمكا ، سيكون انتشار الأكسجين والمواد المغذية محدودا ، ولكنه سيشمل المزيد من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتوقع أن تزداد نسبة الجزر غير المقطوعة مع زيادة سمك الشريحة. يمكن تخزين الشرائح في ECS متبادلة بانتظام في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات أو حتى زراعتها في وسط خلية مناسب لعدة أيام ؛ ومع ذلك ، قد يؤثر هذا في النهاية على فسيولوجيا الخلايا الجزرية الطبيعية 3,22.

عند تحضير محلول الصبغة ، تأكد من الخلط الدقيق لجميع المكونات ، وتجنب التعرض للضوء المحيط. تتكون شريحة البنكرياس من العديد من طبقات الخلايا ، ويقتصر امتصاص صبغة الكالسيوم على طبقات الخلايا القليلة الأولى الأكثر سطحية ، كما هو موضح سابقا للجزر المعزولة58,68 ، وشرائح الغدة النخامية 69. ومع ذلك ، على عكس الجزر المعزولة حيث تعيق الكبسولة المحيطة وطبقات الخلايا الخارجية تغلغل الصبغة في طبقات أعمق ، تسمح شرائح الأنسجة بالوصول إلى كامل سطح المقطع العرضي للجزيرة ، مما يتيح قياسا متزامنا لديناميكيات الكالسيوم في مئات الخلايا من جميع طبقات الجزيرة. مؤشرات Fluorescent Ca2+ هي الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس ديناميكيات الكالسيوم ، وجنبا إلى جنب مع CLSM ، فإنها تمكن التسجيلات بدقة زمنية عالية ، تصل إلى عدة مئات من الهرتز. عند اختيار مؤشر Ca2+ الفلورسنت الأنسب ، ضع في اعتبارك عوامل مختلفة ، بما في ذلك شكل المؤشر ، الذي يؤثر على طريقة تحميل الخلية ، ووضع القياس (النوعي أو الكمي) ، وثابت التفكك (Kd) الذي يجب أن يكون في نطاق تركيز Ca 2 + ذي الأهمية ويعتمد على درجة الحموضة ودرجة الحرارة ووجود Mg2 + والأيونات الأخرى ، وكذلك ربط البروتين. نظرا لأن إشارات Ca 2+ الخلوية عادة ما تكون عابرة ، فيجب أيضا مراعاة ثابت معدل ارتباط Ca2+. لقياس ديناميكيات [Ca 2+] IC في خلايا البنكرياس ، تستخدم هذه المجموعة بشكل أساسي صبغة مؤشر Ca2+ النفاذة للخلية الموضحة في هذا البروتوكول (جدول المواد) لأنها مؤشر طول موجي طويل مع الأطوال الموجية للانبعاثات في الطيف حيث يكون التألق الذاتي الخلوي عادة أقل إشكالية ، وطاقة ضوء الإثارة منخفضة ، مما يقلل من احتمال حدوث تلف ضوئي خلوي. نظرا لأن هذه الصبغة فلورية بتركيزات منخفضة من Ca2+ ، فإن هذا يسهل تحديد خط الأساس [Ca2 +] IC ويزيد من الرؤية الخلوية قبل التحفيز. بعد ربط Ca2+ ، تزداد شدة التألق للصبغة 14 ضعفا ، مما يتيح اكتشاف تغييرات طفيفة في [Ca2 +] IC.

لنجاح تصوير الكالسيوم في الخلايا الحية ، يجب النظر في العديد من معلمات الأجهزة الحاسمة ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية حيث تكون سعات الإشارة منخفضة وفرص السمية الضوئية عالية ، يفضل استخدام الأهداف ذات NA الأعلى لجمع المزيد من الضوء من العينة. إذا كان يجب تسجيل ديناميكيات الكالسيوم بدقة زمنية عالية ، فاستخدم الماسح الضوئي الرنان بدلا من الجلفانومتر الخطي. إلى جانب اختيار الهدف الصحيح ، فإن استخدام أجهزة الكشف عالية الحساسية - مثل أجهزة الكشف الهجينة التي تتطلب طاقة ليزر أقل - يتجنب السمية الضوئية والتبييض الضوئي. هذا له أهمية خاصة لتصوير الكالسيوم طويل الأمد. الخطوات الهامة الأخرى في تصوير الكالسيوم هي إعدادات المعلمات لجودة الصورة لعمليات الاستحواذ على السلاسل الزمنية. أهمها الدقة الزمنية والمكانية. وبما أن ديناميات الكالسيوم في حد ذاتها تحدد أدنى دقة زمنية مقبولة، يجب أن يكون معدل أخذ العينات أعلى بضعفين على الأقل من تردد الإشارة المتوقع للكشف عن الإشارة أو حتى أعلى 10 مرات للكشف عن شكل الإشارة بشكل موثوق. في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة ، يمكن قياس ديناميكيات الكالسيوم في مئات الخلايا في وقت واحد ، وبالتالي ، فإن الدقة المكانية مهمة أيضا. يمكن تعزيز ذلك عن طريق زيادة عدد وحدات البكسل أو عن طريق زيادة متوسط الخط أثناء الاكتساب المباشر. ومع ذلك ، بسبب العلاقة العكسية بين الدقة المكانية والزمنية ، هناك حاجة إلى المفاضلة بين كلا الإعدادين.

إذا كان لا بد من إجراء تصوير الكالسيوم في مجموعة خلايا معينة داخل البنكرياس ، فمن الضروري وجود حافز قادر على التمييز وظيفيا بين الخلايا داخل الشريحة. الجلوكوز العالي ينشط خلايا بيتا بشكل موثوق وسريع إلى نمط تذبذبي يتم فرضه على مستوى مرتفع من الكالسيوم ويتم تزامنه بشكل كبير بين جميع الخلايا داخل جزيرة 32,58,70. خلايا بيتا هي أكثر أنواع الخلايا عددا داخل الجزيرة وتقع في الغالب في قلب الجزيرة في الفئران. ينخفض نفس بروتوكول التحفيز وأحيانا لا يغير بشكل ملحوظ الانفجار في خلايا ألفا 30،32،58،70،71،72. للتمييز بين خلايا ألفا وظيفيا ، يمكن استخدام الجلوكوز المنخفض (3 ملليمتر) أو الغلوتامات أو الأدرينالين لزيادة ترددها أو القاعدية [Ca 2+] IC21,72,73,74,75. وهي تمثل 10-20٪ من الخلايا الجزيرية وسيتم اكتشافها على محيط الجزيرة1. تم العثور على خلايا دلتا أيضا على الأطراف. وهي تشكل فقط ~ 5٪ من إجمالي عدد خلايا الغدد الصماء في الجزيرة وعادة ما تكون نشطة في الجلوكوز 6 mM وتستجيب لتحفيز الجلوكوز مع زيادة نشاط الانفجار غير المنتظم من خط الأساس أو مستوى الكالسيوم المرتفع قليلا 1,32,71,76. يمكن استخدام الجريلين لتحفيز محدد لخلايا دلتا21،77،78،79 في تجارب تصوير الكالسيوم. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد بروتوكولات لتحديد وظيفي محدد لخلايا PP و epsilon. علاوة على ذلك ، 25 نانومتر أستيل كولين ينشط بشكل موثوق الخلايا الأسينار في نشاط انفجار35،80،81. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام عدد من الإفرازات الأخرى ، مثل cerulein و cholecystokinin و carbamylcholine ، لاستحضار استجابات الكالسيوم في الخلايا الأسينار22,40,82,83.

أخيرا ، يستحضر حمض شينوديوكسيكوليك 1 mM استجابات الكالسيوم بشكل موثوق في الخلايا القنية في شرائح الأنسجة. يمكن أيضا استخدام الأنجيوتنسين II و ATP وبعض الإفرازات الأخرى11،23،84،85. عندما لا يكون التحديد الوظيفي القائم على الاستجابات المميزة لإفرازات ومثبطات محددة كافيا ، يمكن استخدام الحيوانات المصنفة وراثيا 31 أو الخلايا المنقولة73 أو الكيمياء المناعية لتحديد أنواع الخلايا المختلفة 9,22,71,86 . خلال العامين الماضيين ، تم تكييف طريقة شريحة الأنسجة بنجاح مع الأنسجة البشرية ، مما فتح العديد من الطرق البحثية المهمة الجديدة في كل من إفرازات41 وفسيولوجيا الغدد الصماء9،36،37،39. ومن المثير للاهتمام أن إجراء تقييم مفصل لديناميات الكالسيوم في الجزر البشرية كان صعبا للغاية ولا يزال يتعين التحقيق فيه بمزيد من التفصيل87. جنبا إلى جنب مع المجهر البؤري المتقدم ، مكنت طريقة شريحة أنسجة البنكرياس من العديد من الأفكار الجديدة في ديناميكيات الكالسيوم في الفئران ونأمل أن تفعل الشيء نفسه بالنسبة للأنسجة البشرية.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث تم إجراؤه في غياب أي مصلحة تجارية أو مالية.

Acknowledgments

تم دعم العمل المقدم في هذه الدراسة ماليا من قبل وكالة البحوث السلوفينية (رقم التمويل الأساسي للبحوث. P3-0396 و I0-0029 ، بالإضافة إلى أرقام المشاريع البحثية. J3-9289 و N3-0048 و N3-0133) ومن قبل صندوق العلوم النمساوي / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (المنح الثنائية I3562--B27 و I4319--B30). ونشكر ماروشا روشر وماسا تشاتر ورودي ملاكار على المساعدة التقنية الممتازة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Tags

علم الأحياء ، العدد 170 ، البنكرياس ، الأغاروز ، شريحة الأنسجة ، إعداد في الموقع ، مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري ، تصوير الكالسيوم ، دقة خلية واحدة ، 3R
المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري لديناميكيات الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stožer, A., Dolenšek, J.,… More

Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter