Summary
يلخص هذا العمل خطوات تطوير فحوصات مختلفة للكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام نظام ddPCR بلونين. الخطوات مفصلة وتم تضمين ملاحظات حول كيفية تحسين المقايسات وأداء التجربة. يمكن استخدام هذه المقايسات للعديد من تطبيقات SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
يعد تشخيص جائحة SARS-CoV-2 المستمرة أولوية لجميع البلدان في جميع أنحاء العالم. حاليا ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) هو المعيار الذهبي لتشخيص SARS-CoV-2 حيث لا يتوفر حل دائم. على الرغم من فعالية هذه التقنية ، فقد ظهرت الأبحاث التي تظهر حدودها في الكشف والتشخيص خاصة عندما يتعلق الأمر بالأهداف الوفيرة المنخفضة. في المقابل ، ثبت أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR) ، وهي تقنية ناشئة حديثة ذات مزايا فائقة على qPCR ، تتغلب على تحديات RT-qPCR في تشخيص SARS-CoV-2 من عينات مستهدفة منخفضة الوفرة. في المستقبل ، في هذه المقالة ، يتم توسيع قدرات RT-ddPCR بشكل أكبر من خلال إظهار خطوات حول كيفية تطوير مقايسات المسبار البسيط ، والمزدوج ، والثلاثي ، والرباعي باستخدام نظام الكشف بلونين. باستخدام الاشعال والمجسات التي تستهدف مواقع محددة من جينوم SARS-CoV-2 (N و ORF1ab و RPP30 و RBD2) ، تبين أن تطوير هذه المقايسات ممكن. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة وملاحظات واقتراحات حول كيفية تحسين سير عمل المقايسات وتحليل البيانات. سيضمن تكييف سير العمل هذا في الأعمال المستقبلية إمكانية اكتشاف الحد الأقصى لعدد الأهداف بحساسية في عينة صغيرة مما يحسن بشكل كبير التكلفة وإنتاجية العينة.
Introduction
شهد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو تقنية معترف بها جيدا ، العديد من التحولات منذ ظهوره ليصبح تقنية قوية قادرة على تقديم إجابات لأبحاث الحمض النووي. كانت هذه التحولات تحسينا مستمرا للتقنية القديمة. يمكن تلخيص هذه التحولات في ثلاثة أجيال1. الجيل الأول هو تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي الذي يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي لتحديد الأهداف المضخمة واكتشافها. الجيل الثاني هو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) الذي يمكنه اكتشاف العينات في الوقت الفعلي والاعتماد على منحنى قياسي لتحديد الأهداف مباشرة في العينة. يمكن للجيل الثالث ، PCR الرقمي (dPCR) ، إجراء كل من الكشف والقياس الكمي المطلق لأهداف الحمض النووي دون الحاجة إلى منحنى قياسي. كما تم تحسين dPCR بشكل أكبر من غرف التفاعل التي يتم فصلها بواسطة آبار الجدار إلى مستحلبات من النفط والماء والمواد الكيميائية المستقرة داخل نفس البئر كما هو موضح في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي2 القائم على القطيرات. في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطرات (ddPCR) ، يتم تقسيم العينة إلى آلاف القطرات بحجم النانو لتر التي تحتوي على أهداف فردية سيتم تحديدها لاحقا باستخدام إحصائيات بواسون2،3،4. تمنح هذه التقنية ddPCR ميزة في تحديد الأهداف الوفيرة المنخفضة عند مقارنتها بالأجيال الأخرى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
في الآونة الأخيرة ، أبرزت تطبيقات متعددة تفوق ddPCR على qPCR شائع الاستخدام عند اكتشاف وتحديد الأهداف منخفضة الوفرة1،5،6. SARS-CoV-2 ليس استثناء من هذه التطبيقات7،8،9،10،11،12. منذ تفشي SARS-CoV-2 ، يعمل العلماء على جميع الجبهات للتوصل إلى حلول حول كيفية تشخيص الفيروس واكتشافه بكفاءة. لا يزال المعيار الذهبي الحالي هو qPCR13. ومع ذلك ، فقد ثبت أن RT-ddPCR أكثر دقة في الكشف عن أهداف SARS-CoV-2 منخفضة الوفرة من كل من العينات البيئية والسريرية عند مقارنتها ب RT-qPCR7،8،9،10،11،12. تعتمد معظم الأعمال المنشورة ل SARS-CoV-2 ddPCR على المقايسات البسيطة مع المقايسات المتعددة اعتمادا على المقايسات التجارية. ومن ثم ، ينبغي بذل المزيد من الجهد لشرح كيفية تطوير مقايسات RT-dPCR متعددة الإرسال للكشف عن SARS-CoV-2.
في تصميم الفحص المناسب ، يمكن استخدام تعدد الإرسال لتوفير التكلفة ، وزيادة إنتاجية العينة ، وزيادة عدد الأهداف التي يمكن اكتشافها بحساسية داخل عينة صغيرة. عند تعدد الإرسال باستخدام ddPCR ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار عدد الفلوروفورات التي يمكن اكتشافها في نظام معين. يمكن لبعض منصات ddPCR دعم ما يصل إلى ثلاث قنوات بينما يدعم البعض الآخر قناتين فقط. ومن ثم ، عند تعدد الإرسال بقناتين ، يتعين على المرء استخدام أساليب مختلفة ، بما في ذلك تعدد الإرسال من أجل أعلى للكشف عن أكثر من هدفين14،15،16. في هذا العمل ، تم استخدام نظام الكشف عن ddPCR بلونين لإظهار خطوات حول كيفية تطوير فحوصات مختلفة ل SARS-CoV-2 RT-ddPCR يمكن تكييفها لتطبيقات بحثية مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان أخلاقي
معهد ووهان لعلم الفيروسات (WHIOV) هو من بين المختبرات والمعاهد المعتمدة من قبل مركز السيطرة على الأمراض الصيني في مدينة ووهان لإجراء أبحاث حول SARS-CoV-2 واكتشاف COVID-19 من العينات السريرية. كما تمت الموافقة على البحث حول تطوير تقنيات تشخيصية جديدة ل COVID-19 باستخدام العينات السريرية من قبل اللجنة الأخلاقية لمعهد ووهان لعلم الفيروسات (2020FCA001).
1. سير عمل معالجة العينات (الشكل 1 أ)
ملاحظة: في جميع أنحاء البروتوكول ، من المهم استخدام غرف منفصلة مع ماصات مخصصة لمعالجة العينات (الاستخراج والتخزين) ، وإعداد وتخزين الكاشف / الماسترمكس ، وإعداد مزيج التفاعل (عينة بالإضافة إلى مزيج رئيسي) ، والكشف ، لتجنب التلوث المتبادل. يمكن استخدام المقايسات التي سيتم تطويرها في الكشف عن العينات السريرية أو عينات البحث. يجب التعامل مع جميع العينات كما لو كانت قادرة على نقل العوامل المعدية حتى عند استخدام إجراءات مختبرية آمنة. وينبغي أن تتم خطوات معالجة العينات في مختبر من المستوى الثاني للسلامة الأحيائية (BSL-2) باتباع قواعد صارمة للسلامة البيولوجية BSL-2، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- تعطيل العينة
- خذ 1 مل من عينة SARS-CoV-2 إلى مختبر BSL-2. عينات معطلة بالحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: قد تأتي العينات من مصادر مختلفة ، وبالتالي ، يجب على المرء التأكد من أن الحجم المراد تعطيله كاف لضمان استخراج الحمض النووي الريبي لاحقا. تتطلب معظم مجموعات الاستخراج حجم عينة صغير يصل إلى 200 ميكرولتر ، وبالتالي ، فإن حجم عينة يبلغ حوالي 1 مل سيكون كافيا للتعطيل. يمكن أيضا استخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي والمجموعات ومخازن التحلل للتعطيل المباشر واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لإجراءات التشغيل القياسية الخاصة بالمختبرات. - خذ عينات إلى خزانة السلامة البيولوجية (BSC) واتركها تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح للهباء الجوي المحتمل بالاستقرار. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة إذا لم تتم معالجتها على الفور.
ملاحظة: لا توجد حاوية محددة مطلوبة لتخزين العينات. قد يتم تخزين العينات في الأنابيب أو الحاويات المستخدمة أثناء التعطيل. لهذا العمل ، تم تخزين معظم العينات في أنابيب وسائط النقل الفيروسية (VTM) أو أنابيب 1.5 مل.
- خذ 1 مل من عينة SARS-CoV-2 إلى مختبر BSL-2. عينات معطلة بالحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- استخراج الحمض النووي الريبي
ملاحظة: تتوفر العديد من أدوات ومجموعات استخراج الحمض النووي الريبي ذات البروتوكولات المحددة للاستخدام الجاهز. هنا ، يتم تقديم إجراء آلي يتبع تعليمات الشركة المصنعة.- أخرج لوحة فتحة البئر المملوءة مسبقا بعمق 96 ؛ اقلبها رأسا على عقب برفق لخلط الخرزات المغناطيسية. بعد الخلط ، هز اللوحة برفق على سطح مستو لتركيز الكاشف والخرز المغناطيسي الذي قد يكون على الحائط إلى أسفل اللوحة.
- قم بتمزيق فيلم ختم رقائق الألومنيوم بعناية لتجنب اهتزاز اللوحة وانسكاب السائل. أضف 20 ميكرولتر من البروتيناز K و 200 ميكرولتر من العينة لكل بئر في الصفين 2 و 8 من لوحة 96 بئرا. بعد ذلك ، ضع لوحة 96 بئرا على قاعدة أداة استخراج الحمض النووي الأوتوماتيكية ذات 32 قناة.
ملاحظة: قم بتشغيل البرنامج على الكمبيوتر في غضون 1 ساعة بعد إضافة العينة. - أدخل غلاف الشريط المغناطيسي في فتحة البطاقة الخاصة بأداة استخراج الحمض النووي الأوتوماتيكية ذات 32 قناة. حدد البرنامج GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (إصدار سريع) وقم بتشغيله.
- بعد الانتهاء من الاستخراج ، أخرج عينات الحمض النووي في الصفين 6 و 12 (حوالي 100 ميكرولتر / عينة) ووزعها في صفيحة نظيفة خالية من النيوكلياز 96 بئرا. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة حتى الاستخدام أو عند -20 درجة مئوية لفترة أطول.
ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 100 ميكرولتر لنقل العينات إلى لوحة جديدة سعة 100-200 ميكرولتر حيث يمكن أن تتطابق مباشرة مع أعمدة لوحة العينة.
- توليد cDNA
ملاحظة: بالنسبة للعينات المخزنة لفترة طويلة ، تجنب دورات التجميد / الذوبان المتعددة. قم بإجراء إنشاء cDNA باستخدام مجموعة cDNA باتباع تعليمات الشركة المصنعة.- في أنبوب PCR سعة 100 أو 200 ميكرولتر موضوع على كتلة ثلج / تبريد ، أضف 2 ميكرولتر من مزيج 5x RT الرئيسي (على سبيل المثال ، Perfect Real Time) ، و 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي ، و 3 ميكرولتر من DDh2O الخالي من RNase لكل تفاعل (الحجم الكلي 10 ميكرولتر).
- ضع أنبوب PCR في دورة حرارية مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (النسخ العكسي) ، و 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان (تعطيل الحرارة للنسخ العكسي) ، و 4 درجات مئوية لفترة غير محدودة.
ملاحظة: قم بمعالجة العينات على الفور ، أو تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة حتى الاستخدام أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. تحسين مقايسة ddPCR وسير العمل
ملاحظة: قم بتحسين المقايسات قبل / بعد قراءة القطرات. اعتمادا على النتائج ، يمكن تحسينها في أي مرحلة من العمل لتحقيق نتائج أفضل. فيما يلي بعض العوامل الشائعة التي يجب مراعاتها عند تحسين تجارب ddPCR.
- تحقق من صحة الاشعال والمجسات ddPCR (الجدول 1).
ملاحظة: تم تكييف البادئات ORF1ab و N من الصين CDC17 ، جين التحكم البشري الداخلي (RPP30) من Lu et al.18 ، و RBD2 من Nyaruaba et al.13. جميع البادئات والمجسات باستثناء RBD2 قد تم بالفعل اختبار ddPCR وتحسين7،8،18. - قم بتشغيل عناصر التحكم في عينة اختبار ddPCR التي تشتمل على عنصر تحكم إيجابي (عينة مع جميع الأهداف الأربعة) ، لا يوجد تحكم في القالب (NTC ؛ ماء أو عينة خالية من النيوكلياز بدون أهداف) ، والاستخراج / التحكم السلبي (إجمالي الحمض النووي المستخرج من خلية بشرية مستزرعة غير معدية أو عينات مجمعة من متطوعين صحيين).
ملاحظة: يفضل عينات التحكم القياسية مع نسخ معروفة من الجينات المستهدفة. ومع ذلك ، في حالة عدم وجود معايير ، استخدم العينات المتاحة لتحديد عناصر التحكم أو مصفوفة العينة. قم بتشغيل عناصر التحكم مع عينات الاختبار. - قم بتحسين درجة حرارة التلدين (الشكل 2 د) عن طريق إدخال تدرج درجة حرارة من 55 درجة مئوية إلى 65 درجة مئوية في خطوة التلدين في تفاعل البوليميراز المتسلسل (الخطوة 3.2).
ملاحظة: يساعد تحسين درجة حرارة التلدين في العثور على أفضل درجة حرارة حيث يكون فصل القطيرات هو الحد الأقصى (تحديد الهدف بسهولة) مع الحد الأدنى من المطر. بعد الحصول على النتائج ، قم بتضييق نطاق درجة الحرارة لتحسين أفضل ، على سبيل المثال ، 55 درجة مئوية إلى 60 درجة مئوية. - تحسين تركيزات التمهيدي والمسبار. إذا لم يتم تحقيق الفصل الأمثل بين القطرات الموجبة والسالبة في المقايسات ، فقم بتغيير تركيزات التمهيدي (300-900 نانومتر) و / أو المسبار (100-400 نانومتر).
ملاحظة: يؤدي خفض تركيزات التمهيدي / المسبار إلى انخفاض سعة القطرة المستهدفة وزيادة ذلك يزيد أيضا من سعة الهدف. يمكن أن يكون هذا مفيدا في تعدد الإرسال القائم على السعة. - اختبر الحساسية التحليلية مع مراعاة المعلمات المختلفة بما في ذلك حد الفراغ (LoB) وحد الكشف (LoD) والنوعية والحساسية باستخدام كل من العينات القياسية والاختبارية ، حسب الرغبة.
3. سير عمل ddPCR (الشكل 1 ب) وتطوير الفحص (الجدول 2)
ملاحظة: مثل أنظمة الكشف عن ddPCR الأخرى ، يتكون سير العمل هذا أيضا من أربع خطوات (الشكل 1B) ، بما في ذلك تحضير مزيج التفاعل ، وتوليد القطيرات ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وقراءة القطيرات.
- إعداد مزيج التفاعل
ملاحظة: قم بإعداد جميع المقايسات في غرفة منفصلة نظيفة وداخل BSC. التزم بالاحتياطات القياسية ، بما في ذلك استخدام القفازات النظيفة والماصات النظيفة والمياه الخالية من النيوكلياز والمطهرات. كواشف القسمة في أنابيب منفصلة وتخزينها في -20 درجة مئويةلتجنب دورات ذوبان التجميد المتكررة. إعداد المقايسات كما هو موضح في الجدول 2. يجب تخزين محاليل مخزون التمهيدي والمسبار بتركيزات عالية تبلغ 100 ميكرومتر. يمكن تخزين حلول العمل في حصص من 20-40 ميكرومتر (مخففة في ماء خال من النيوكلياز).- الخطوات الشائعة في جميع المقايسات
ملاحظة: قبل إعداد المقايسات ، احسب الحجم الإجمالي للمزيج الرئيسي المطلوب بناء على عدد العينات. هنا ، تم ضرب كل حجم مكون من مكونات mastermix في 1.05 لحساب أي أخطاء في الماصة.- إذابة وموازنة مواد التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة مكونات التفاعلات لفترة وجيزة (30 ثانية) لضمان التجانس ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع المحتويات في الجزء السفلي من الأنبوب.
- قم بإعداد مزيج مسبار التمهيدي (PP) لكل مقايسة عن طريق خلط أحجام تفاعل محددة كما هو مفصل في الجدول 2 من حلول العمل.
- قم بإعداد المزيج الرئيسي عن طريق خلط 11 ميكرولتر (1x) من 2x ddPCR supermix للمجسات (بدون dUTP) ، ومزيج PP (يعتمد على الفحص كما هو موضح في الجدول 2 من محلول العمل) والماء الخالي من النيوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 19.8 ميكرولتر لكل بئر. قم بتوزيع المزيج الرئيسي في آبار لوحة ddPCR الخالية من النيوكلياز ذات 96 بئرا بناء على عدد العينات.
ملاحظة: بالنسبة للوحة العينة ، تأكد من أن جميع الآبار ال 8 في عمود واحد بها الحل. إذا تم استخدام عدد قليل فقط من الآبار ، على سبيل المثال ، 5 عينات ، املأ الآبار الثلاثة الأخرى ب 22 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز أو تحكم في المخزن المؤقت لكل منها. - للحصول على حجم مزيج التفاعل النهائي (22 ميكرولتر) ، أضف 2.2 ميكرولتر من عينة cDNA لكل بئر يحتوي على mastermix. ختم اللوحة مع لوحة PCR السدادة القابل للتصرف.
ملاحظة: قم بإجراء إضافات العينة في الغرفة المخصصة. قم بتضمين عناصر التحكم ، أي الإيجابية ، NTC ، والاستخراج. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت عينات الحمض النووي الريبي ذات تركيز منخفض ، فقم بتقليل حجم الماء في المزيج الرئيسي وزيادة حجم العينة وفقا لذلك حتى 5.5 ميكرولتر. - بمجرد توزيع مزيج التفاعل لكل بئر ، دوامة لفترة وجيزة (15-30 ثانية) ، وأجهزة طرد مركزي (10-15 ثانية) لجمع المحتويات في الجزء السفلي من اللوحة. المضي قدما لتوليد قطرات.
- الخطوات الشائعة في جميع المقايسات
- توليد القطيرات الآلي (الشكل التكميلي 1)
ملاحظة: يمكن استخدام مولدات قطرات مختلفة ؛ ومع ذلك ، تم إجراء هذه الدراسة باستخدام مولد قطرات آلي (AutoDG). لتجنب تلوث الأمبليكون ، تأكد من أن مولد القطيرات والقراء لديهم مساحة مخصصة في مناطق منفصلة. عند تحميل المواد الاستهلاكية ، يوصى ببدء التحميل من الجزء الخلفي من الجهاز الذي يعمل باتجاه الأمام لتجنب تحريك اليدين على المواد الاستهلاكية لتجنب التلوث المتبادل.- احصل على جميع المواد الاستهلاكية اللازمة لإعداد AutoDG ، بما في ذلك زيت AutoDG للمجسات ، وخراطيش DG32 ، وأطراف الماصة ، وكتلة التبريد ، ولوحة العينة ، ولوحة القطيرات (لوحة DDPCR نظيفة جديدة) ، وسلة المهملات.
- على شاشة AutoDG التي تعمل باللمس، المس تكوين لوحة العينة وحدد الأعمدة التي توجد بها العينات على لوحة العينة، ثم اضغط على OK (موافق).
ملاحظة: ستتحول الشاشة إلى اللون الأصفر للإشارة إلى LOAD حيث يجب تحميل المواد الاستهلاكية. - افتح باب AutoDG وقم بتحميل المواد الاستهلاكية في أماكنها الخاصة.
ملاحظة: ستحتوي الأماكن المعنية التي يجب تحميل المواد الاستهلاكية فيها على مؤشر أصفر يتحول لاحقا إلى اللون الأخضر إذا تم تحميل المواد الاستهلاكية. هذا مشابه لشاشة اللمس. - قم بتحميل لوحة العينة ولوحة توليد القطرات.
ملاحظة: يجب وضع لوحة توليد القطيرات على كتلة التبريد. تأكد من أن كتلة التبريد أرجوانية (جاهزة للاستخدام) وليست وردية (يجب الاحتفاظ بها في الفريزر حتى يعود اللون إلى اللون الأرجواني). - أغلق باب AutoDG ، وتأكد من أن الشاشة خضراء (تم تحميل المواد الاستهلاكية) ، وحدد / تأكد من أن نوع الزيت هو Oil for Probes قبل الضغط على Start Droplet Generation.
- انتظر حتى يتم إنشاء القطرات. افتح الباب بمجرد أن تظهر الشاشة Droplets Ready وقم بإزالة اللوحة التي تحتوي على القطرات.
- أغلق اللوحة بختم رقائق قابل للثقب باستخدام مانع تسرب لوحة مضبوط للتشغيل عند 185 درجةمئوية لمدة 5 ثوان. انتقل إلى تضخيم PCR.
ملاحظة: يجب أن يبدأ تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في غضون 30 دقيقة بعد توليد القطيرات.
- تضخيم PCR
- أدخل لوحة القطيرات المختومة في جهاز تدوير حراري للبئر بعمق 96 ، واضبط حجم العينة على 40 ميكرولتر ودرجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية.
- يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم القطرات باستخدام البرنامج: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (تنشيط الإنزيم) ، 40 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 1 دقيقة من التلدين / التمديد عند 57 درجة مئوية ، إلغاء تنشيط الإنزيم عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، والاستمرار في الخطوة عند 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اقرأ القطرات أو خزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
ملاحظة: استخدم معدل منحدر يبلغ 2 درجة مئوية / ثانية في جميع الخطوات ، حيث قد تختلف معدلات المنحدر باختلاف راكبي الدراجات الحرارية. امسك اللوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 4 درجات مئوية للسماح بتثبيت القطرات قبل قراءة القطرات.
- قراءة القطيرات
- انقل اللوحة ذات 96 بئرا المدورة حراريا إلى قارئ قطرات ، وعلى جهاز كمبيوتر متصل بقارئ القطيرات ، افتح / ابدأ تشغيل البرنامج المصاحب.
- في وضع الإعداد ، حدد جديد ثم انقر نقرا مزدوجا فوق أي بئر لفتح مربع الحوار محرر الآبار . حدد الآبار المراد قراءتها واختر التجربة: ABS ، Supermix: ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP) ، النوع 1 الهدف: Ch1 غير معروف ، النوع 2 الهدف: Ch2 غير معروف.
ملاحظة: يمكن تحديد سالب أو فارغ أو NTC أو إيجابي من القائمة المنسدلة للنوع 1/2 الهدف لعينات التحكم. - قم بتعيين أسماء الهدف أو النماذج بناء على تخطيط اللوحة وحدد تطبيق. عند الانتهاء ، حدد موافق ، واحفظ القالب الذي تم إنشاؤه. انقر فوق تشغيل وعندما يطلب منك اختيار اللون المناسب (FAM / HEX).
ملاحظة: يوصى بتحضير النظام قبل التشغيل قبل التشغيل الأول من اليوم. تحقق أيضا مما إذا كانت جميع الأضواء في القارئ خضراء وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فاتبع التطبيق الموصى به في حالة تلميح الأداة. - بعد الانتهاء من الحصول على البيانات ، قم بإزالة اللوحة من القارئ. تحليل البيانات كما هو مطلوب.
ملاحظة: نظرا لأنه يمكن رؤية النتائج الأولية على الشاشة ، يمكن استخدام تشغيل العينات الإيجابية في الآبار الأولى لفحص الجودة في الوقت الفعلي.
4. تحليل البيانات (الشكلان التكميليان 2 و 3)
- تحقق من البيانات من جميع الآبار لمعرفة العدد الإجمالي للقطرات. إذا كان عدد القطرات <10000 ، فتجاهل النتائج وكرر الفحص. ضع قطعا لقبول النتائج الإيجابية والسلبية. على سبيل المثال ، يمكن اعتبار عدد القطرات الذي يصل إلى 3 قطرات إيجابية أو أكثر بمثابة قطع للحصول على نتائج إيجابية.
ملاحظة: يتم إنشاء بيانات لجميع المقايسات ، بما في ذلك المقايسات الفردية والمزدوجة ومزيج المسبار الثلاثي والرباعي باستخدام البرنامج المصاحب. ومع ذلك ، فإن هذا البرنامج مناسب فقط للمقايسات البسيطة والمزدوجة. بالنسبة لمقايسات تعدد الإرسال عالية الترتيب (>3 أهداف) ، هناك حاجة إلى برنامج خارجي. - المقايسات على وجه واحد ومزدوج
ملاحظة: يمكن للبرنامج الخارجي أيضا تحليل البيانات الفردية والمزدوجة. ومع ذلك ، فإن استخدام البرنامج المصاحب أسهل لهذه المقايسات ، وبالتالي يتم استخدامه في هذه المقالة.- انقر نقرا مزدوجا فوق ملف .qlp ليتم تحليله لفتحه وحدد تحليل.
- استخدم أدوات العتبة في السعة 1D والسعة 2D للتمييز بين القطرات الموجبة والسالبة لكل بئر في القناة الصحيحة. يمكن استخدام NTC وعينات التحكم الإيجابية كدليل لتحديد العتبة.
ملاحظة: تظهر نتائج FAM في القناة 1 بينما تظهر HEX / VIC في القناة 2. - بعد إعداد العتبة ، يمكن تصدير النتائج كملف .csv وتحليلها بشكل أكبر في Excel أو تسجيلها من خلال القراءة مباشرة في نافذة النتائج.
- مزيج مسبار ثلاثي (الشكل التكميلي 2) ومقايسات رباعية (الشكل التكميلي 2)
ملاحظة: قبل تحليل مزيج المسبار الثلاثي والفحص الرباعي ، قم بتنزيل البرنامج الخارجي. راجع الحد الأدنى لمتطلبات النظام قبل التثبيت.- افتح ملف .qlp بالنقر بزر الماوس الأيمن فوقه واختيار فتح باستخدام البرنامج الخارجي ، أو عن طريق فتح البرنامج الخارجي والنقر فوق خيار التصفح لتحديد موقع ملف .qlp في مجلدك ، أو ببساطة عن طريق سحب ملف .qlp وإفلاته على البرنامج الخارجي المفتوح بالفعل.
- في علامة تبويب محرر اللوحة ، حدد الآبار المراد تحليلها على الجانب الأيمن من علامة التبويب.
- بالنسبة لمزيج المسبار الثلاثي ، حدد القياس الكمي المباشر (DQ) كنوع التجربة ، وحدد Probe Mix Triplex كمعلومات فحص وأدخل أسماء الأهداف وفقا لذلك ، ثم انقر فوق تطبيق.
- بالنسبة إلى quadruplex ، حدد القياس الكمي المباشر (DQ) كنوع التجربة ، وحدد Amplitude Multiplex كمعلومات مقايسة وأدخل الأسماء المستهدفة وفقا لذلك ، ثم انقر فوق تطبيق.
- على الجانب الأيسر من علامة التبويب 2D Amplitude ، استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان معينة لمجموعات مستهدفة مختلفة بعد اقتراحات نافذة تحديد لتعيين مجموعة .
ملاحظة: يمكن تطبيق وضع نظام المجموعة المفضل بناء على تفضيلات المستخدمين. - بمجرد تعيين الألوان المستهدفة ، يمكن قراءة بيانات القياس الكمي في نافذة بيانات البئر في أسفل اليمين. قم بتصدير البيانات إلى Excel / csv لمزيد من التحليل باستخدام رمز الشريط الثلاثي في أعلى يمين جدول بيانات البئر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في دراسة إثبات المفهوم ، تم اختبار الأداء التحليلي للمقايسات المتعددة على العينات السريرية والبحثية19. كان أداء مقايسات تعدد الإرسال متفوقا على أداء RT-PCR19. نظرا لأن الأعداد المنخفضة من القطرات قد تشير إلى وجود مشكلة أثناء توليد القطيرات ، فقد تم في هذه المقالة تعيين حد قدره 10000 قطرة لكل بئر بناء على البيانات التجريبية.
يمكن أن يساعد الفصل الجيد بين القطرات الإيجابية والسلبية مع الحد الأدنى من تداخل المطر في تحليل البيانات. ومن ثم ، في تجربة جيدة ، يعد تحسين الفحص هو المفتاح19. كما هو موضح في نتائج تحليل تدرج درجة الحرارة في الشكل 2D ، لم تتمكن درجات حرارة التلدين المرتفعة (على سبيل المثال ، 65 درجة مئوية) من التمييز بوضوح بين القطرات الموجبة والقطرات السالبة عند تشغيل اختبار مزدوج (N (FAM) و RPP30 (HEX)) . ومع ذلك ، مع انخفاض درجة حرارة التلدين ، تم تحقيق الفصل الأمثل بين القطرات الإيجابية والسلبية. تم العثور على درجة حرارة 57 درجة مئوية الأمثل. يمكن ملاحظة ذلك أيضا في المقايسات الأخرى19.
باستخدام نظام الكشف RT-ddPCR ثنائي اللون (FAM / HEX) ، من الممكن اكتشاف هدف واحد (الشكل 2A ، B) ، واثنان (الشكل 2C) ، وثلاثة (الشكل 3A) ، وأربعة (الشكل 3B) أهداف SARS-CoV-2 داخل عينة واحدة. أثناء تحليل البيانات ، يمكن للبرنامج المصاحب المستخدم لقراءة القطرات فقط تحليل المقايسات البسيطة والمزدوجة كما هو موضح في الشكل 2. هذا يعني أنه بالنسبة لمقايسات تعدد الإرسال ذات الترتيب الأعلى (> 3 أهداف) ، يجب استخدام برنامج خارجي لتحليل البيانات كما هو موضح في الأشكال 3 و S2 و S3. من المهم أيضا ملاحظة أنه يمكن أيضا استخدام البرنامج الخارجي لتحليل البيانات الفردية والمزدوجة. بالنسبة للبيانات البسيطة والمزدوجة ، يكون التحليل بسيطا للغاية حيث يتم فصل الأهداف إما كقطرات موجبة أو سلبية في قنواتها الخاصة كما هو موضح في الشكل 2. يمكن أن تساعد عينة NTC في تحديد موقع القطرات السالبة التي يمكن أن تساعد بدورها في تعيين عتبات لتحليل البيانات كما هو موضح في الشكل 2A. بالنسبة للفحص المزدوج ، يمكن إجراء التحليل في قنوات فردية (الشكل 2B i ، ii) أو في السعة ثنائية الأبعاد (الشكل 2B iii).
بالنسبة لمقايسات تعدد الإرسال ذات الترتيب الأعلى ، فإن تحليل البيانات ليس واضحا ، ويجب تركيز الاهتمام على تعيين هدف القطرات. بعد تثبيت البرنامج الخارجي ، حدد الآبار المراد تحليلها ، وحدد نوع التجربة المناسب ، وقم بتعيين المجموعات المستهدفة بناء على نوع التجربة كما هو موضح في الشكلين S2 و S3. ستوجه النافذة المنبثقة تحديد لتعيين الكتلة أحدا حول كيفية تعيين المجموعات في مقايسات تعدد الإرسال الأعلى. استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ما يصل إلى 8 مجموعات قطرات لمقايسة مزيج المسبار الثلاثي (الشكل 3 أ) ، وما يصل إلى 16 مجموعة قطرات للمقايسة القائمة على السعة الرباعية (الشكل 3 ب).
بعد تعيين المجموعات والعتبات ، يمكن قراءة بيانات القياس الكمي لكل هدف في شكل نسخ / ميكرولتر في نافذة بيانات البئر في أسفل يمين البرنامج الخارجي. يمكن استخدام هذه البيانات لتقدير عدد نسخ الأهداف في عينة البداية. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 2.2 ميكرولتر من العينة في حجم نهائي قدره 22 ميكرولتر ، وسجل البرنامج 30.5 نسخة / ميكرولتر ل ORF1ab ، كان هناك 30.5 × 22 = 671 نسخة من ORF1ab في مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل. احتوى المزيج على 2.2 ميكرولتر من العينة الأصلية ، وبالتالي ، كان هناك 671 نسخة من ORF1ab في عينة البداية ، و 671 / 2.2 = 305 نسخة / ميكرولتر من ORF1ab في العينة الأصلية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقدير تركيز كل هدف في جميع المقايسات.
| هدف | التسلسل 5 'إلى 3' | دقق في الصبغة (الأصباغ) | طول المنتج (bp) | الرقم المرجعي | |
| ORF1ab | أمامي | CCCTGTGGGTT تتاكاكتا |
5'- FAM و BHQ1-3 ' 5 '- HEX و BHQ1-3 ' |
119 | [16] |
| عكس | ACGATTGTGCAT كاغكتجا |
||||
| مجس | CCGTCTGCGGT اتغغاااج تاتغ |
||||
| N | أمامي | GGGGAACTTCTC كتغكتاغاات |
5'- FAM و BHQ1-3 ' 5 '- HEX و BHQ1-3 ' |
99 | [16] |
| عكس | كاغاكاتغك TCTCAAGCTG |
||||
| مجس | TTGCTGCTGCT تغاكاجات |
||||
| RPP30 | أمامي | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5 '- HEX و BHQ1-3 ' | 87 | [8] |
| عكس | GCAGGGCTATAG أكاجتكا |
||||
| مجس | TTTCCTGTGAAG جي سي جي أتغاكا |
||||
| آر بي دي 2 | أمامي | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM و BHQ1-3 ' | 121 | [17] |
| عكس | CCTGTGCCTGT تاكاتج |
||||
| مجس | أكاجكاتكاجت AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
الجدول 1: تسلسل التمهيدي والمسبار المستخدم لتطوير مقايسات SARS-CoV-2 المختلفة.
| التركيز النهائي لمسبار التمهيدي لكل مقايسة في نانومترأ | |||||
| هدف | التمهيدي / التحقيق | البسيطب | دوبلكسج | مزيج مسبار ثلاثيد | سعة فوربلكسe |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab عرافة | 250 | ||||
| N | ن ف | 800 | 800 | 800 | |
| ن ر | 800 | 800 | 800 | ||
| ن فام | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| آر بي دي 2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| آر بي دي 2 آر | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 عرافة | |||||
| (أ ) في جميع المقايسات، يمكن تبادل الأهداف استنادا إلى ما يفضله المستعملون. الأهداف المستخدمة هي لأغراض توضيحية لهذه التجربة. | |||||
| (ب) يمكن الكشف عن هدف واحد فقط في كل مرة في الفحص البسيط إما في قناة FAM أو HEX. يستخدم RBD2 لإظهار نتائج قناة FAM بينما يتم استخدام RPP30 لقناة HEX. | |||||
| (ج ) يمكن الكشف عن هدفين في وقت واحد في الفحص المزدوج في قناة FAM وHEX. | |||||
| (د ) يمكن الكشف عن ثلاثة أهداف باستخدام كلتا القناتين، أي أن الهدف 1 سيكتشف في FAM (تركيز المسبار 1×)، والهدف الثاني في تركيز مسبار سداسي عشري (1×)، والهدف 3 في كلتا القناتين (خليط من 0.5× HEX و 0.5× تركيز مسبار FAM لتشكيل 1× النهائي). | |||||
| (ه ) اكتشف هدفان في كل قناة (FAM وHEX) مع تركيز مسبار 1× وO.5× في كل قناة. | |||||
الجدول 2: التركيز النهائي لأزواج التمهيدي والمسبار المختلفة لكل فحص.
الشكل 1: معالجة العينات وسير عمل PCR الرقمي للقطرات. (أ) يتضمن سير عمل معالجة العينات جمع العينات ونقلها إلى منشأة BSL-2 ، والتعطيل ، والاستخراج ، وتوليد cDNA. (ب) يبدأ سير عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات بإعداد المزيج الرئيسي ، وتحميل المزيج الرئيسي في لوحة ddPCR وإضافة عينة (عينات) ، وتوليد قطرات ، وتضخيم الأهداف داخل القطرات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وأخيرا قراءة القطرات المضخمة باستخدام قارئ القطيرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتائج الفحص البسيط والمزدوج ، بما في ذلك تحسين درجة حرارة التلدين. (أ) نتائج الفحص البسيط عندما يتم تسمية هدف واحد (RBD2) FAM. (ب) ينتج الفحص البسيط عندما يتم تسمية هدف واحد (RPP30) بعلامة HEX. (ج) نتيجة الفحص المزدوج لهدفين في القنوات 1D و 2D (iii) بعد تسمية N (i) FAM و RPP30 (ii) تم تسمية HEX. (د) تدرج درجة حرارة التلدين (65 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية) نتائج الفحص المزدوج المسمى ب ORF1ab (FAM) و RPP30 (HEX). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مزيج المسبار الثلاثي ونتائج مقايسة تعدد الإرسال القائمة على السعة الرباعية. (أ) نتائج مقايسة مزيج المسبار الثلاثي عندما تم تمييز ثلاثة أهداف بالنسب التالية من FAM: HEX ؛ RBD2 (1: 0) ، N (0.5: 0.5) ، و RPP30 (0: 1). (ب) نتائج الفحص القائم على السعة الرباعية بعد وسم أربعة أهداف بالنسب التالية من FAM:HEX؛ RBD2 (0.5: 0) ، N (1: 0) ، RPP30 (0: 0.5) ، و ORF1ab (0: 1). 1 و 0.5 هي تركيزات التحقيق 250 نانومتر و 125 نانومتر ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: توليد القطيرات باستخدام مولد قطرات آلي. (أ) المواد الاستهلاكية اللازمة لإعداد AutoDG. ( B) في شاشة AutoDG التي تعمل باللمس، المس تكوين لوحة العينة وحدد الأعمدة التي توجد بها العينات على لوحة العينة، ثم اضغط على OK . ( C) بمجرد تحديدها، تتحول الشاشة إلى اللون الأصفر للإشارة إلى المكان الذي يجب تحميل المواد الاستهلاكية فيه. (د) افتح باب AutoDG وقم بتحميل المواد الاستهلاكية في الأماكن المعنية. تحميل المواد الاستهلاكية من الخلف تعمل باتجاه الأمام. تأكد من أنه في كل مرة يتم فيها إضافة مادة استهلاكية ، يتحول الضوء من الأصفر إلى الأخضر في هذا الموقع. (ه) تأكد من أن نوع الزيت المستخدم هو زيت للمجسات. (F) أغلق باب AutoDG وتأكد من وضع جميع الكواشف في مكانها عن طريق التحقق مما إذا كانت شاشة AutoDG التي تعمل باللمس خضراء. (ز) اضغط على START Droplet Generation لتوليد قطرات. (H) بعد اكتمال توليد القطيرات ، افتح AutoDG وقم بإزالة لوحة القطرات. (ط) أغلق لوحة القطيرات باستخدام ختم حراري قابل للثقب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: خطوات تحليل نتائج مقايسة ddPCR متعددة الإرسال القائمة على السعة باستخدام برنامج خارجي. ( أ) قم بتثبيت البرنامج الخارجي على جهاز كمبيوتر. (ب) افتح ملف .qlp إما عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوقه واختيار فتح باستخدام البرنامج الخارجي المثبت أو فتح البرنامج الخارجي والنقر فوق خيار التصفح لتحديد موقع الملف في مجلدك. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء سحب ملف .qlp وإفلاته في البرنامج الخارجي المفتوح لفتحه. (ج) بمجرد الفتح ، على الجانب الأيمن من علامة التبويب Plate Editor ، اختر مسبار مزيج ثلاثي من القائمة المنسدلة وقم بتعيين معلومات الهدف وفقا لذلك ، وانقر فوق تطبيق. (د) على الجانب الأيسر من علامة تبويب السعة 2D ، استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان محددة لأهداف مختلفة للكشف والقياس الكمي. بمجرد تحديد أهداف مجموعة القطيرات ، يمكن رؤية نتائج القياس الكمي في نافذة بيانات البئر في نفس علامة تبويب السعة 2D. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: خطوات تحليل نتائج مقايسة ddPCR متعددة الإرسال القائمة على السعة باستخدام برنامج خارجي. ( أ) قم بتثبيت البرنامج الخارجي على جهاز كمبيوتر. (ب) افتح ملف .qlp إما بالنقر بزر الماوس الأيمن فوقه واختيار فتح باستخدام البرنامج الخارجي المثبت ، أو فتح البرنامج الخارجي والنقر فوق خيار التصفح لتحديد موقع الملف في مجلدك. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء سحب ملف .qlp وإفلاته في البرنامج الخارجي المفتوح بالفعل لفتحه. (ج) بمجرد الفتح ، على الجانب الأيمن من علامة التبويب Plate Editor ، اختر مضاعف السعة من القائمة المنسدلة وقم بتعيين معلومات الهدف وفقا لذلك ، وانقر فوق تطبيق. (د) على الجانب الأيسر من علامة تبويب السعة 2D ، استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان محددة لأهداف مختلفة للكشف والقياس الكمي. بمجرد تحديد أهداف مجموعة القطيرات ، يمكن رؤية نتائج القياس الكمي في نافذة بيانات البئر في نفس علامة تبويب السعة 2D. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتوفر موارد قليلة حول كيفية تطوير مقايسات RT-ddPCR للكشف عن SARS-CoV-2. على الرغم من عدم استخدامها في هذه المقالة ، يمكن استخدام العينات القياسية ذات النسخ المعروفة لتطوير المقايسات وتحسينها. ومع ذلك ، في هذا العمل ، تم رفع عينات SARS-CoV-2 المزروعة في خلايا Vero-E6 في خلفية الحمض النووي الريبي الجيني البشري واستخدامها كعينات قياسية لتطوير المقايسات. يعد تسلسل التمهيدي والمسبار المناسب أمرا ضروريا عند تطوير المقايسات. نظرا لأن معظم الأعمال الأولية على SARS-CoV-2 RT-ddPCR استخدمت التمهيدي الصيني CDC والمجسات التي تستهدف جين ORF1ab و N ، فقد وجدوا أنها مناسبة لإدراجها في هذا العمل7،8،9،10،11. كما تمت مقارنة الخصوصية التحليلية وحساسية هذه البادئات باستخدام ddPCR في العمل السابق7. تم تطوير البادئات RBD2 والمسبار13 داخليا ووجد أنها مناسبة ل RT-ddPCR. نظرا لأنه يمكن استخدام المقايسات لتطبيقات مختلفة ، بما في ذلك التشخيص ، فقد تم تضمين الجين البشري المحدد للوحدة الفرعية لبروتين Ribonuclease P p30 (RPP30) في جميع فحوصات تعدد الإرسال. يمكن استخدام هذه الجينات كعنصر تحكم داخلي بشري في التجارب التشخيصية. ومع ذلك ، في حالة أخذ العينات البيئية أو غيرها من الأبحاث التي لا تحتاج إلى الجين المرجعي البشري ، يمكن للمرء تبديل هذا الهدف مع هدف آخر ل SARS-CoV-2.
في جميع المقايسات ، من المهم تضمين ضوابط للتحقق من صحة المقايسات والبيانات التجريبية. قد تشمل هذه الضوابط: NTC (الماء الخالي من النيوكلياز كعينة) للمساعدة في تحديد العتبات وتحديد مجموعة القطرات السلبية. التحكم الإيجابي (عينة مع جميع أهداف SARS-CoV-2 ، بما في ذلك الجين المرجعي البشري) لتقييم فشل الكاشف ، وسلامة التمهيدي والمسبار ، والكشف عن النسخ العكسي الكبير / موقع أهداف القطيرات الإيجابية ؛ وضوابط الاستخراج (عينات بشرية مجمعة من متطوعين أصحاء أو إجمالي الحمض النووي المستخرج من خلية بشرية مستزرعة غير معدية) للكشف عن فشل أو نجاح خطوة الاستخراج.
معظم أنظمة ddPCR ، بما في ذلك نظام QX200 لها نطاق ديناميكي ضيق من 1 إلى 120000 نسخة / تفاعل 20 ميكرولتر. عند اكتشاف عينات غير معروفة ، غالبا ما يكون التركيز المستهدف في عينة البداية غير معروف وقد يشكل ذلك تحديات عند تحديد العينات عالية التركيز. للتغلب على هذا ، يوصى بأنه عند تحديد كمية العينات المشتبه في احتوائها على كميات عالية من الجزيئات المستهدفة (مثل زراعة الخلايا) ، يجب على المرء أن يخطط لتقليل عينة البداية وفقا لذلك. في الحالة التي يكون فيها رقم النسخة المستهدفة / الجينوم غير معروف ، يجب على المرء تحديد كمية البدء المثلى من خلال سلسلة من أربعة تخفيف تسلسلي بعشرة أضعاف لكل عينة في النطاق الرقمي المتوقع. من خلال فحص هذه النقاط الأربع ، يتم التأكد من أن إحدى نقاط البيانات ضمن النطاق الرقمي الأمثل.
يعد استخدام التمهيدي العالي وتركيز المسبار المنخفض شرطا أساسيا لمعظم تجارب ddPCR البسيطة والمزدوجة. يزيد هذا الاختلاف في التركيز من مسافة فصل السعة بين مجموعات القطرات الموجبة والسالبة ، مما يجعل من السهل تحليل البيانات. ومع ذلك ، عند تطوير مقايسات تعدد الإرسال ذات الترتيب الأعلى ، قد تؤدي التغييرات في هذه التركيزات إلى تغييرات في موضع أهداف القطيرات الإيجابية كما هو موضح في الشكلين 3 و 4. نتيجة لذلك ، سيكون أحد خيارات تحسين الفحص بصرف النظر عن درجة حرارة التلدين هو تغيير تركيز التمهيدي المستهدف أو المسبار لتمييز القطرات. تم استخدام هذه الظاهرة وشرحها قبل14،15،16.
على الرغم من أداء الفحص ، فإن هذا العمل عبارة عن سير عمل RT-ddPCR من خطوتين. توفر خطوة النسخ العكسي الإضافية قبل ddPCR مجالا لتلوث العينات. ومع ذلك ، إذا تم استخدام تقنيات معالجة العينات بعناية ومناسبة ، فلن تكون هذه مشكلة. بشكل إيجابي ، من المعروف أن الحمض النووي أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي. قد يؤدي تحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA إلى إطالة العمر الافتراضي للعينة أثناء التخزين مقارنة بالحمض النووي الريبي. تجربة RT-ddPCR المكونة من خطوتين أرخص أيضا من تجربة RT-ddPCR المكونة من خطوة واحدة.
بالمقارنة مع RT-qPCR ، فإن RT-ddPCR باهظ الثمن. ومن ثم ، ينبغي أخذ الاعتبارات عند إجراء RT-ddPCR. على سبيل المثال ، أثناء التشخيص ، يمكن للمرء استخدام RT-ddPCR في الحالة التي تحتوي فيها عيناتهم على أهداف وفيرة منخفضة. ومع ذلك ، هناك احتمال أن تنخفض تكاليف أدوات وكواشف dPCR قريبا ، وسيتم تكييف التقنية في العديد من المختبرات ، كما حدث في الماضي مع PCR و qPCR العاديين. وبالتالي ، من المهم وضع بروتوكولات مثل هذه للمستخدمين الحاليين والمستقبليين ل dPCR. في الختام ، تعطي المقايسات المطورة مجالا للمستخدمين المحتملين لتغيير الأهداف بناء على تطبيقاتهم. سيضمن تعدد الإرسال أنه يمكن للمرء اكتشاف العديد من الأهداف بكفاءة داخل عينة واحدة في تفاعل واحد. حتى الآن ، قد يكون هذا هو البروتوكول الأول الذي يقدم تفاصيل كاملة حول كيفية استخدام نظام AutoDG ، بما في ذلك البرنامج الخارجي في اكتشاف SARS-CoV-2. لا يزال يتعين القيام بمزيد من العمل على تحسين الفحص لتحقيق فصل أفضل في الفحص الرباعي. سيساعد استخدام المعايير أيضا في تحسين المقايسات المتقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل Megaproject of Infectious Disease Control من وزارة الصحة الصينية ، رقم المنحة 2017ZX10302301-005 ومركز الأبحاث الصيني الأفريقي المشترك ، رقم المنحة SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
