Summary
Detta arbete sammanfattar steg för att utveckla olika analyser för SARS-CoV-2-detektering med ett tvåfärgs ddPCR-system. Stegen är detaljerade och anteckningar har inkluderats om hur man förbättrar analyserna och experimentprestandan. Dessa analyser kan användas för flera SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikationer.
Abstract
Diagnos av den pågående SARS-CoV-2-pandemin är en prioritet för alla länder över hela världen. För närvarande är kvantitativ PCR med omvänd transkription (RT-qPCR) guldstandarden för SARS-CoV-2-diagnos eftersom ingen permanent lösning finns tillgänglig. Hur effektiv denna teknik än kan vara, har forskning framkommit som visar dess begränsningar i upptäckt och diagnos, särskilt när det gäller låga rikliga mål. Däremot har droplet digital PCR (ddPCR), en ny framväxande teknik med överlägsna fördelar jämfört med qPCR, visat sig övervinna utmaningarna med RT-qPCR vid diagnos av SARS-CoV-2 från låga rikliga målprover. Prospektivt, i den här artikeln, utökas funktionerna i RT-ddPCR ytterligare genom att visa steg för hur man utvecklar simplex-, duplex-, triplex-sondblandning och quadruplex-analyser med hjälp av ett tvåfärgsdetekteringssystem. Med hjälp av primers och sonder riktade mot specifika platser i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 och RBD2) har utvecklingen av dessa analyser visat sig vara möjlig. Dessutom tillhandahålls detaljerade protokoll, anteckningar och förslag på hur man kan förbättra analysarbetsflödet och analysera data. Att anpassa detta arbetsflöde i framtida arbeten kommer att säkerställa att det maximala antalet mål kan identifieras känsligt i ett litet urval, vilket avsevärt förbättrar kostnaden och provgenomströmningen.
Introduction
Polymeraskedjereaktion (PCR), en välkänd teknik, har genomgått flera omvandlingar sedan dess tillkomst för att bli en kraftfull teknik som kan ge svar på nukleinsyraforskning. Dessa omvandlingar har varit en ständig förbättring av den gamla tekniken. Dessa omvandlingar kan sammanfattas i tre generationer1. Den första generationen är konventionell PCR som bygger på gelelektrofores för att kvantifiera och detektera förstärkta mål. Den andra generationen är kvantitativ realtids-PCR (qPCR) som kan detektera prover i realtid och förlita sig på en standardkurva för att direkt kvantifiera mål i ett prov. Den tredje generationen, digital PCR (dPCR), kan utföra både detektion och absolut kvantifiering av nukleinsyramål utan behov av en standardkurva. dPCR har också förbättrats ytterligare från reaktionskammare som separeras av brunnarna i en vägg till emulsioner av olja, vatten och stabiliserande kemikalier inom samma brunn som ses i droppbaserad digital PCR2. I droplet digital PCR (ddPCR) delas ett prov upp i tusentals nanoliterstora droppar som innehåller individuella mål som senare kommer att kvantifieras med hjälp av Poisson-statistik 2,3,4. Denna teknik ger ddPCR en fördel när det gäller att kvantifiera låga rikliga mål jämfört med andra generationer av PCR.
Nyligen har flera applikationer belyst överlägsenheten hos ddPCR jämfört med den vanliga qPCR när man detekterar och kvantifierar låga rikliga mål 1,5,6. SARS-CoV-2 är inget undantag från dessa applikationer 7,8,9,10,11,12. Sedan utbrottet av SARS-CoV-2 har forskare arbetat på alla fronter för att komma fram till lösningar på hur man diagnostiserar viruset och upptäcker det effektivt. Den nuvarande guldstandarden är fortfarande qPCR13. RT-ddPCR har dock visat sig vara mer exakt när det gäller att upptäcka låga rikliga SARS-CoV-2-mål från både miljö- och kliniska prover jämfört med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De flesta av SARS-CoV-2 ddPCR-publicerade verk beror på simplexanalyser med multiplexa beroende på kommersiella analyser. Därför bör mer göras för att förklara hur man utvecklar multiplexa RT-dPCR-analyser för SARS-CoV-2-detektion.
I en korrekt analysdesign kan multiplexering användas för att spara kostnader, öka provgenomströmningen och maximera antalet mål som kan detekteras känsligt i ett litet urval. Vid multiplexering med ddPCR måste man ta hänsyn till hur många fluoroforer som kan detekteras i ett visst system. Vissa ddPCR-plattformar kan stödja upp till tre kanaler medan andra bara stöder två kanaler. Därför, när multiplexering med två kanaler, måste man använda olika metoder, inklusive högre ordermultiplexering för att upptäcka mer än två mål14,15,16. I detta arbete används ett tvåfärgs ddPCR-detekteringssystem för att visa steg på hur man utvecklar olika SARS-CoV-2 RT-ddPCR-analyser som kan anpassas för olika forskningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt uttalande
Wuhan Institute of Virology (WHIOV) är bland de laboratorier och institut som godkänts av China CDC i Wuhan stad för att bedriva forskning om SARS-CoV-2 och upptäcka COVID-19 från kliniska prover. Forskning om att utveckla nya diagnostiska tekniker för COVID-19 med hjälp av kliniska prover har också godkänts av den etiska kommittén vid Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Arbetsflöde för provbearbetning (bild 1A)
OBS: Under hela protokollet är det viktigt att använda separata rum med dedikerade pipetter för provhantering (extraktion och lagring), reagens / mastermixberedning och lagring, beredning av reaktionsblandning (prov plus mastermix) och detektion för att undvika korskontaminering. De analyser som ska utvecklas kan användas för detektion av kliniska prover eller forskningsprover. Alla prover ska behandlas som om de kan överföra smittämnen även när säkra laboratorieförfaranden används. Provbearbetningssteg bör göras i ett biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium enligt strikta BSL-2-regler, inklusive användning av lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
- Inaktivering av prov
- Ta 1 ml SARS-CoV-2-prov till ett BSL-2-laboratorium. Värmeinaktivera proverna vid 65 °C i 30 minuter.
OBS: Prover kan komma från olika källor, därför bör man se till att volymen som ska inaktiveras är tillräcklig för att säkerställa efterföljande RNA-extraktion. De flesta extraktionssatser kräver en liten provvolym på upp till 200 μl, därför skulle en provvolym på cirka 1 ml vara tillräcklig för inaktivering. Tensider, kit och lysbuffertar kan också användas för direkt inaktivering och RNA-extraktion enligt laboratoriets egen SOP. - Ta prover till ett biosäkerhetsskåp (BSC) och låt dem stå i rumstemperatur i 10 minuter så att potentiella aerosoler kan sedimentera. Förvara proverna i 4 °C i upp till 24 timmar om de inte behandlas omedelbart.
OBS: Ingen specifik behållare krävs för provlagring. Proverna kan förvaras i de rör eller behållare som används vid inaktiveringen. För detta arbete lagrades de flesta prover i virala transportmedier (VTM) rör eller 1,5 ml rör.
- Ta 1 ml SARS-CoV-2-prov till ett BSL-2-laboratorium. Värmeinaktivera proverna vid 65 °C i 30 minuter.
- RNA-extraktion
OBS: Många RNA-extraktionsinstrument och kit med specifika protokoll är tillgängliga för klar användning. Här presenteras en automatiserad procedur enligt tillverkarens instruktioner.- Ta ut den förfyllda 96-djupa brunnsöppningsplattan; Vänd den försiktigt upp och ner för att blanda de magnetiska pärlorna. Efter blandning, skaka försiktigt plattan på en plan yta för att koncentrera reagens och magnetiska pärlor som kan vara på väggen till plattans botten.
- Riv försiktigt av aluminiumfoliens tätningsfilm för att undvika vibrationer på plattan och vätskespill. Tillsätt 20 μl proteinas K och 200 μl prov per brunn på raderna 2 och 8 på 96-brunnsplattan. Placera sedan 96-brunnsplattan på basen av det 32-kanaliga automatiska nukleinsyraextraktionsinstrumentet.
Kör programmet på datorn inom 1 timme efter att du har lagt till provet. - Sätt i den magnetiska stånghylsan i kortplatsen på det 32-kanaliga automatiska nukleinsyraextraktionsinstrumentet. Välj programmet GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (snabbversion) och kör det.
- Efter avslutad extraktion, ta ut nukleinsyraproverna på raderna 6 och 12 (ca 100 μl/prov) och fördela dem i en ren nukleasfri platta med 96 brunnar. Förvara proverna vid 4 °C i upp till 24 timmar fram till användning eller vid -20 °C under en längre tid.
Anmärkning: Det rekommenderas att använda en 100 μL flerkanalig pipett för att överföra prover till en ny 100-200 μL platta eftersom den direkt kan matcha kolonnerna på provplattan.
- cDNA-generering
OBS: För prover som lagras under lång tid, undvik flera frys-/upptiningscykler. Utför cDNA-generering med hjälp av ett cDNA-kit enligt tillverkarens instruktioner.- I ett 100 eller 200 μL PCR-rör placerat på is/kylblock, tillsätt 2 μL 5x RT-mastermix (t.ex. Perfect Real Time), 5 μL prov-RNA och 3 μL RNas-fri ddH2O per reaktion (total volym 10 μL).
- Placera PCR-röret i en termisk cykler som är inställd på att köras vid 37 °C i 15 minuter (omvänd transkription), 85 °C i 5 s (värmeinaktivering av omvänt transkriptas) och 4 °C under en oändlig tid.
OBS: Bearbeta proverna omedelbart eller förvara vid 4 °C i upp till 24 timmar fram till användning eller vid -20 °C i upp till 6 månader.
2. Optimering av ddPCR-analys och arbetsflöde
OBS: Optimera analyserna före/efter avläsning av dropparna. Beroende på resultaten kan de optimeras när som helst i arbetet för att uppnå bättre resultat. Nedan följer några vanliga faktorer som bör beaktas vid optimering av ddPCR-experiment.
- Validera ddPCR-primrar och prober (tabell 1).
OBS: Primrarna ORF1ab och N anpassades från China CDC17, den humana endogena kontrollgenen (RPP30) från Lu et al.18 och RBD2 från Nyaruaba et al.13. Alla primers och prober utom RBD2 hade redan blivit ddPCR-testade och optimerade 7,8,18. - Kör ddPCR-testprovkontrollerna som omfattar en positiv kontroll (ett prov med alla fyra målen), Ingen mallkontroll (NTC; Nukleasfritt vatten eller prov utan mål) och extraktion/negativ kontroll (total nukleinsyra extraherad från en icke-infektiös odlad human cell eller poolade prover från frivilliga hälsoorganisationer).
Standardkontrollprover med kända kopior av målgener är att föredra. I avsaknad av standarder ska du dock använda de tillgängliga proverna för att definiera deras kontroller eller provmatris. Kör kontrollerna tillsammans med testexempel. - Optimera glödgningstemperaturen (figur 2D) genom att införa en temperaturgradient på 55 °C till 65 °C i glödgningssteget för PCR (steg 3.2).
OBS: Glödgningstemperaturoptimering hjälper till att hitta den bästa temperaturen där droppseparationen är maximal (enkel målidentifiering) med minimalt regn. Efter att ha fått resultaten, begränsa temperaturområdet för bättre optimering, t.ex. 55 ° C till 60 ° C. - Optimera primer- och sondkoncentrationerna. Om optimal separation mellan positiva och negativa droppar inte uppnås i analyserna, variera primerkoncentrationen (300-900 nM) och/eller sondkoncentrationen (100-400 nM).
OBS: Att sänka primer / sondkoncentrationer resulterar i en lägre måldroppamplitud och att öka den ökar också målets amplitud. Detta kan vara till hjälp vid amplitudbaserad multiplexering. - Testa den analytiska känsligheten med hänsyn till olika parametrar, inklusive blindgräns (LoB), detektionsgräns (LoD), specificitet och känslighet med hjälp av både standard- och testprover, beroende på vad som föredras.
3. ddPCR-arbetsflöde (figur 1B) och analysutveckling (tabell 2)
OBS: Liksom andra ddPCR-detekteringssystem består detta arbetsflöde också av fyra steg (figur 1B), inklusive beredning av reaktionsblandning, droppgenerering, PCR-amplifiering och droppavläsning.
- Beredning av reaktionsblandning
OBS: Förbered alla analyser i ett rent separat rum och inuti en BSC. Följ standardförsiktighetsåtgärder, inklusive användning av rena handskar, rena pipetter, nukleasfritt vatten och desinfektionsmedel. Alikvotreagenser i separata rör och förvaras vid -20 °C för att undvika upprepade frysupptiningscykler. Förbered analyser enligt tabell 2. Grund- och sondstamlösningar bör förvaras i höga koncentrationer på 100 μM. Arbetslösningarna kan förvaras i alikvoter på 20-40 μM (utspädd i nukleasfritt vatten).- Vanliga steg i alla analyser
OBS: Innan du förbereder analyserna, beräkna den totala volymen mastermix som behövs baserat på antalet prover. Här multiplicerades varje mastermix-komponentvolym med 1,05 för att ta hänsyn till eventuella pipetteringsfel.- Tina och balansera reaktionsmaterial till rumstemperatur. Virvla reaktionskomponenterna kort (30 s) för att säkerställa homogenitet och centrifugera kort för att samla innehållet i botten av röret.
- Bered en primer-sondblandning (PP) per analys genom att blanda specifika reaktionsvolymer enligt tabell 2 från arbetslösningarna.
- Bered mastermixen genom att blanda 11 μL (1x) 2x ddPCR supermix för prober (No dUTP), PP mix (beroende på analys som visas i tabell 2 från arbetslösningen) och nukleasfritt vatten till en slutlig volym på 19,8 μL per brunn. Fördela mastermixen i brunnarna på en nukleasfri 96-brunns ddPCR-platta baserat på antalet prover.
OBS: För provplattan, se till att alla 8 brunnar i en kolumn har lösningen. Om endast ett fåtal brunnar används, t.ex. 5 prover, fyll de övriga 3 brunnarna med 22 μL nukleasfritt vatten eller kontrollbuffert vardera. - För att få den slutliga reaktionsblandningsvolymen (22 μL), tillsätt 2,2 μL cDNA-prov per brunn innehållande mastermix. Försegla plattan med en engångs PCR-plattförseglare.
OBS: Utför provtilläggen i det angivna rummet. Inkludera kontrollerna, dvs positiv, NTC och extraktion. Dessutom, om RNA-proverna har låg koncentration, minska volymen vatten i mastermixen och öka provvolymen i enlighet därmed upp till 5,5 uL. - När reaktionsblandningen har fördelats per brunn, virvel kort (15-30 s) och centrifugera (10-15 s) för att samla innehållet i botten av plattan. Fortsätt för droppgenerering.
- Vanliga steg i alla analyser
- Automatiserad generering av droppar (kompletterande figur 1)
OBS: Olika droppgeneratorer kan användas; Denna studie utfördes dock med en automatiserad droppgenerator (AutoDG). För att undvika amplikonkontaminering, se till att droppgeneratorn och läsarna har särskilt utrymme i separata områden. Vid påfyllning av förbrukningsmaterial rekommenderas att du börjar ladda från instrumentets baksida och arbetar framåt för att undvika att flytta händerna över förbrukningsvarorna för att undvika korskontaminering.- Skaffa alla förbrukningsvaror som behövs för att ställa in AutoDG, inklusive AutoDG-olja för prober, DG32-patroner, pipettspetsar, kylblock, provplatta, droppplatta (ny ren ddPCR-platta) och en papperskorg.
- På AutoDG-pekskärmen trycker du på Konfigurera provplatta och väljer kolumner där prover finns på provplattan och trycker på OK.
OBS: Skärmen blir gul vilket indikerar LOAD var förbrukningsvaror ska laddas. - Öppna AutoDG-dörren och lasta förbrukningsmaterial på sina respektive platser.
OBS: De respektive platserna där förbrukningsvaror ska laddas kommer att ha en gul indikator som senare blir grön om förbrukningsvarorna laddas. Detta liknar pekskärmen. - Fyll på provplattan och droppgenereringsplattan.
OBS: Droppgenereringsplattan ska placeras på kylblocket. Se till att kylblocket är lila (klart att använda) och inte rosa (bör förvaras i en frys tills färgen blir lila). - Stäng AutoDG-luckan, se till att skärmen är grön (förbrukningsmaterial laddade) och välj/se till att oljetypen är Oil for Probes innan du trycker på Start Droplet Generation.
- Vänta tills dropparna genereras. Öppna luckan när skärmen visar Droplets Ready och ta bort plattan som innehåller dropparna.
- Försegla plattan med en genomborrbar folietätning med en plattförseglare som är inställd på 185 oC i 5 sekunder. Fortsätt till PCR-förstärkning.
PCR-amplifiering bör påbörjas inom 30 minuter efter droppgenerering.
- PCR-förstärkning
- För in den förseglade droppplattan i en 96-djup brunnsvärmecykler, ställ in provvolymen på 40 μL och locktemperaturen på 105 °C.
- PCR förstärker dropparna med hjälp av programmet: 95 °C i 10 minuter (enzymaktivering), 40 denatureringscykler vid 94 °C i 30 sekunder och 1 min glödgning/förlängning vid 57 °C, enzymdeaktivering vid 98 °C i 10 minuter och hållsteg vid 4 °C på obestämd tid. Efter PCR, läs av dropparna eller förvara vid 4 °C i upp till 24 timmar.
Använd en ramphastighet på 2 °C/s i alla steg, eftersom ramphastigheterna kan variera för olika termiska cykler. Håll plattan i minst 30 minuter vid 4 °C så att dropparna stabiliseras innan dropparna läses av.
- Droppläsning
- Överför den termiska cykliska 96-brunnsplattan till en droppläsare och öppna/starta den medföljande programvaran på en dator ansluten till droppläsaren.
- I inställningsläget väljer du Ny och dubbelklickar sedan på valfri brunn för att öppna dialogrutan Brunnsredigerare . Välj de brunnar som ska läsas och välj Experiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix för prober (ingen dUTP), Mål 1-typ: Ch1 okänd, mål 2-typ: Ch2 okänd.
OBS: Negativ, tom, NTC eller positiv kan väljas från rullgardinsmenyn för mål 1/2 typ för kontrollproverna. - Tilldela mål- eller provnamnen baserat på plattlayout och välj Använd. När du är klar väljer du OK och sparar den skapade mallen. Klicka på Kör och välj rätt färg (FAM / HEX) när du uppmanas till det.
OBS: Grundning av systemet före körning rekommenderas före dagens första körning. Kontrollera också om alla lampor i läsaren är gröna och om inte, följ den rekommenderade applikationen på verktygstipsstatusen. - När datainsamlingen är klar tar du bort plattan från läsaren. Analysera data efter behov.
OBS: Eftersom preliminära resultat kan ses på skärmen kan körning av de positiva proverna i de första brunnarna användas för kvalitetskontroll i realtid.
4. Dataanalys (kompletterande figur 2 och 3)
- Kontrollera data från alla brunnar för totalt antal droppar. Om droppantalet är < 10 000, kassera resultaten och upprepa analysen. Ställ in en avstängning för att acceptera positiva och negativa resultat. T.ex. kan ett droppantal på upp till 3 eller fler positiva droppar betraktas som avskärning för positiva resultat.
Data för alla analyser, inklusive simplex-, duplex-, triplex-, sondmix- och quadruplex-analyser genereras med hjälp av den medföljande programvaran. Denna programvara är dock endast lämplig för simplex- och duplexanalyser. För multiplexanalyser med hög order (>3 mål) behövs en extern programvara. - Simplex- och duplexanalyser
OBS: Den externa programvaran kan också analysera simplex- och duplexdata. Att använda den medföljande programvaran är dock lättare för dessa analyser, som därför används i den här artikeln.- Dubbelklicka på .qlp-filen som ska analyseras för att öppna den och välj Analysera.
- Använd tröskelverktygen i 1D-amplituden och 2D-amplituden för att skilja mellan positiva och negativa droppar för varje brunn i rätt kanal. NTC och positiva kontrollprover kan användas som vägledning för fastställande av tröskelvärden.
OBS: FAM-resultat ses i kanal 1 medan HEX/VIC i kanal 2. - Efter tröskelinställningen kan resultaten exporteras som en .csv fil och analyseras vidare i Excel eller spelas in genom att läsa direkt i resultatfönstret.
- Triplex sondblandning (kompletterande figur 2) och quadruplex tester (kompletterande figur 2)
OBS: Innan du analyserar triplexprobblandningen och quadruplex-analysen, ladda ner den externa programvaran. Se de lägsta systemkraven innan du installerar.- Öppna .qlp-filen genom att högerklicka på den och välja Öppna med den externa programvaran, eller genom att öppna den externa programvaran och klicka på alternativet Bläddra för att hitta .qlp-filen i din mapp, eller genom att helt enkelt dra .qlp-filen och släppa den på den redan öppna externa programvaran.
- På fliken plattredigerare väljer du brunnarna som ska analyseras till höger på fliken.
- För triplexprobblandning väljer du Direct Quantification (DQ) som experimenttyp, väljer Probe Mix Triplex som analysinformation och anger målnamn därefter och klickar sedan på Apply.
- För quadruplex väljer du Direct Quantification (DQ) som experimenttyp, väljer Amplitude Multiplex som analysinformation och anger målnamn därefter och klickar sedan på Apply.
- Till vänster på fliken 2D-amplitud använder du Diagramverktyg för att tilldela specifika färger till olika målkluster efter popup-förslag i fönstret Välj att tilldela kluster .
Önskat klusterläge kan tillämpas baserat på användarnas önskemål. - När målfärgerna har tilldelats kan kvantifieringsdata läsas i fönstret Brunnsdata längst ned till höger. Exportera data till Excel/csv för vidare analys med hjälp av trippelstapelikonen längst upp till höger i brunnsdatatabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en proof-of-concept-studie testades multiplexanalysernas analytiska prestanda på kliniska och forskningsprover19. Multiplexanalysernas prestanda var överlägsen den för en RT-PCR19. Eftersom ett lågt antal droppar kan indikera ett problem under generering av droppar, fastställdes i denna artikel en cutoff på 10 000 droppar per brunn baserat på empiriska data.
En bra separation mellan positiva och negativa droppar med minimal regnstörning kan hjälpa till vid dataanalys. Därför, i ett bra experiment, är analysoptimering nyckeln19. Som framgår av resultaten från analysen av temperaturgradienten i figur 2D kunde höga glödgningstemperaturer (t.ex. 65 °C) inte tydligt skilja positiva droppar från negativa droppar när en duplexanalys (N (FAM) och RPP30 (HEX)) kördes. Med en minskning av glödgningstemperaturen uppnåddes emellertid optimal separation mellan positiva och negativa droppar. En temperatur på 57 °C befanns vara optimal. Detta kan också observeras i andra analyser19.
Med hjälp av ett tvåfärgs (FAM/HEX) RT-ddPCR-detekteringssystem är det möjligt att detektera ett (figur 2A, B), två (figur 2C), tre (figur 3A) och fyra (figur 3B) SARS-CoV-2-mål inom ett enda prov. Under dataanalys kan den medföljande programvaran som används för att läsa droppar endast analysera simplex- och duplexanalyser som visas i figur 2. Detta innebär att för högre ordningens multiplexanalyser (>3 mål) bör en extern programvara användas för dataanalys som visas i figur 3, S2 och S3. Det är viktigt att också notera att den externa programvaran också kan användas för att analysera simplex- och duplexdata. För simplex- och duplexdata är analysen ganska enkel eftersom målen separeras som antingen positiva eller negativa droppar i sina respektive kanaler som visas i figur 2. Ett NTC-prov kan hjälpa till att placera negativa droppar som i sin tur kan hjälpa en att ställa in tröskelvärden för dataanalys som visas i figur 2A. För duplexanalysen kan analys göras i enskilda kanaler (figur 2B i, ii) eller i 2D-amplituden (figur 2B iii).
För högre ordningens multiplexanalyser är dataanalys inte enkel, och uppmärksamhet bör fokuseras på droppmåltilldelning. När du har installerat den externa programvaran väljer du brunnar som ska analyseras, väljer lämplig experimenttyp och tilldelar målkluster baserat på experimenttyp som visas i figur S2 och S3. Fönstret Välj att tilldela kluster kommer att vägleda en om hur man tilldelar kluster i de högre multiplexanalyserna. Använd diagramverktygen för att tilldela upp till 8 droppkluster för triplexsondblandningsanalysen (figur 3A) och upp till 16 droppkluster för quadruplex-amplitudbaserad analys (figur 3B).
Efter tilldelning av kluster och tröskelvärden kan kvantifieringsdata för varje mål i form av kopior/μl läsas i brunnsdatafönstret längst ned till höger i den externa programvaran. Dessa data kan användas för att uppskatta antalet kopior av mål i startprovet. T.ex. om 2,2 μL av provet användes i en slutlig volym på 22 μL, och programvaran registrerade 30,5 kopior/μL för ORF1ab, fanns det 30,5 x 22 = 671 kopior av ORF1ab i PCR-mixen. Blandningen innehöll 2,2 μL originalprov, därför fanns det 671 kopior av ORF1ab i startprovet och 671/2,2 = 305 kopior/μL ORF1ab i originalprovet. Denna metod kan användas för att uppskatta koncentrationen av varje mål i alla analyser.
| Mål | Sekvens 5' till 3' | Sond färgämne (er) | Produktens längd (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Framåt | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM och BHQ1-3' 5'- HEX och BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Omvända | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sond | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Framåt | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM och BHQ1-3' 5'- HEX och BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Omvända | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sond | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Framåt | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX och BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Omvända | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sond | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Framåt | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM och BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Omvända | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sond | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabell 1: Primer- och sondsekvenser som används för att utveckla de olika SARS-CoV-2-analyserna.
| Slutlig koncentration av primersond per test i nMa | |||||
| Mål | Primer/sond | Simplexb | Duplexc | Triplex sond blandningd | Fourplex amplitude |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a I alla analyser kan målen bytas ut baserat på användarnas preferenser. De mål som används är för demonstrationsändamål för detta experiment. | |||||
| b Endast ett mål kan detekteras åt gången i simplexanalysen i antingen FAM- eller HEX-kanalen. RBD2 används för att demonstrera FAM-kanalresultat medan RPP30 används för HEX-kanalen. | |||||
| c Två mål kan detekteras åt gången i duplexanalysen i FAM- och HEX-kanalen. | |||||
| d Tre mål kan detekteras med båda kanalerna, dvs. mål 1 kommer att detekteras i FAM (1× sondkoncentration), mål två i HEX (1× sondkoncentration) och mål 3 i båda kanalerna (en blandning av 0,5× HEX och 0,5× FAM-sondkoncentratidiner för att utgöra den slutliga 1×). | |||||
| e Två mål detekteras i varje kanal (FAM och HEX) med 1× och O.5× sondkoncentration i varje kanal. | |||||
Tabell 2: Slutlig koncentration av olika primer- och sondpar per analys.
Figur 1: Provbearbetning och digitalt PCR-arbetsflöde för droppar. (A) Arbetsflödet för provbearbetning inkluderar provtagning och transport till en BSL-2-anläggning, inaktivering, extraktion och cDNA-generering. (B) Det digitala PCR-arbetsflödet för droppar börjar med att förbereda mastermixen, ladda mastermixen i en ddPCR-platta och lägga till prov(er), generera droppar, förstärka mål inuti droppar med PCR och slutligen läsa de förstärkta dropparna med en droppläsare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Simplex- och duplexanalysresultat, inklusive glödgningstemperaturoptimering . (A) Simplexanalys resultat när ett enda mål (RBD2) var FAM-märkt. (B) Simplexanalys resulterar när ett enda mål (RPP30) var HEX-märkt. (C) Duplexanalysresultat för två mål i 1D- och 2D-kanaler (iii) efter att N (i) var FAM-märkt och RPP30 (ii) var HEX-märkt. d) Glödgningstemperaturgradient (65–55 °C) resultat av en dubbelsidig analys märkt med ORF1ab (FAM) och RPP30 (HEX). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Triplex probe mix och quadruplex amplitudbaserade multiplexanalysresultat. (A) Triplex sondblandningsanalysresultat när tre mål märktes med följande förhållanden av FAM: HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) och RPP30 (0:1). (B) Quadruplex amplitudbaserade analysresultat efter att fyra mål märkts med följande förhållanden av FAM: HEX; RBD2(0.5:0), N (1:0), RPP30 (0:0.5) och ORF1ab (0:1). 1 och 0,5 är sondkoncentrationer 250 nM respektive 125 nM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Generering av droppar med hjälp av en automatiserad droppgenerator. a) Förbrukningsvaror som behövs för att inrätta AutoDG. (B) På AutoDG-pekskärmen trycker du på Konfigurera provplatta och väljer kolumner där prover finns på provplattan och trycker på OK. (C) När den har valts blir skärmen gul och anger var förbrukningsvaror ska laddas. (D) Öppna AutoDG-dörren och lasta förbrukningsmaterial på respektive plats. Lasta förbrukningsmaterial bakifrån och arbeta framåt. Se till att varje gång en förbrukningsvara läggs till blir ljuset från gult till grönt på den platsen. (E) Se till att den oljetyp som används är olja för sonder. (F) Stäng AutoDG-luckan och se till att alla reagenser är inställda genom att kontrollera om AutoDG-pekskärmen är grön. (G) Tryck på START Droplet Generation för att generera droppar. (H) När droppgenereringen är klar, öppna AutoDG och ta bort droppplattan. (I) Försegla droppplattan med en genomborrbar folievärmeförsegling. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Steg för analys av amplitudbaserade multiplex ddPCR-analysresultat med hjälp av en extern programvara. (A) Installera den externa programvaran på en dator. (B) Öppna .qlp-filen genom att antingen högerklicka på den och välja Öppna med den installerade externa programvaran eller öppna den externa programvaran och klicka på alternativet Bläddra för att hitta filen i din mapp. Alternativt kan man dra .qlp-filen och släppa den öppna externa programvaran för att öppna den. (C) När den är öppen, till höger på fliken Plate Editor , väljer du probe mix triplex från rullgardinsmenyn och tilldelar målinformation i enlighet därmed och klickar på Apply. (D) På vänster sida av fliken 2D-amplitud använder du diagramverktygen för att tilldela specifika färger till olika mål för detektering och kvantifiering. När droppklustermål har identifierats kan kvantifieringsresultaten ses i fönstret Brunnsdata på samma 2D-amplitudflik. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Steg för analys av amplitudbaserade multiplex ddPCR-analysresultat med hjälp av en extern programvara. (A) Installera den externa programvaran på en dator. (B) Öppna .qlp-filen genom att antingen högerklicka på den och välja Öppna med den installerade externa programvaran, eller öppna den externa programvaran och klicka på alternativet Bläddra för att hitta filen i din mapp. Alternativt kan man dra .qlp-filen och släppa den i den redan öppna externa programvaran för att öppna den. (C) När du är öppen, till höger på fliken Plattredigerare , väljer du amplitudmultiplex från rullgardinsmenyn och tilldelar målinformation i enlighet därmed och klickar på Apply. (D) På vänster sida av fliken 2D-amplitud använder du diagramverktygen för att tilldela specifika färger till olika mål för detektering och kvantifiering. När droppklustermål har identifierats kan kvantifieringsresultaten ses i fönstret Brunnsdata på samma 2D-amplitudflik. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Få resurser finns tillgängliga för hur man utvecklar RT-ddPCR-analyser för SARS-CoV-2-detektering. Även om de inte används i den här artikeln kan standardprover med kända kopior användas för att utveckla och optimera analyser. I detta arbete spikades dock SARS-CoV-2-prover odlade i Vero-E6-celler i en bakgrund av humant genomiskt RNA och användes som standardprover för att utveckla analyserna. Korrekta primer- och sondsekvenser är avgörande vid utveckling av analyser. Eftersom det mesta preliminära arbetet med SARS-CoV-2 RT-ddPCR använde China CDC-primern och sonder riktade mot ORF1ab- och N-genen, hade de funnit dem lämpliga att ingå i detta arbete 7,8,9,10,11. Den analytiska specificiteten och sensitiviteten hos dessa primers har också jämförts med hjälp av ddPCR i föregående arbete7. RBD2-primrarna och sonden13 utvecklades internt och befanns lämpliga för RT-ddPCR. Eftersom analyserna kan användas för olika tillämpningar, inklusive diagnos, inkluderades den risonukleas P-proteinsubenhet p30 (RPP30) specifika humana genen i alla multiplexanalyser. Dessa gener kan användas som en mänsklig endogen kontroll för diagnostiska experiment. När det gäller miljöprovtagning eller annan forskning som inte behöver den mänskliga referensgenen kan man dock växla detta mål med ett annat SARS-CoV-2-mål.
I alla analyser är det viktigt att inkludera kontroller för att validera analyser och experimentella data. Dessa kontroller kan omfatta: NTC (nukleasfritt vatten som prov) för att hjälpa till att fastställa tröskelvärden och lokalisera negativa droppkluster; positiv kontroll (prov med alla SARS-CoV-2-mål, inklusive human referensgen) för att bedöma reagensfel, primer- och sondintegritet och betydande detektering av omvänd transkription/lokalisering av positiva droppmål; och extraktionskontroller (poolade humana prover från friska frivilliga eller total nukleinsyra extraherad från en icke-infektiös odlad human cell) för att upptäcka fel eller framgång i extraktionssteget.
De flesta ddPCR-system, inklusive QX200-systemet, har ett smalt dynamiskt område från 1 till 120 000 kopior/20 μL reaktion. Vid detektering av okända prover är målkoncentrationen i utgångsprovet ofta okänd och detta kan innebära utmaningar vid kvantifiering av högkoncentrerade prover. För att övervinna detta rekommenderas att man vid kvantifiering av prover som misstänks innehålla stora mängder målmolekyler (såsom cellodling) planerar att minska startprovet i enlighet därmed. Om målkopienumret/målgenomet är okänt bör man bestämma den optimala startmängden genom en serie av fyra tiofaldiga serieutspädningar av varje prov vid det förväntade digitala intervallet. Genom att analysera dessa fyra punkter säkerställs att en av datapunkterna ligger inom det optimala digitala intervallet.
Att använda hög primer och låg sondkoncentration är en förutsättning för de flesta simplex- och duplex ddPCR-experiment. Denna skillnad i koncentration ökar amplitudseparationsavståndet mellan de positiva och negativa droppklustren, vilket gör det enkelt att analysera data. Vid utveckling av högre ordningens multiplexanalyser kan dock förändringar i dessa koncentrationer leda till förändringar i positionen för positiva droppmål som visas i figur 3 och 4. Som ett resultat skulle ett analysoptimeringsalternativ förutom glödgningstemperaturen vara att ändra målprimer eller sondkoncentration för att skilja droppar. Detta fenomen har använts och förklarats före14,15,16.
Trots analysprestandan är detta arbete ett tvåstegs RT-ddPCR-arbetsflöde. Det extra omvända transkriptionssteget före ddPCR ger utrymme för kontaminering av prover. Men om noggranna och korrekta provhanteringstekniker används kommer detta att vara ett icke-problem. Positivt är DNA känt för att vara mer stabilt än RNA. Omvandlingen av RNA till cDNA kan förlänga provets hållbarhet under lagring jämfört med RNA. Ett tvåstegs RT-ddPCR-experiment är också billigare än ett enstegs RT-ddPCR-experiment.
Jämfört med RT-qPCR är RT-ddPCR dyrt. Därför bör överväganden göras vid utförande av RT-ddPCR. Till exempel kan man under diagnos använda RT-ddPCR i fallet där deras prover har låga rikliga mål. Det finns dock en möjlighet att kostnaderna för dPCR-instrument och reagens kommer att sjunka snart, och tekniken kommer att anpassas i många laboratorier, som det hände tidigare med vanlig PCR och qPCR. Därför är det viktigt att ställa in protokoll som detta för nuvarande och framtida användare av dPCR. Sammanfattningsvis ger de utvecklade analyserna utrymme för potentiella användare att variera mål baserat på deras applikationer. Multiplexering säkerställer att man effektivt kan upptäcka många mål inom ett enda prov i en enda reaktion. Hittills kan detta vara det första protokollet som ger en fullständig detalj om hur man använder AutoDG-systemet, inklusive den externa programvaran i SARS-CoV-2-detektering. Mer arbete med analysoptimering behöver fortfarande göras för att uppnå bättre separation i quadruplex-analysen. Användningen av standarder kommer också att bidra till att förbättra de utvecklade analyserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Megaproject of Infectious Disease Control från Kinas hälsovårdsministerium, bidragsnummer 2017ZX10302301-005 och Sino-Africa Joint Research Center, bidragsnummer SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
