Summary
Dette arbeidet oppsummerer trinn for å utvikle forskjellige analyser for SARS-CoV-2-deteksjon ved hjelp av et tofarget ddPCR-system. Trinnene er forseggjorte og notater er inkludert om hvordan du kan forbedre analysene og eksperimentytelsen. Disse analysene kan brukes til flere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikasjoner.
Abstract
Diagnostisering av den pågående SARS-CoV-2-pandemien er en prioritet for alle land over hele verden. For tiden er revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) gullstandarden for SARS-CoV-2-diagnose, da ingen permanent løsning er tilgjengelig. Uansett hvor effektiv denne teknikken kan være, har det kommet forskning som viser sine begrensninger i deteksjon og diagnose, spesielt når det gjelder lave rikelige mål. I motsetning til dette har dråpe digital PCR (ddPCR), en nylig fremvoksende teknologi med overlegne fordeler i forhold til qPCR, vist seg å overvinne utfordringene med RT-qPCR i diagnostisering av SARS-CoV-2 fra lave rikelig målprøver. Prospektivt, i denne artikkelen, utvides mulighetene til RT-ddPCR ytterligere ved å vise trinn for hvordan du utvikler simplex, duplex, triplex probe mix og quadruplex analyser ved hjelp av et tofargedeteksjonssystem. Ved å bruke primere og prober rettet mot spesifikke steder i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 og RBD2), er utviklingen av disse analysene vist å være mulig. I tillegg gis detaljerte protokoller, notater og forslag til hvordan du kan forbedre analysearbeidsflyten og analysere data. Tilpasning av denne arbeidsflyten i fremtidige arbeider vil sikre at maksimalt antall mål kan oppdages følsomt i et lite utvalg, noe som forbedrer kostnadene og prøvegjennomstrømningen betydelig.
Introduction
Polymerasekjedereaksjon (PCR), en anerkjent teknikk, har gjennomgått flere transformasjoner siden adventen for å bli en kraftig teknikk som er i stand til å gi svar på nukleinsyreforskning. Disse transformasjonene har vært en konstant forbedring av den gamle teknikken. Disse transformasjonene kan oppsummeres i tre generasjoner1. Den første generasjonen er konvensjonell PCR som er avhengig av gelelektroforese for å kvantifisere og oppdage forsterkede mål. Den andre generasjonen er kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) som kan oppdage prøver i sanntid og stole på en standardkurve for direkte kvantifisering av mål i en prøve. Den tredje generasjonen, digital PCR (dPCR), kan utføre både deteksjon og absolutt kvantifisering av nukleinsyremål uten behov for en standardkurve. dPCR har også blitt forbedret ytterligere fra reaksjonskamre som separeres av brønnene i en vegg til emulsjoner av olje, vann og stabiliserende kjemikalier i samme brønn som sett i dråpebasert digital PCR2. I dråpedigital PCR (ddPCR) deles en prøve inn i tusenvis av dråper i nanoliterstørrelse som inneholder individuelle mål som senere skal kvantifiseres ved hjelp av Poisson-statistikk 2,3,4. Denne teknikken gir ddPCR en fordel i å kvantifisere mål med lav rikelig sammenlignet med de andre generasjonene av PCR.
Nylig har flere applikasjoner fremhevet overlegenheten til ddPCR over den ofte brukte qPCR når man oppdager og kvantifiserer mål med lav mengde 1,5,6. SARS-CoV-2 er intet unntak fra disse applikasjonene 7,8,9,10,11,12. Siden utbruddet av SARS-CoV-2 har forskere jobbet på alle fronter for å komme opp med løsninger på hvordan man diagnostiserer viruset og oppdager det effektivt. Den nåværende gullstandarden gjenstår fortsatt å være qPCR13. Imidlertid har RT-ddPCR vist seg å være mer nøyaktig når det gjelder å oppdage lave mengder SARS-CoV-2-mål fra både miljømessige og kliniske prøver sammenlignet med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De fleste av SARS-CoV-2 ddPCR-publiserte verk er avhengige av simplex-analyser med multipleksene, avhengig av kommersielle analyser. Derfor bør mer gjøres for å forklare hvordan man utvikler multiplekse RT-dPCR-analyser for SARS-CoV-2-deteksjon.
I en riktig analysedesign kan multipleksing brukes til å spare kostnader, øke prøvegjennomstrømningen og maksimere antall mål som kan oppdages følsomt i en liten prøve. Ved multipleksing med ddPCR må man ta hensyn til hvor mange fluoroforer som kan detekteres i et bestemt system. Noen ddPCR-plattformer kan støtte opptil tre kanaler, mens andre bare støtter to kanaler. Derfor, når multipleksing med to kanaler, må man bruke forskjellige tilnærminger, inkludert høyere ordens multipleksing for å oppdage mer enn to mål14,15,16. I dette arbeidet brukes et tofarget ddPCR-deteksjonssystem for å vise trinn for hvordan man utvikler forskjellige SARS-CoV-2 RT-ddPCR-analyser som kan tilpasses for forskjellige forskningsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk erklæring
Wuhan Institute of Virology (WHIOV) er blant laboratoriene og instituttene som er godkjent av China CDC i Wuhan by for å utføre forskning på SARS-CoV-2 og oppdage COVID-19 fra kliniske prøver. Forskning på utvikling av nye diagnostiske teknikker for COVID-19 ved bruk av kliniske prøver er også godkjent av den etiske komiteen ved Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Arbeidsflyt for prøvebehandling (figur 1A)
MERK: Gjennom hele protokollen er det viktig å bruke separate rom med dedikerte pipetter for prøvehåndtering (ekstraksjon og lagring), reagens/mastermix-forberedelse og lagring, klargjøring av reaksjonsblandinger (prøve pluss mastermix) og deteksjon for å unngå krysskontaminering. Analysene som skal utvikles, kan brukes til påvisning av kliniske prøver eller forskningsprøver. Alle prøver skal behandles som om de kan overføre smittestoffer selv ved bruk av sikre laboratorieprosedyrer. Prøvebehandlingstrinn bør gjøres i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium etter strenge BSL-2-regler, inkludert bruk av passende personlig verneutstyr (PPE).
- Eksempel på inaktivering
- Ta 1 ml SARS-CoV-2-prøve til et BSL-2-laboratorium. Varmeinaktiver prøver ved 65 °C i 30 minutter.
MERK: Prøver kan komme fra forskjellige kilder, derfor bør man sørge for at volumet som skal inaktiveres er tilstrekkelig til å sikre etterfølgende RNA-ekstraksjon. De fleste ekstraksjonssett krever et lite prøvevolum på opptil 200 μL, og derfor vil et prøvevolum på ca. 1 ml være tilstrekkelig for inaktivering. Overflateaktive midler, sett og lysisbuffere kan også brukes til direkte inaktivering og RNA-ekstraksjon i henhold til laboratoriets egen SOP. - Ta prøver til et biosikkerhetsskap (BSC) og la dem stå i romtemperatur i 10 minutter for å la potensielle aerosoler sette seg. Oppbevar prøver i 4 °C i opptil 24 timer hvis de ikke behandles umiddelbart.
MERK: Ingen spesifikk beholder er nødvendig for prøvelagring. Prøver kan lagres i rørene eller beholderne som brukes under inaktivering. For dette arbeidet ble de fleste prøvene lagret i virale transportmedier (VTM) rør eller 1,5 ml rør.
- Ta 1 ml SARS-CoV-2-prøve til et BSL-2-laboratorium. Varmeinaktiver prøver ved 65 °C i 30 minutter.
- RNA-ekstraksjon
MERK: Mange RNA-ekstraksjonsinstrumenter og sett med spesifikke protokoller er tilgjengelige for klar bruk. Her presenteres en automatisert prosedyre som følger produsentens instruksjoner.- Ta ut den ferdigfylte 96-dype brønnåpningsplaten; Snu den forsiktig opp ned for å blande magnetkulene. Etter blanding, rist platen forsiktig på en flat overflate for å konsentrere reagens og magnetiske perler som kan være på veggen til platens bunn.
- Riv forsiktig av tetningsfilmen av aluminiumsfolie for å unngå vibrasjoner av platen og væskesøl. Tilsett 20 μL proteinase K og 200 μL av prøven per brønn i rad 2 og 8 av 96-brønnplaten. Deretter plasserer du 96-brønnplaten på undersiden av det 32-kanals automatiske nukleinsyreekstraksjonsinstrumentet.
MERK: Kjør programmet på datamaskinen innen 1 time etter at du har lagt til prøven. - Sett magnetstanghylsen inn i kortsporet på det 32-kanals automatiske nukleinsyreekstraksjonsinstrumentet. Velg programmet GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (hurtigversjon) og kjør det.
- Etter fullført ekstraksjon, ta ut nukleinsyreprøvene i rad 6 og 12 (ca. 100 μL / prøve) og fordel i en ren nukleasefri 96-brønnsplate. Oppbevar prøvene ved 4 °C i opptil 24 timer til bruk eller ved -20 °C over lengre tid.
MERK: Det anbefales å bruke en 100 μL flerkanals pipette for å overføre prøver til en ny 100-200 μL-plate, da den kan matche kolonnene på prøveplaten direkte.
- cDNA-generering
MERK: For prøver som er lagret over lang tid, unngå flere fryse-/tinesykluser. Utfør cDNA-generering ved hjelp av et cDNA-sett i henhold til produsentens instruksjoner.- I et 100 eller 200 μL PCR-rør plassert på is / kjøleblokk, tilsett 2 μL 5x RT-masterblanding (f.eks. Perfect Real Time), 5 μL prøve-RNA og 3 μL RNase-fri ddH2O per reaksjon (totalt volum 10 μL).
- Plasser PCR-røret i en termisk syklist som er satt til å kjøre ved 37 °C i 15 minutter (revers transkripsjon), 85 °C i 5 s (varmeinaktivering av revers transkriptase) og 4 °C i uendelig tid.
MERK: Behandle prøvene umiddelbart, eller oppbevares ved 4 °C i opptil 24 timer til bruk eller ved -20 °C i opptil 6 måneder.
2. Optimalisering av ddPCR-analyse og arbeidsflyt
NOTAT: Optimaliser analysene før / etter å ha lest dråpene. Avhengig av resultatene, kan de optimaliseres når som helst i arbeidet for å oppnå bedre resultater. Nedenfor er noen vanlige faktorer som må vurderes når du optimaliserer ddPCR-eksperimenter.
- Valider ddPCR-primere og sonder (tabell 1).
MERK: Primerne ORF1ab og N ble tilpasset fra Kina CDC17, det humane endogene kontrollgenet (RPP30) fra Lu et al.18 og RBD2 fra Nyaruaba et al.13. Alle primere og prober unntatt RBD2 var allerede ddPCR-testet og optimalisert 7,8,18. - Kjør ddPCR-testprøvekontrollene som består av en positiv kontroll (et utvalg med alle fire målene), Ingen malkontroll (NTC; Nukleasefritt vann eller prøve uten mål) og ekstraksjon/negativ kontroll (total nukleinsyre ekstrahert fra en ikke-infeksiøs dyrket humancelle eller samlede prøver fra helsefrivillige).
MERK: Standard kontrollprøver med kjente kopier av målgener foretrekkes. Hvis det ikke finnes standarder, kan du imidlertid bruke de tilgjengelige eksemplene til å definere kontrollene eller eksempelmatrisen. Kjør kontrollene sammen med testeksempler. - Optimaliser glødetemperaturen (figur 2D) ved å sette inn en temperaturgradient på 55 °C til 65 °C i glødningstrinnet for PCR (trinn 3.2).
MERK: Glødningstemperaturoptimalisering hjelper deg med å finne den beste temperaturen der dråpeseparasjonen er maksimal (enkel målidentifikasjon) med minimalt regn. Etter å ha oppnådd resultatene, begrense temperaturområdet for bedre optimalisering, f.eks. 55 ° C til 60 ° C. - Optimaliser primer- og sondekonsentrasjonene. Hvis optimal separasjon mellom positive og negative dråper ikke oppnås i analysene, varierer primerkonsentrasjonene (300-900 nM) og/eller sonden (100-400 nM).
MERK: Senking av primer-/sondekonsentrasjoner resulterer i en lavere måldråpeamplitude og økning av den øker også målets amplitude. Dette kan være nyttig i amplitudebasert multipleksing. - Test den analytiske følsomheten ved å vurdere forskjellige parametere, inkludert tommegrense (LoB), deteksjonsgrense (LoD), spesifisitet og følsomhet ved å bruke både standard- og testprøver, som foretrukket.
3. ddPCR-arbeidsflyt (figur 1B) og analyseutvikling (tabell 2)
MERK: Som andre ddPCR-deteksjonssystemer består denne arbeidsflyten også av fire trinn (figur 1B), inkludert reaksjonsblandingsforberedelse, dråpegenerering, PCR-forsterkning og dråpeavlesning.
- Forberedelse av reaksjonsblanding
MERK: Forbered alle analyser i et rent, separat rom og inne i en BSC. Følg standard forholdsregler, inkludert bruk av rene hansker, rene pipetter, nukleasefritt vann og desinfeksjonsmidler. Aliquot reagenser i separate rør og lagre ved -20 oC for å unngå gjentatte frysetinesykluser. Forbered analyser som vist i tabell 2. Primer- og sondeløsninger bør lagres i høye konsentrasjoner på 100 μM. Arbeidsløsningene kan lagres i alikoter på 20-40 μM (fortynnet i nukleasefritt vann).- Felles trinn i alle analyser
MERK: Før du utarbeider analysene, beregne det totale volumet av mastermix som trengs basert på antall prøver. Her ble hvert mastermix-komponentvolum multiplisert med 1,05 for å ta hensyn til eventuelle pipetteringsfeil.- Tine og balansere reaksjonsmaterialer til romtemperatur. Vortex reaksjonskomponentene kort (30 s) for å sikre homogenitet, og kort sentrifuge for å samle innholdet i bunnen av røret.
- Klargjør en primersondeblanding (PP) per analyse ved å blande spesifikke reaksjonsvolumer som beskrevet i tabell 2 fra arbeidsløsningene.
- Forbered mastermix ved å blande 11 μL (1x) av 2x ddPCR supermix for prober (No dUTP), PP mix (avhengig av analyse som vist i tabell 2 fra arbeidsløsningen) og nukleasefritt vann til et endelig volum på 19,8 μL per brønn. Fordel mastermixen i brønnene til en nukleasefri 96-brønns ddPCR-plate basert på antall prøver.
MERK: For prøveplaten, sørg for at alle 8 brønnene i en kolonne har løsningen. Hvis bare noen få brønner brukes, f.eks. 5 prøver, fyll de andre 3 brønnene med 22 μL nukleasefritt vann eller kontrollbuffer hver. - For å få det endelige reaksjonsblandingsvolumet (22 μL), tilsett 2,2 μL cDNA-prøve per brønninneholdende mastermix. Forsegl platen med en engangs PCR-plateforsegler.
MERK: Utfør prøvetilleggene i det angitte rommet. Inkluder kontrollene, dvs. positiv, NTC og utvinning. I tillegg, hvis RNA-prøvene har lav konsentrasjon, reduser volumet av vann i mastermixen og øk prøvevolumet tilsvarende opp til 5,5 uL. - Når reaksjonsblandingen er fordelt per brønn, virvel kort (15-30 s) og sentrifuge (10-15 s) for å samle innholdet i bunnen av platen. Fortsett for dråpegenerering.
- Felles trinn i alle analyser
- Automatisert dråpegenerering (tilleggsfigur 1)
MERK: Ulike dråpegeneratorer kan brukes; Denne studien ble imidlertid utført med en automatisert dråpegenerator (AutoDG). For å unngå amplikonforurensning må du sørge for at dråpegeneratoren og leserne har dedikert plass i separate områder. Når du legger inn forbruksvarer, anbefales det å begynne å laste fra baksiden av instrumentet og arbeide mot fronten for å unngå å flytte hendene over forbruksvarene for å unngå krysskontaminering.- Skaff alle forbruksvarer som trengs for å sette opp AutoDG, inkludert AutoDG-olje for sonder, DG32-kassetter, pipettespisser, kjøleblokk, prøveplate, dråpeplate (ny ren ddPCR-plate) og en avfallsbeholder.
- Trykk på Konfigurer prøveplate på AutoDG-berøringsskjermen og velg kolonner der prøvene er plassert på prøveplaten, og trykk på OK.
MERK: Skjermen blir gul og indikerer LOAD hvor forbruksvarer skal lastes inn. - Åpne AutoDG-døren og last inn forbruksvarer på de respektive stedene.
MERK: De respektive stedene der forbruksvarer skal lastes, vil ha en gul indikator som senere blir grønn hvis forbruksvarer lastes. Dette ligner på berøringsskjermen. - Legg i prøveplaten og dråpegenereringsplaten.
NOTAT: Dråpegenereringsplaten skal plasseres på kjøleblokken. Forsikre deg om at kjøleblokken er lilla (klar til bruk) og ikke rosa (bør oppbevares i en fryser til fargen blir tilbake til lilla). - Lukk AutoDG-døren, kontroller at skjermen er grønn (i forbruksvarer lastet), og velg/forsikre deg om at oljetypen er Olje for sonder før du trykker på Start dråpegenerering.
- Vent til dråpene blir generert. Åpne døren når skjermen viser Drops Ready og fjern platen som inneholder dråpene.
- Forsegl platen med en gjennomtrengelig folieforsegling ved hjelp av en plateforsegler satt til å kjøre ved 185 oC i 5 s. Fortsett til PCR-forsterkning.
MERK: PCR-forsterkning bør startes innen 30 minutter etter dråpegenerering.
- PCR-amplifikasjon
- Sett den forseglede dråpeplaten inn i en 96-dyp brønn termisk syklist, sett prøvevolumet til 40 μL og lokktemperaturen til 105 °C.
- PCR forsterker dråpene ved hjelp av programmet: 95 °C i 10 minutter (enzymaktivering), 40 sykluser med denaturering ved 94 °C i 30 s og 1 min glødning/forlengelse ved 57 °C, enzymdeaktivering ved 98 °C i 10 minutter, og hold trinn ved 4 °C på ubestemt tid. Etter PCR, les dråpene eller oppbevar ved 4 ° C i opptil 24 timer.
MERK: Bruk en rampefrekvens på 2 °C / s i alle trinn, da rampehastighetene kan variere for forskjellige termiske syklister. Hold platen i minst 30 minutter ved 4 °C for å tillate dråpestabilisering før dråpene leses av.
- Dråpelesing
- Overfør den termiske syklede 96-brønnsplaten til en dråpeleser, og på en datamaskin som er koblet til dråpeleseren, åpne / start den medfølgende programvaren.
- I installasjonsmodus velger du Ny og dobbeltklikker deretter på en brønn for å åpne dialogboksen Brønnredigering . Velg brønnene som skal leses, og velg Eksperiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix for sonder (ingen dUTP), Target 1 Type: Ch1 Unknown, Target 2 Type: Ch2 Unknown.
MERK: Negativ, tom, NTC eller positiv kan velges fra rullegardinmenyen for måltype 1/2 for kontrolleksemplene. - Tilordne mål- eller eksempelnavnene basert på plateoppsett, og velg Bruk. Når du er ferdig, velger du OK og lagrer den opprettede malen. Klikk på Kjør og velg riktig farge (FAM / HEX) når du blir bedt om det.
MERK: Det anbefales å klargjøre systemet før kjøring før dagens første kjøring. Sjekk også om alle lysene i leseren er grønne, og hvis ikke, følg den anbefalte applikasjonen på verktøytipsstatusen. - Etter at datainnsamlingen er ferdig, fjern platen fra leseren. Analyser data etter behov.
MERK: Siden foreløpige resultater kan sees på skjermen, kan kjøring av positive prøver i de første brønnene brukes til kvalitetskontroll i sanntid.
4. Dataanalyse (tilleggsfigur 2 og 3)
- Sjekk dataene fra alle brønnene for totalt antall dråper. Hvis dråpetallet er < 10 000, kaster du resultatene og gjentar analysen. Sett en avskjæring for å godta positive og negative resultater. F.eks. Et dråpetall på opptil 3 eller flere positive dråper kan betraktes som avskjæring for positive resultater.
MERK: Data for alle analyser, inkludert simpleks-, dupleks-, triplex-sondemiks og quadruplex-analyser genereres ved hjelp av den medfølgende programvaren. Imidlertid er denne programvaren bare egnet for simpleks- og dupleksanalyser. For multipleksanalyser av høy orden (>3 mål) er det nødvendig med en ekstern programvare. - Simpleks- og dupleksanalyser
MERK: Den eksterne programvaren kan også analysere enkle og dupleksdata. Det er imidlertid enklere å bruke den medfølgende programvaren for disse analysene, og brukes derfor i denne artikkelen.- Dobbeltklikk på .qlp-filen som skal analyseres for å åpne den og velg Analyser.
- Bruk terskelverktøyene i 1D-amplitude og 2D-amplitude til å skille mellom positive og negative dråper for hver brønn i riktig kanal. NTC- og positive kontrollprøver kan brukes som veiledning for terskelfastsettelse.
MERK: FAM-resultater ses i kanal 1 mens HEX / VIC i kanal 2. - Etter terskelinnstilling kan resultatene eksporteres som en .csv-fil og analyseres videre i Excel eller registreres ved å lese direkte i resultatvinduet.
- Triplex probe mix (tilleggsfigur 2) og quadruplex analyser (tilleggsfigur 2)
MERK: Før du analyserer triplex-sondeblandingen og quadruplex-analysen, må du laste ned den eksterne programvaren. Se de minste systemkravene før du installerer.- Åpne .qlp-filen ved å høyreklikke på den og velge Åpne med den eksterne programvaren, eller ved å åpne den eksterne programvaren og klikke på Bla gjennom-alternativet for å finne .qlp-filen i mappen din, eller ved å dra .qlp-filen og slippe den på den allerede åpne eksterne programvaren.
- I plateredigeringsfanen velger du brønnene som skal analyseres på høyre side av fanen.
- For triplex probe mix, velg Direct Quantification (DQ) som eksperimenttype, velg Probe Mix Triplex som analyseinformasjon og skriv inn målnavn tilsvarende, og klikk deretter på Bruk.
- For quadruplex, velg Direct Quantification (DQ) som eksperimenttype, velg Amplitude Multiplex som analyseinformasjon og skriv inn målnavn tilsvarende, og klikk deretter på Bruk.
- På venstre side av kategorien 2D-amplitude bruker du Grafverktøy til å tilordne bestemte farger til forskjellige målgrupper, ved å følge popup-forslagene i vinduet Velg for å tilordne klynge .
MERK: Foretrukket klyngemodus kan brukes basert på brukernes preferanser. - Når målfargene er tildelt, kan kvantifiseringsdata leses i brønndatavinduet nederst til høyre. Eksporter data til Excel/csv for videre analyse ved hjelp av trippellinjeikonet øverst til høyre i brønndatatabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en proof-of-concept-studie ble multiplex-analysens analytiske ytelse testet på kliniske prøver og forskningsprøver19. Ytelsen til multipleksanalysene var bedre enn for en RT-PCR19. Siden lavt antall dråper kan indikere et problem under dråpegenerering, ble det i denne artikkelen satt en grenseverdi på 10 000 dråper per brønn basert på empiriske data.
En god separasjon mellom positive og negative dråper med minimal regninterferens kan hjelpe til med dataanalyse. Derfor, i et godt eksperiment, er analyseoptimalisering nøkkelen19. Som vist i resultatene fra temperaturgradientanalysen i figur 2D, kunne høye glødetemperaturer (f.eks. 65 °C) ikke tydelig skille positive dråper fra negative dråper når en dupleksanalyse (N (FAM) og RPP30 (HEX)) ble kjørt. Imidlertid, med en reduksjon i glødetemperatur, ble optimal separasjon mellom positive og negative dråper oppnådd. En temperatur på 57 °C ble funnet optimal. Dette kan også observeres i andre analyser19.
Ved å bruke et tofarget (FAM/HEX) RT-ddPCR-deteksjonssystem er det mulig å oppdage ett (figur 2A, B), to (figur 2C), tre (figur 3A) og fire (figur 3B) SARS-CoV-2-mål i en enkelt prøve. Under dataanalyse kan den medfølgende programvaren som brukes til å lese dråper, bare analysere enkle og dupleksanalyser som vist i figur 2. Dette betyr at for multipleksanalyser av høyere orden (>3 mål), bør en ekstern programvare brukes til dataanalyse som vist i figur 3, S2 og S3. Det er også viktig å merke seg at den eksterne programvaren også kan brukes til å analysere simpleks- og dupleksdata. For enkle og dupleksdata er analysen ganske enkel, da målene skilles ut som enten positive eller negative dråper i sine respektive kanaler som vist i figur 2. En NTC-prøve kan hjelpe til med plasseringen av negative dråper som igjen kan hjelpe en med å sette terskler for dataanalyse som vist i figur 2A. For dupleksanalysen kan analysen gjøres i individuelle kanaler (figur 2B i,ii) eller i 2D-amplituden (figur 2B iii).
For multipleksanalyser av høyere orden er dataanalyse ikke grei, og oppmerksomheten bør fokuseres på dråpemåltildeling. Når du har installert den eksterne programvaren, velger du brønner som skal analyseres, velger riktig eksperimenttype og tilordner målklynger basert på eksperimenttype som vist i figur S2 og S3. Vinduet Velg for å tilordne klynge vil veilede en om hvordan du tilordner klynger i de høyere multipleksanalysene. Bruk grafverktøyene til å tilordne opptil 8 dråpeklynger for triplex-sondeblandingsanalysen (figur 3A) og opptil 16 dråpeklynger for den kvadrupleksamplitudebaserte analysen (figur 3B).
Etter tildeling av klynger og terskler kan kvantifiseringsdata for hvert mål i form av kopier/μL leses i brønndatavinduet nederst til høyre i den eksterne programvaren. Disse dataene kan brukes til å beregne antall kopier av mål i starteksemplet. F.eks. hvis 2,2 μL av prøven ble brukt i et endelig volum på 22 μL, og programvaren registrerte 30,5 kopier/μL for ORF1ab, var det 30,5 x 22 = 671 kopier av ORF1ab i PCR-blandingen. Blandingen inneholdt 2,2 μL originalprøve, derfor var det 671 kopier av ORF1ab i startprøven, og 671/2,2 = 305 kopier/μL ORF1ab i den opprinnelige prøven. Denne metoden kan brukes til å estimere konsentrasjonen av hvert mål i alle analyser.
| Mål | Sekvens 5' til 3' | Probe fargestoff (er) | Produktlengde (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Fremover | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM og BHQ1-3' 5'- HEX og BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Omvendt | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sonde | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Fremover | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM og BHQ1-3' 5'- HEX og BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Omvendt | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sonde | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Fremover | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX og BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Omvendt | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sonde | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Fremover | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM og BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Omvendt | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sonde | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabell 1: Primer- og sondesekvenser brukt til å utvikle de ulike SARS-CoV-2-analysene.
| Endelig konsentrasjon av primersonde per analyse i nMa | |||||
| Mål | Primer/sonde | Simpleksb | Tosidigc | Triplex sonde mixd | Fourplex amplitudee |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| NR | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a I alle analyser kan målene byttes ut basert på brukerens preferanser. De brukte målene er for demonstrasjonsformål av dette eksperimentet. | |||||
| b Bare ett mål kan detekteres om gangen i simpleksanalysen i enten FAM- eller HEX-kanalen. RBD2 brukes til å demonstrere FAM-kanalresultater mens RPP30 brukes til HEX-kanalen. | |||||
| c To mål kan detekteres om gangen i dupleksanalysen i FAM- og HEX-kanalen. | |||||
| d Tre mål kan detekteres ved hjelp av begge kanalene, dvs. mål 1 vil bli detektert i FAM (1× sondekonsentrasjon), mål to i HEX (1× sondekonsentrasjon) og mål 3 i begge kanaler (en blanding av 0,5× HEX og 0,5× FAM-sondekonsentraliner for å utgjøre den endelige 1×). | |||||
| e To mål oppdages i hver kanal (FAM og HEX) med 1× og O.5× sondekonsentrasjon i hver kanal. | |||||
Tabell 2: Endelig konsentrasjon av forskjellige primer- og sondepar per analyse.
Figur 1: Prøvebehandling og dråpefysisk PCR-arbeidsflyt. (A) Arbeidsflyten for prøvebehandling inkluderer prøveinnsamling og transport til et BSL-2-anlegg, inaktivering, ekstraksjon og cDNA-generering. (B) Den digitale PCR-arbeidsflyten for dråpe begynner med forberedelse av mastermixen, lasting av mastermixen i en ddPCR-plate og tilsetning av prøve(r), generering av dråper, forsterkning av mål inne i dråper ved PCR, og til slutt lesing av de forsterkede dråpene ved hjelp av en dråpeleser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Simpleks- og dupleksanalyseresultater, inkludert glødningstemperaturoptimalisering. (A) Simpleksanalyseresultater når et enkelt mål (RBD2) ble FAM-merket. (B) Simplex-analyseresultater når et enkelt mål (RPP30) var HEX-merket. (C) Tosidig analyseresultat av to mål i 1D og 2D (iii) Kanaler etter N (i) var FAM-merket og RPP30 (ii) var HEX-merket. (D) Glødningstemperaturgradient (65 °C til 55 °C) resultater av en dupleksanalyse merket med ORF1ab (FAM) og RPP30 (HEX). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Triplex probe mix og quadruplex amplitude-based multiplex assay resultater. (A) Triplex probe mix assay resultater når tre mål ble merket med følgende forhold av FAM: HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) og RPP30 (0:1). (B) Quadruplex amplitudebaserte analyseresultater etter fire mål ble merket med følgende forhold mellom FAM: HEX; RBD2(0.5:0), N (1:0), RPP30 (0:0.5) og ORF1ab (0:1). 1 og 0,5 er sondekonsentrasjoner henholdsvis 250 nM og 125 nM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Dråpegenerering ved hjelp av en automatisert dråpegenerator. (A) Forbruksvarer som trengs for å sette opp AutoDG. (B) Trykk på Konfigurer prøveplate på AutoDG-berøringsskjermen og velg kolonner der prøvene er plassert på prøveplaten, og trykk på OK. (C) Når den er valgt, blir skjermen gul og indikerer hvor forbruksvarer skal lastes inn. (D) Åpne AutoDG-døren og last inn forbruksvarer på de respektive stedene. Last inn forbruksvarer fra baksiden som arbeider mot fronten. Forsikre deg om at hver gang en forbruksvare legges til, skifter lyset fra gult til grønt på det stedet. (E) Forsikre deg om at oljetypen som brukes er olje til sonder. (F) Lukk AutoDG-døren og kontroller at alle reagenser er satt på plass ved å kontrollere om AutoDG-berøringsskjermen er grønn. (G) Trykk på START dråpegenerering for å generere dråper. (H) Når dråpegenereringen er fullført, åpner du AutoDG og fjerner dråpeplaten. (I) Forsegle dråpeplaten med en gjennomtrengelig folievarmeforsegling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Trinn for analyse av amplitudebaserte multiplex ddPCR-analyseresultater ved hjelp av en ekstern programvare. (A) Installer den eksterne programvaren på en datamaskin. (B) Åpne .qlp-filen ved å enten høyreklikke på den og velge Åpne med den installerte eksterne programvaren eller åpne den eksterne programvaren og klikke på Bla gjennom-alternativet for å finne filen i mappen din. Alternativt kan man dra .qlp-filen og slippe den åpne eksterne programvaren for å åpne den. (C) Når den er åpen, på høyre side av Plate Editor-fanen , velger du sondemiks triplex fra rullegardinmenyen og tilordner målinformasjon deretter, og klikker på Bruk. (D) På venstre side av kategorien 2D-amplitude bruker du Graph Tools til å tilordne bestemte farger til forskjellige mål for deteksjon og kvantifisering. Når dråpeklyngemål er identifisert, kan kvantifiseringsresultatene ses i brønndatavinduet i samme 2D-amplitudefane. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Trinn for analyse av amplitudebaserte multiplex ddPCR-analyseresultater ved bruk av en ekstern programvare. (A) Installer den eksterne programvaren på en datamaskin. (B) Åpne .qlp-filen ved å enten høyreklikke på den og velge Åpne med den installerte eksterne programvaren, eller åpne den eksterne programvaren og klikke på Bla gjennom-alternativet for å finne filen i mappen din. Alternativt kan man dra .qlp-filen og slippe den i den allerede åpne eksterne programvaren for å åpne den. (C) Når den er åpen, på høyre side av Plate Editor-fanen , velger du amplitudemultiplex fra rullegardinmenyen og tilordner målinformasjon deretter, og klikker på Bruk. (D) På venstre side av kategorien 2D-amplitude bruker du Graph Tools til å tilordne bestemte farger til forskjellige mål for deteksjon og kvantifisering. Når dråpeklyngemål er identifisert, kan kvantifiseringsresultatene ses i brønndatavinduet i samme 2D-amplitudefane. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Få ressurser er tilgjengelige for hvordan man utvikler RT-ddPCR-analyser for SARS-CoV-2-deteksjon. Selv om det ikke brukes i denne artikkelen, kan standardprøver med kjente kopier brukes til å utvikle og optimalisere analyser. I dette arbeidet ble imidlertid SARS-CoV-2-prøver dyrket i Vero-E6-celler pigget i en bakgrunn av humant genomisk RNA og brukt som standardprøver for å utvikle analysene. Riktig primer- og sondesekvenser er avgjørende når du utvikler analyser. Siden det meste av forarbeidet på SARS-CoV-2 RT-ddPCR brukte China CDC-primeren og prober rettet mot ORF1ab- og N-genet, hadde de funnet dem egnet til å bli inkludert i dette arbeidet 7,8,9,10,11. Den analytiske spesifisiteten og sensitiviteten til disse primerne har også blitt sammenlignet ved hjelp av ddPCR i det tidligere arbeidet7. RBD2-primerne og sonden13 ble utviklet internt og funnet egnet for RT-ddPCR. Siden analysene kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert diagnose, ble ribonuklease P-proteinsubenheten p30 (RPP30) spesifikt humant gen inkludert i alle multipleksanalyser. Disse genene kan brukes som en menneskelig endogen kontroll for diagnostiske eksperimenter. Når det gjelder miljøprøvetaking eller annen forskning som ikke trenger det humane referansegenet, kan man imidlertid veksle mellom dette målet med et annet SARS-CoV-2-mål.
I alle analyser er det viktig å inkludere kontroller for å validere analyser og eksperimentelle data. Disse kontrollene kan omfatte: NTC (nukleasefritt vann som prøve) for å hjelpe til med å sette terskler og lokalisere negativ dråpeklynge; positiv kontroll (prøve med alle SARS-CoV-2-mål, inkludert humant referansegen) for å vurdere reagenssvikt, primer- og sondeintegritet, og betydelig deteksjon av revers transkripsjon/lokalisering av positive dråpemål; og ekstraksjonskontroller (samlede humane prøver fra friske frivillige eller total nukleinsyre ekstrahert fra en ikke-smittsom dyrket human celle) for å oppdage ekstraksjonstrinnfeil eller suksess.
De fleste ddPCR-systemer, inkludert QX200-systemet, har et smalt dynamisk område fra 1 til 120 000 kopier/20 μL reaksjon. Ved påvisning av ukjente prøver er målkonsentrasjonen i startprøven ofte ukjent, og dette kan by på utfordringer ved kvantifisering av høykonsentrerte prøver. For å overvinne dette anbefales det at man ved kvantifisering av prøver som mistenkes å inneholde store mengder målmolekyler (for eksempel cellekultur), bør planlegge å redusere startprøven tilsvarende. I tilfeller der målkopinummeret/genomet er ukjent, bør man bestemme det optimale startbeløpet gjennom en serie på fire ti ganger seriefortynning av hver prøve ved forventet digitalt område. Ved å analysere disse fire punktene sikres det at et av datapunktene er innenfor det optimale digitale området.
Å bruke høy primer og lav sondekonsentrasjon er en forutsetning for de fleste simpleks- og duplekseksperimenter med ddPCR. Denne forskjellen i konsentrasjon øker amplitudeseparasjonsavstanden mellom de positive og negative dråpeklyngene, og gjør det dermed enkelt å analysere data. Ved utvikling av multipleksanalyser av høyere orden kan imidlertid endringer i disse konsentrasjonene føre til endringer i posisjonen til positive dråpemål som vist i figur 3 og 4. Som et resultat vil et analyseoptimaliseringsalternativ bortsett fra glødetemperatur være å endre målprimer eller sondekonsentrasjon for å skille dråper. Dette fenomenet har blitt brukt og forklart før14,15,16.
Til tross for analyseytelsen, er dette arbeidet en to-trinns RT-ddPCR-arbeidsflyt. Det ekstra omvendte transkripsjonstrinnet før ddPCR, gir rom for forurensning av prøver. Men hvis det brukes forsiktig og riktig prøvehåndteringsteknikk, vil dette være et ikke-problem. Positivt er DNA kjent for å være mer stabilt enn RNA. Omdannelsen av RNA til cDNA kan forlenge prøvens holdbarhet under lagring sammenlignet med RNA. Et to-trinns RT-ddPCR-eksperiment er også billigere enn et ett-trinns RT-ddPCR-eksperiment.
Sammenlignet med RT-qPCR er RT-ddPCR dyrt. Derfor bør det tas hensyn når du utfører RT-ddPCR. For eksempel, under diagnose, kan man bruke RT-ddPCR i tilfelle hvor prøvene deres har lave rikelig mål. Det er imidlertid en mulighet for at kostnadene for dPCR-instrumenter og reagenser snart vil falle, og teknikken vil bli tilpasset i mange laboratorier, slik det tidligere skjedde med vanlig PCR og qPCR. Derfor er det viktig å sette protokoller som dette for nåværende og fremtidige brukere av dPCR. Avslutningsvis gir de utviklede analysene rom for potensielle brukere å variere mål basert på deres applikasjoner. Multipleksing vil sikre at man effektivt kan oppdage mange mål i en enkelt prøve i en enkelt reaksjon. Så langt kan dette være den første protokollen som gir en fullstendig detalj om hvordan du bruker AutoDG-systemet, inkludert den eksterne programvaren i SARS-CoV-2-deteksjon. Mer arbeid med analyseoptimalisering må fortsatt gjøres for å oppnå bedre separasjon i quadruplex-analysen. Bruken av standarder vil også bidra til å forbedre de utviklede analysene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Megaproject of Infectious Disease Control fra Helsedepartementet i Kina, tilskuddsnummer 2017ZX10302301-005 og Sino-Africa Joint Research Center, tilskuddsnummer SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
