Summary
Questo lavoro riassume i passaggi nello sviluppo di diversi saggi per il rilevamento di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema ddPCR a due colori. I passaggi sono elaborati e sono state incluse note su come migliorare i test e le prestazioni dell'esperimento. Questi test possono essere utilizzati per molteplici applicazioni SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
La diagnosi della pandemia di SARS-CoV-2 in corso è una priorità per tutti i paesi del mondo. Attualmente, la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) è il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2 in quanto non è disponibile una soluzione permanente. Per quanto efficace possa essere questa tecnica, la ricerca è emersa mostrando i suoi limiti nel rilevamento e nella diagnosi, specialmente quando si tratta di obiettivi a bassa abbondanza. Al contrario, la PCR digitale a goccia (ddPCR), una recente tecnologia emergente con vantaggi superiori rispetto alla qPCR, ha dimostrato di superare le sfide della RT-qPCR nella diagnosi di SARS-CoV-2 da campioni bersaglio a bassa abbondanza. In prospettiva, in questo articolo, le capacità di RT-ddPCR sono ulteriormente ampliate mostrando i passaggi su come sviluppare saggi simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex utilizzando un sistema di rilevamento a due colori. Utilizzando primer e sonde mirati a siti specifici del genoma di SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), lo sviluppo di questi saggi si è dimostrato possibile. Inoltre, vengono forniti protocolli dettagliati, note e suggerimenti passo dopo passo su come migliorare il flusso di lavoro dei saggi e analizzare i dati. L'adattamento di questo flusso di lavoro nei lavori futuri garantirà che il numero massimo di obiettivi possa essere rilevato in modo sensibile in un piccolo campione, migliorando significativamente i costi e la produttività del campione.
Introduction
La reazione a catena della polimerasi (PCR), una tecnica ben riconosciuta, ha subito diverse trasformazioni dal suo avvento per diventare una tecnica potente in grado di fornire risposte alla ricerca sugli acidi nucleici. Queste trasformazioni sono state un costante miglioramento della vecchia tecnica. Queste trasformazioni possono essere riassunte in tre generazioni1. La prima generazione è la PCR convenzionale che si basa sull'elettroforesi su gel per quantificare e rilevare bersagli amplificati. La seconda generazione è la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) in grado di rilevare campioni in tempo reale e fare affidamento su una curva standard per quantificare direttamente i bersagli in un campione. La terza generazione, la PCR digitale (dPCR), può eseguire sia il rilevamento che la quantificazione assoluta dei bersagli degli acidi nucleici senza la necessità di una curva standard. La dPCR è stata ulteriormente migliorata dalle camere di reazione separate dai pozzetti di una parete in emulsioni di olio, acqua e sostanze chimiche stabilizzanti all'interno dello stesso pozzo come visto nellaPCR digitale 2 basata su goccioline. Nella PCR digitale a goccia (ddPCR), un campione viene partizionato in migliaia di goccioline di dimensioni nanolitri contenenti singoli bersagli che saranno successivamente quantificati utilizzando le statistiche di Poisson 2,3,4. Questa tecnica dà alla ddPCR un vantaggio nel quantificare bersagli a bassa abbondanza rispetto alle altre generazioni di PCR.
Recentemente, molteplici applicazioni hanno evidenziato la superiorità della ddPCR rispetto alla qPCR comunemente usata nel rilevare e quantificare bersagli a bassa abbondanza 1,5,6. SARS-CoV-2 non fa eccezione a queste applicazioni 7,8,9,10,11,12. Dall'epidemia di SARS-CoV-2, gli scienziati hanno lavorato su tutti i fronti per trovare soluzioni su come diagnosticare il virus e rilevarlo in modo efficiente. L'attuale gold standard deve ancora essere qPCR13. Tuttavia, RT-ddPCR ha dimostrato di essere più accurato nel rilevare bersagli SARS-CoV-2 a bassa abbondanza da campioni sia ambientali che clinici rispetto a RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La maggior parte dei lavori pubblicati su SARS-CoV-2 ddPCR dipendono da saggi simplex con quelli multiplex che dipendono da saggi commerciali. Quindi, si dovrebbe fare di più per spiegare come sviluppare saggi RT-dPCR multiplex per il rilevamento di SARS-CoV-2.
In un corretto progetto di analisi, il multiplexing può essere utilizzato per risparmiare sui costi, aumentare la produttività del campione e massimizzare il numero di obiettivi che possono essere rilevati in modo sensibile all'interno di un campione piccolo. Quando si esegue il multiplexing con ddPCR, si deve tenere conto di quanti fluorofori possono essere rilevati in un particolare sistema. Alcune piattaforme ddPCR possono supportare fino a tre canali, mentre altre supportano solo due canali. Quindi, quando si esegue il multiplexing con due canali, è necessario utilizzare approcci diversi, incluso il multiplexing di ordine superiore per rilevare più di due target14,15,16. In questo lavoro, un sistema di rilevamento ddPCR a due colori viene utilizzato per mostrare i passaggi su come sviluppare diversi saggi SARS-CoV-2 RT-ddPCR che possono essere adattati per diverse applicazioni di ricerca.
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Protocol
Dichiarazione etica
Wuhan Institute of Virology (WHIOV) è tra i laboratori e gli istituti approvati dal China CDC della città di Wuhan per condurre ricerche su SARS-CoV-2 e rilevare COVID-19 da campioni clinici. La ricerca sullo sviluppo di nuove tecniche diagnostiche per COVID-19 utilizzando campioni clinici è stata approvata anche dal comitato etico dell'Istituto di virologia di Wuhan (2020FCA001).
1. Flusso di lavoro di elaborazione dei campioni (Figura 1A)
NOTA: In tutto il protocollo, è importante utilizzare stanze separate con pipette dedicate per la gestione del campione (estrazione e conservazione), la preparazione e lo stoccaggio di reagenti/mastermix, la preparazione del mix di reazione (campione più mastermix) e la rilevazione, per evitare la contaminazione incrociata. I saggi da sviluppare possono essere utilizzati nella rilevazione di campioni clinici o campioni di ricerca. Tutti i campioni devono essere trattati come se potessero trasmettere agenti infettivi anche quando si utilizzano procedure di laboratorio sicure. Le fasi di elaborazione dei campioni devono essere eseguite in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) seguendo rigide regole BSL-2, compreso l'uso di dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati.
- Inattivazione del campione
- Prelevare 1 mL di campione di SARS-CoV-2 in un laboratorio BSL-2. Campioni termodisattivati a 65 °C per 30 min.
NOTA: I campioni possono provenire da varie fonti, quindi, si dovrebbe assicurarsi che il volume da inattivare sia sufficiente per garantire la successiva estrazione dell'RNA. La maggior parte dei kit di estrazione richiede un piccolo volume di campione fino a 200 μL, quindi un volume di campione di circa 1 mL sarebbe sufficiente per l'inattivazione. Tensioattivi, kit e tamponi di lisi possono anche essere utilizzati per l'inattivazione diretta e l'estrazione dell'RNA secondo il SOP dei laboratori. - Prelevare i campioni in un armadio di biosicurezza (BSC) e lasciarli riposare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire ai potenziali aerosol di depositarsi. Conservare i campioni a 4 °C per un massimo di 24 ore se non lavorati immediatamente.
NOTA: non è richiesto alcun contenitore specifico per la conservazione dei campioni. I campioni possono essere conservati nelle provette o nei contenitori utilizzati durante l'inattivazione. Per questo lavoro, la maggior parte dei campioni è stata conservata in provette di mezzi di trasporto virale (VTM) o provette da 1,5 ml.
- Prelevare 1 mL di campione di SARS-CoV-2 in un laboratorio BSL-2. Campioni termodisattivati a 65 °C per 30 min.
- Estrazione dell'RNA
NOTA: Molti strumenti e kit di estrazione dell'RNA con protocolli specifici sono disponibili per l'uso pronto. Qui viene presentata una procedura automatizzata che segue le istruzioni del produttore.- Estrarre la piastra dell'orifizio del pozzo preriempita profonda 96; Capovolgerlo delicatamente per mescolare le perline magnetiche. Dopo la miscelazione, agitare delicatamente la piastra su una superficie piana per concentrare il reagente e le sfere magnetiche che potrebbero trovarsi sulla parete verso il fondo della piastra.
- Strappare con cura il film sigillante del foglio di alluminio per evitare vibrazioni della piastra e fuoriuscite di liquidi. Aggiungere 20 μL di proteinasi K e 200 μL del campione per pozzetto nelle righe 2 e 8 della piastra a 96 pozzetti. Quindi, posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla base dello strumento automatico di estrazione degli acidi nucleici a 32 canali.
Nota : eseguire il programma sul computer entro 1 h dopo l'aggiunta dell'esempio. - Inserire il manicotto della barra magnetica nello slot per schede dello strumento automatico di estrazione degli acidi nucleici a 32 canali. Selezionare il programma GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (versione rapida) ed eseguirlo.
- Dopo il completamento dell'estrazione, prelevare i campioni di acido nucleico nelle righe 6 e 12 (circa 100 μL/campione) e distribuirli in una piastra pulita priva di 96 pozzetti priva di nucleasi. Conservare i campioni a 4 °C per un massimo di 24 ore fino all'uso o a -20 °C per un periodo più lungo.
NOTA: Si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale da 100 μL per trasferire i campioni in una nuova piastra da 100-200 μL in quanto può corrispondere direttamente alle colonne della piastra del campione.
- Generazione di cDNA
NOTA: Per i campioni conservati per un lungo periodo, evitare cicli multipli di congelamento/scongelamento. Eseguire la generazione di cDNA utilizzando un kit di cDNA seguendo le istruzioni del produttore.- In una provetta PCR da 100 o 200 μL posta su un blocco di ghiaccio/raffreddamento, aggiungere 2 μL di 5x miscela master RT (ad esempio, Perfect Real Time), 5 μL di RNA campione e 3 μL di ddH2O libero da RNasi per reazione (volume totale 10 μL).
- Posizionare il tubo PCR in un termociclatore impostato per funzionare a 37 °C per 15 minuti (trascrizione inversa), 85 °C per 5 s (inattivazione termica della trascrittasi inversa) e 4 °C per un tempo infinito.
NOTA: Elaborare immediatamente i campioni o conservare a 4 °C per un massimo di 24 ore fino all'uso o a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
2. Ottimizzazione del test ddPCR e del flusso di lavoro
NOTA: Ottimizzare i saggi prima/dopo la lettura delle goccioline. A seconda dei risultati, possono essere ottimizzati in qualsiasi punto del lavoro per ottenere risultati migliori. Di seguito sono riportati alcuni fattori comuni da considerare quando si ottimizzano gli esperimenti ddPCR.
- Convalidare i primer e le sonde ddPCR (Tabella 1).
NOTA: I primer ORF1ab e N sono stati adattati da China CDC17, il gene di controllo endogeno umano (RPP30) da Lu et al.18 e RBD2 da Nyaruaba et al.13. Tutti i primer e le sonde tranne RBD2 erano già stati testati e ottimizzati con ddPCR 7,8,18. - Eseguire i controlli di esempio del test ddPCR comprendenti un controllo positivo (un campione con tutti e quattro i target), No Template Control (NTC; Acqua priva di nucleasi o campione senza bersagli) e controllo estraibile/negativo (acido nucleico totale estratto da una cellula umana in coltura non infettiva o campioni aggregati da volontari sanitari).
NOTA: sono preferiti campioni di controllo standard con copie note di geni bersaglio. Tuttavia, in assenza di standard, utilizzare gli esempi disponibili per definire i controlli o la matrice dei campioni. Eseguire i controlli insieme agli esempi di test. - Ottimizzare la temperatura di ricottura (Figura 2D) inserendo un gradiente di temperatura compreso tra 55 °C e 65 °C nella fase di ricottura della PCR (fase 3.2).
NOTA: L'ottimizzazione della temperatura di ricottura aiuta a trovare la temperatura migliore in cui la separazione delle gocce è massima (facile identificazione del bersaglio) con pioggia minima. Dopo aver ottenuto i risultati, restringere l'intervallo di temperatura per una migliore ottimizzazione, ad esempio da 55 °C a 60 °C. - Ottimizzare le concentrazioni di primer e sonda. Se nei saggi non si ottiene una separazione ottimale tra goccioline positive e negative, variare le concentrazioni del primer (300-900 nM) e/o della sonda (100-400 nM).
NOTA: Abbassando le concentrazioni di primer/sonda si ottiene una minore ampiezza delle goccioline target e aumentandola aumenta anche l'ampiezza del bersaglio. Questo può essere utile nel multiplexing basato sull'ampiezza. - Testare la sensibilità analitica considerando diversi parametri tra cui, limite di bianco (LoB), limite di rilevazione (LoD), specificità e sensibilità utilizzando campioni standard e di prova, come preferito.
3. Flusso di lavoro ddPCR (Figura 1B) e sviluppo di saggi (Tabella 2)
NOTA: Come altri sistemi di rilevamento ddPCR, anche questo flusso di lavoro consiste in quattro fasi (Figura 1B), tra cui la preparazione della miscela di reazione, la generazione di gocce, l'amplificazione PCR e la lettura delle goccioline.
- Preparazione del mix di reazioni
NOTA: Preparare tutti i test in una stanza pulita separata e all'interno di una BSC. Osservare le precauzioni standard, incluso l'uso di guanti puliti, pipette pulite, acqua priva di nucleasi e disinfettanti. Aliquot reattivi in provette separate e conservati a -20 oC per evitare ripetuti cicli di congelamento. Preparare i saggi come mostrato nella tabella 2. Le soluzioni di primer e sonda devono essere conservate in alte concentrazioni di 100 μM. Le soluzioni di lavoro possono essere conservate in aliquote di 20-40 μM (diluite in acqua priva di nucleasi).- Passaggi comuni in tutti i test
NOTA: Prima di preparare i saggi, calcolare il volume totale di mastermix necessario in base al numero di campioni. Qui, ogni volume del componente mastermix è stato moltiplicato per 1,05 per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio.- Scongelare ed equilibrare i materiali di reazione a temperatura ambiente. Vortice i componenti delle reazioni brevemente (30 s) per garantire l'omogeneità, e brevemente centrifugare per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo.
- Preparare una miscela primer-sonda (PP) per saggio miscelando volumi di reazione specifici come dettagliato nella Tabella 2 dalle soluzioni di lavoro.
- Preparare il mastermix miscelando 11 μL (1x) di 2x ddPCR supermix per sonde (No dUTP), miscela PP (dipendente dal saggio come mostrato nella Tabella 2 dalla soluzione di lavoro) e acqua priva di nucleasi ad un volume finale di 19,8 μL per pozzetto. Distribuire il mastermix nei pozzetti di una piastra ddPCR a 96 pozzetti priva di nucleasi in base al numero di campioni.
NOTA: Per la piastra campione, assicurarsi che tutti gli 8 pozzetti in una colonna abbiano la soluzione. Se vengono utilizzati solo pochi pozzi, ad esempio 5 campioni, riempire gli altri 3 pozzetti con 22 μL di acqua priva di nucleasi o tampone di controllo ciascuno. - Per ottenere il volume finale della miscela di reazione (22 μL), aggiungere 2,2 μL di campione di cDNA per pozzetto contenente mastermix. Sigillare la piastra con un sigillante monouso per PCR.
NOTA: eseguire le aggiunte di esempio nella stanza designata. Includi i controlli, cioè positivo, NTC ed estrazione. Inoltre, se i campioni di RNA sono a bassa concentrazione, ridurre il volume di acqua nel mastermix e aumentare il volume del campione di conseguenza fino a 5,5 uL. - Una volta distribuita la miscela di reazione per pozzetto, vortice brevemente (15-30 s) e centrifugare (10-15 s) per raccogliere il contenuto sul fondo della piastra. Procedere per la generazione di goccioline.
- Passaggi comuni in tutti i test
- Generazione automatica di goccioline (Figura supplementare 1)
NOTA: È possibile utilizzare diversi generatori di gocce; tuttavia, questo studio è stato eseguito con un generatore automatico di goccioline (AutoDG). Per evitare la contaminazione dell'amplicone, assicurarsi che il generatore di gocce e i lettori dispongano di spazio dedicato in aree separate. Quando si caricano materiali di consumo, si consiglia di iniziare a caricare dal retro dello strumento lavorando verso la parte anteriore per evitare di spostare le mani sui materiali di consumo per evitare la contaminazione incrociata.- Procuratevi tutti i materiali di consumo necessari per configurare AutoDG, tra cui olio AutoDG per sonde, cartucce DG32, puntali per pipette, blocco di raffreddamento, piastra campione, piastra per gocce (nuova piastra ddPCR pulita) e un cestino per i rifiuti.
- Sul touch screen AutoDG, toccare Configura piastra campione e selezionare le colonne in cui si trovano i campioni sulla piastra di campionamento, quindi premere OK.
NOTA: lo schermo diventa giallo indicando LOAD dove devono essere caricati i materiali di consumo. - Aprire lo sportello AutoDG e caricare i materiali di consumo nelle rispettive posizioni.
NOTA: i rispettivi luoghi in cui i materiali di consumo devono essere caricati avranno un indicatore giallo che diventerà verde se i materiali di consumo sono caricati. Questo è simile al touchscreen. - Caricare la piastra di campionamento e la piastra di generazione delle gocce.
NOTA: La piastra di generazione delle gocce deve essere posizionata sul blocco di raffreddamento. Assicurati che il blocco di raffreddamento sia viola (pronto per l'uso) e non rosa (deve essere conservato in un congelatore fino a quando il colore non torna al viola). - Chiudere lo sportello AutoDG, assicurarsi che lo schermo sia verde (materiali di consumo caricati) e selezionare/assicurarsi che il tipo di olio sia Olio per sonde prima di premere Start Droplet Generation.
- Attendere che le goccioline vengano generate. Apri la porta una volta che lo schermo mostra Droplets Ready e rimuovi la piastra contenente le goccioline.
- Sigillare la piastra con una guarnizione perforabile utilizzando una sigillatrice a piastre impostata per funzionare a 185 oC per 5 s. Procedere all'amplificazione PCR.
NOTA: l'amplificazione della PCR deve essere iniziata entro 30 minuti dalla generazione delle goccioline.
- Amplificazione PCR
- Inserire la piastra a goccia sigillata in un termociclatore a pozzo profondo 96, impostare il volume del campione su 40 μL e la temperatura del coperchio su 105 °C.
- La PCR amplifica le goccioline utilizzando il programma: 95 °C per 10 min (attivazione enzimatica), 40 cicli di denaturazione a 94 °C per 30 s e 1 min di ricottura/estensione a 57 °C, disattivazione enzimatica a 98 °C per 10 minuti e passo di mantenimento a 4 °C indefinitamente. Dopo la PCR, leggere le goccioline o conservare a 4 °C per un massimo di 24 ore.
NOTA: utilizzare una velocità di rampa di 2 °C /s in tutti i passaggi, poiché le velocità di rampa possono differire per i diversi termociclatori. Tenere la piastra per almeno 30 minuti a 4 °C per consentire la stabilizzazione delle goccioline prima di leggere le goccioline.
- Lettura delle goccioline
- Trasferire la piastra termica a 96 pozzetti in un lettore di gocce e, su un computer collegato al lettore di gocce, aprire/avviare il software di accompagnamento.
- Nella modalità di configurazione, selezionare Nuovo e quindi fare doppio clic su qualsiasi pozzo per aprire la finestra di dialogo Editor pozzetti . Selezionare i pozzetti da leggere e scegliere Esperimento: ABS, Supermix: ddPCR Supermix per sonde (no dUTP), Tipo target 1: Ch1 Sconosciuto, Tipo Target 2: Ch2 Sconosciuto.
NOTA: è possibile selezionare Negativo, vuoto, NTC o positivo dal menu a discesa 1/2 tipo di destinazione per i campioni di controllo. - Assegnare i nomi di destinazione o campione in base alla disposizione della piastra e selezionare Applica. Al termine, selezionare OK e salvare il modello creato. Fare clic su Esegui e quando richiesto scegliere il colore giusto (FAM / HEX).
NOTA: si consiglia di adescare il sistema prima dell'esecuzione prima della prima esecuzione della giornata. Inoltre, verificare se tutte le spie nel lettore sono verdi e, in caso contrario, seguire l'applicazione consigliata sullo stato della descrizione comando. - Al termine dell'acquisizione dei dati, rimuovere la piastra dal lettore. Analizzare i dati in base alle esigenze.
NOTA: Poiché i risultati preliminari possono essere visualizzati sullo schermo, l'esecuzione dei campioni positivi nei primi pozzi può essere utilizzata per il controllo di qualità in tempo reale.
4. Analisi dei dati (figure supplementari 2 e 3)
- Controlla i dati di tutti i pozzi per il numero totale di goccioline. Se il conteggio delle goccioline è < 10.000, scartare i risultati e ripetere il test. Imposta un limite per accettare risultati positivi e negativi. Ad esempio, un conteggio delle goccioline fino a 3 o più goccioline positive può essere considerato come il limite per risultati positivi.
NOTA: i dati per tutti i test, inclusi i test simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex, vengono generati utilizzando il software allegato. Tuttavia, questo software è adatto solo per saggi simplex e duplex. Per i saggi multiplex di ordine elevato (target >3), è necessario un software esterno. - Saggi simplex e duplex
NOTA: il software esterno può anche analizzare dati simplex e duplex. Tuttavia, l'utilizzo del software di accompagnamento è più facile per questi test, quindi utilizzato in questo articolo.- Fare doppio clic sul file .qlp da analizzare per aprirlo e selezionare Analizza.
- Utilizzare gli strumenti soglia in Ampiezza 1D e Ampiezza 2D per distinguere tra goccioline positive e negative per ogni pozzetto nel canale corretto. I campioni NTC e di controllo positivo possono essere utilizzati come guida per l'impostazione della soglia.
NOTA: i risultati FAM sono visibili nel canale 1 mentre HEX/VIC nel canale 2. - Dopo l'impostazione della soglia, i risultati possono essere esportati come file .csv e ulteriormente analizzati in Excel o registrati leggendo direttamente nella finestra dei risultati.
- Mix di sonde triplex (Figura supplementare 2) e saggi quadruplex (Figura supplementare 2)
NOTA: prima di analizzare la miscela di sonde triplex e il test quadruplex, scaricare il software esterno. Fare riferimento ai requisiti minimi di sistema prima dell'installazione.- Aprire il file .qlp facendo clic destro su di esso e scegliendo Apri con il software esterno, oppure aprendo il software esterno e facendo clic sull'opzione Sfoglia per individuare il file .qlp nella cartella, oppure semplicemente trascinando il file .qlp e rilasciandolo sul software esterno già aperto.
- Nella scheda Editor piastre, selezionare i pozzetti da analizzare sul lato destro della scheda.
- Per la combinazione di sonde triplex, selezionare Quantificazione diretta (DQ) come tipo di esperimento, selezionare Probe Mix Triplex come informazioni sul test e immettere i nomi delle destinazioni di conseguenza, quindi fare clic su Applica.
- Per quadruplex, selezionare Quantificazione diretta (DQ) come tipo di esperimento, selezionare Multiplex di ampiezza come informazioni sul test e immettere i nomi delle destinazioni di conseguenza, quindi fare clic su Applica.
- Sul lato sinistro della scheda Ampiezza 2D, utilizzare Strumenti grafico per assegnare colori specifici a diversi cluster di destinazione seguendo i suggerimenti pop-up della finestra Seleziona per assegnare cluster .
NOTA: la modalità cluster preferita può essere applicata in base alle preferenze degli utenti. - Una volta assegnati i colori target, i dati di quantificazione possono essere letti nella finestra Dati pozzo in basso a destra. Esporta i dati in Excel/csv per ulteriori analisi utilizzando l'icona a tripla barra in alto a destra della tabella dei dati del pozzo.
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Representative Results
In uno studio proof-of-concept, le prestazioni analitiche dei test multiplex sono state testate su campioni clinici e di ricerca19. Le prestazioni dei test multiplex erano superiori a quelle di una RT-PCR19. Poiché un basso numero di goccioline può indicare un problema durante la generazione di goccioline, in questo articolo è stato impostato un limite di 10.000 goccioline per pozzetto basato su dati empirici.
Una buona separazione tra goccioline positive e negative con interferenze minime della pioggia può aiutare nell'analisi dei dati. Quindi, in un buon esperimento, l'ottimizzazione del saggio è la chiave19. Come si vede nei risultati dell'analisi del gradiente di temperatura nella Figura 2D, alte temperature di ricottura (ad esempio, 65 °C) non sono state in grado di distinguere chiaramente le goccioline positive dalle goccioline negative quando è stato eseguito un test duplex (N (FAM) e RPP30 (HEX)). Tuttavia, con una diminuzione della temperatura di ricottura, è stata raggiunta una separazione ottimale tra goccioline positive e negative. Una temperatura di 57 °C è risultata ottimale. Ciò può essere osservato anche in altri saggi19.
Utilizzando un sistema di rilevamento RT-ddPCR a due colori (FAM/HEX), è possibile rilevare uno (Figura 2A, B), due (Figura 2C), tre (Figura 3A) e quattro (Figura 3B) bersagli SARS-CoV-2 all'interno di un singolo campione. Durante l'analisi dei dati, il software di accompagnamento utilizzato per leggere le goccioline può analizzare solo saggi simplex e duplex, come mostrato nella Figura 2. Ciò significa che per i saggi multiplex di ordine superiore (target >3), è necessario utilizzare un software esterno per l'analisi dei dati, come mostrato nelle figure 3, S2 e S3. È importante notare inoltre che il software esterno può essere utilizzato anche per analizzare dati simplex e duplex. Per i dati simplex e duplex, l'analisi è abbastanza semplice in quanto i target sono separati come goccioline positive o negative nei rispettivi canali, come mostrato nella Figura 2. Un campione NTC può aiutare nella localizzazione di goccioline negative che a loro volta possono aiutare a impostare le soglie per l'analisi dei dati, come mostrato nella Figura 2A. Per il test duplex, l'analisi può essere effettuata in singoli canali (Figura 2B i,ii) o nell'ampiezza 2D (Figura 2B iii).
Per i test multiplex di ordine superiore, l'analisi dei dati non è semplice e l'attenzione dovrebbe essere focalizzata sull'assegnazione del target delle gocce. Dopo aver installato il software esterno, selezionare i pozzi da analizzare, selezionare il tipo di esperimento appropriato e assegnare i cluster di destinazione in base al tipo di esperimento, come mostrato nelle Figure S2 e S3. La finestra Apri per assegnare cluster aprirà una guida su come assegnare i cluster nei test multiplex superiori. Utilizzare gli strumenti grafici per assegnare fino a 8 cluster di gocce per il test del mix di sonde triplex (Figura 3A) e fino a 16 cluster di gocce per il test basato sull'ampiezza quadruplex (Figura 3B).
Dopo aver assegnato cluster e soglie, i dati di quantificazione per ciascun target sotto forma di copie/μL possono essere letti nella finestra dei dati del pozzo in basso a destra del software esterno. Questi dati possono essere utilizzati per stimare il numero di copie delle destinazioni nel campione iniziale. Ad esempio, se 2,2 μL del campione sono stati utilizzati in un volume finale di 22 μL e il software ha registrato 30,5 copie / μL per ORF1ab, c'erano 30,5 x 22 = 671 copie di ORF1ab nella miscela PCR. La miscela conteneva 2,2 μL di campione originale, quindi c'erano 671 copie di ORF1ab nel campione iniziale e 671/2,2 = 305 copie/μL di ORF1ab nel campione originale. Questo metodo può essere utilizzato per stimare la concentrazione di ciascun bersaglio in tutti i saggi.
| Bersaglio | Sequenza da 5' a 3' | Coloranti sonda | Lunghezza del prodotto (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Inoltrare | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM e BHQ1-3' 5'- HEX e BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Inverso | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sonda | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Inoltrare | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM e BHQ1-3' 5'- HEX e BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Inverso | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sonda | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Inoltrare | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX e BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Inverso | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sonda | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Inoltrare | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM e BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Inverso | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sonda | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabella 1: Sequenze di primer e sonda utilizzate per sviluppare i diversi saggi SARS-CoV-2.
| Concentrazione finale di primer-sonda per saggio in nMa | |||||
| Bersaglio | Primer/sonda | Simplessob | Duplexc | Sonda triplex mixd | Fourplex ampiezzae |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab ESAGONALE | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N ESAGONALE | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 ESAGONALE | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 ESAGONALE | |||||
| a In tutti i test, gli obiettivi possono essere scambiati in base alle preferenze degli utenti. Gli obiettivi utilizzati sono a scopo dimostrativo di questo esperimento. | |||||
| b È possibile rilevare un solo bersaglio alla volta nel saggio simplex nel canale FAM o HEX. RBD2 viene utilizzato per dimostrare i risultati del canale FAM mentre RPP30 viene utilizzato per il canale HEX. | |||||
| c Due target possono essere rilevati alla volta nel test duplex nel canale FAM e HEX. | |||||
| d Tre bersagli possono essere rilevati utilizzando entrambi i canali: il target 1 sarà rilevato in FAM (concentrazione di sonda 1×), il bersaglio due in HEX (concentrazione di sonda 1×) e il target 3 in entrambi i canali (una miscela di concentrazione di sonda FAM 0,5× e 0,5× per costituire l'1× finale). | |||||
| e Due bersagli sono rilevati in ciascun canale (FAM e HEX) con concentrazione di sonda 1× e O.5× in ciascun canale. | |||||
Tabella 2: Concentrazione finale di diverse coppie di primer e sonda per test.
Figura 1: Elaborazione dei campioni e flusso di lavoro della PCR digitale delle gocce. (A) Il flusso di lavoro di elaborazione dei campioni include la raccolta e il trasporto dei campioni in una struttura BSL-2, l'inattivazione, l'estrazione e la generazione di cDNA. (B) Il flusso di lavoro della PCR digitale a goccia inizia con la preparazione del mastermix, il caricamento del mastermix in una piastra ddPCR e l'aggiunta di campioni, la generazione di goccioline, l'amplificazione dei bersagli all'interno delle goccioline mediante PCR e infine la lettura delle goccioline amplificate utilizzando un lettore di gocce. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati dei saggi simplex e duplex, inclusa l'ottimizzazione della temperatura di ricottura . (A) Risultati del test simplex quando un singolo target (RBD2) è stato marcato FAM. (B) Il test simplex risulta quando un singolo target (RPP30) è stato marcato HEX. (C) Risultato del saggio duplex di due target in 1D e 2D (iii) Canali dopo che N (i) è stato marcato FAM e RPP30 (ii) è stato marcato HEX. (D) Gradiente di temperatura di ricottura (da 65 °C a 55 °C) risultati di un saggio duplex marcato con ORF1ab (FAM) e RPP30 (HEX). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati del mix di sonde triplex e del test multiplex basato sull'ampiezza quadruplex. (A) Risultati del test del mix di sonde triplex quando tre target sono stati etichettati con i seguenti rapporti di FAM:HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) e RPP30 (0:1). (B) Risultati del test basato sull'ampiezza Quadruplex dopo che quattro target sono stati etichettati con i seguenti rapporti di FAM:HEX; RBD2(0,5:0), N (1:0), RPP30 (0:0,5) e ORF1ab (0:1). 1 e 0,5 sono concentrazioni di sonda 250 nM e 125 nM, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Generazione di goccioline utilizzando un generatore automatico di gocce. (A) Materiali di consumo necessari per configurare l'AutoDG. (B) Sul touch screen AutoDG, toccare Configura piastra campione e selezionare le colonne in cui si trovano i campioni sulla piastra di campionamento, quindi premere OK. (C) Una volta selezionato, lo schermo diventa giallo indicando dove devono essere caricati i materiali di consumo. (D) Aprire lo sportello AutoDG e caricare i materiali di consumo nei rispettivi luoghi. Carica i materiali di consumo dal retro lavorando verso la parte anteriore. Assicurati che ogni volta che viene aggiunto un materiale di consumo, la luce passi da gialla a verde in quella posizione. (E) Assicurarsi che il tipo di olio utilizzato sia olio per sonde. (F) Chiudere lo sportello AutoDG e assicurarsi che tutti i reagenti siano posizionati controllando se il touch screen AutoDG è verde. (G) Premere START Droplet Generation per generare goccioline. (H) Al termine della generazione delle gocce, aprire AutoDG e rimuovere la piastra delle gocce. (I) Sigillare la piastra a goccia utilizzando un sigillo termico perforabile. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Fasi dell'analisi dei risultati del test ddPCR multiplex basato sull'ampiezza utilizzando un software esterno. (A) Installare il software esterno su un computer. (B) Aprire il file .qlp facendo clic destro su di esso e scegliendo Apri con il software esterno installato o aprendo il software esterno e facendo clic sull'opzione Sfoglia per individuare il file nella cartella. In alternativa, è possibile trascinare il file .qlp e rilasciarlo il software esterno aperto per aprirlo. (C) Una volta aperto, sul lato destro della scheda Editor piastre , scegliere probe mix triplex dal menu a discesa e assegnare le informazioni di destinazione di conseguenza, quindi fare clic su Applica. (D) Sul lato sinistro della scheda Ampiezza 2D, utilizzare Strumenti grafico per assegnare colori specifici a target diversi per il rilevamento e la quantificazione. Una volta identificati i target dei cluster di droplet, i risultati della quantificazione possono essere visualizzati nella finestra Dati pozzo nella stessa scheda di ampiezza 2D. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Fasi dell'analisi dei risultati del test ddPCR multiplex basato sull'ampiezza utilizzando un software esterno. (A) Installare il software esterno su un computer. (B) Aprire il file .qlp facendo clic destro su di esso e scegliendo Apri con il software esterno installato o aprendo il software esterno e facendo clic sull'opzione Sfoglia per individuare il file nella cartella. In alternativa, è possibile trascinare il file .qlp e rilasciarlo nel software esterno già aperto per aprirlo. (C) Una volta aperto, sul lato destro della scheda Editor piastre , scegliere multiplex di ampiezza dal menu a discesa e assegnare le informazioni di destinazione di conseguenza, quindi fare clic su Applica. (D) Sul lato sinistro della scheda Ampiezza 2D, utilizzare Strumenti grafico per assegnare colori specifici a target diversi per il rilevamento e la quantificazione. Una volta identificati i target dei cluster di droplet, i risultati della quantificazione possono essere visualizzati nella finestra Dati pozzo nella stessa scheda di ampiezza 2D. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Sono disponibili poche risorse su come sviluppare saggi RT-ddPCR per il rilevamento di SARS-CoV-2. Sebbene non utilizzati in questo articolo, i campioni standard con copie note possono essere utilizzati per sviluppare e ottimizzare i saggi. In questo lavoro, tuttavia, i campioni di SARS-CoV-2 cresciuti in cellule Vero-E6 sono stati inseriti in uno sfondo di RNA genomico umano e utilizzati come campioni standard per sviluppare i saggi. Sequenze di primer e sonde adeguate sono essenziali quando si sviluppano saggi. Poiché la maggior parte del lavoro preliminare su SARS-CoV-2 RT-ddPCR ha utilizzato il primer e le sonde del CDC cinese che hanno preso di mira i geni ORF1ab e N, li hanno trovati adatti per essere inclusi in questo lavoro 7,8,9,10,11. La specificità analitica e la sensibilità di questi primer sono state confrontate anche utilizzando ddPCR nel precedente lavoro7. I primer RBD2 e la sonda13 sono stati sviluppati internamente e trovati adatti per RT-ddPCR. Poiché i test possono essere utilizzati per diverse applicazioni, compresa la diagnosi, il gene umano specifico della subunità p30 della proteina P della ribonucleasi p30 (RPP30) è stato incluso in tutti i test multiplex. Questi geni possono essere utilizzati come controllo endogeno umano per esperimenti diagnostici. Tuttavia, nel caso di campionamento ambientale o altre ricerche che non necessitano del gene umano di riferimento, si può alternare questo bersaglio con un altro bersaglio SARS-CoV-2.
In tutti i saggi, è importante includere controlli per convalidare saggi e dati sperimentali. Questi controlli possono includere: NTC (nucleasi free water as sample) per aiutare a impostare le soglie e localizzare il cluster di goccioline negativo; controllo positivo (campione con tutti i bersagli SARS-CoV-2, incluso il gene di riferimento umano) per valutare il fallimento del reagente, l'integrità del primer e della sonda e il rilevamento/localizzazione sostanziale della trascrizione inversa di bersagli goccioline positivi; e controlli di estrazione (campioni umani raggruppati da volontari sani o acido nucleico totale estratto da una cellula umana coltivata non infettiva) per rilevare il fallimento o il successo della fase di estrazione.
La maggior parte dei sistemi ddPCR, incluso il sistema QX200, ha un intervallo dinamico ristretto da 1 a 120.000 copie/20 μL di reazione. Quando si rilevano campioni non noti, la concentrazione target nel campione di partenza è spesso sconosciuta e questo può comportare sfide quando si quantificano campioni altamente concentrati. Per ovviare a questo, si raccomanda che quando si quantificano campioni sospettati di contenere elevate quantità di molecole bersaglio (come la coltura cellulare), si dovrebbe pianificare di ridurre il campione di partenza di conseguenza. Nel caso in cui il numero di copie / genoma target sia sconosciuto, si dovrebbe determinare la quantità iniziale ottimale attraverso una serie di quattro dieci volte la diluizione seriale di ciascun campione nell'intervallo digitale previsto. Analizzando questi quattro punti, si garantisce che uno dei punti dati rientri nell'intervallo digitale ottimale.
L'uso di primer elevati e bassa concentrazione di sonda è un requisito della maggior parte degli esperimenti ddPCR simplex e duplex. Questa differenza di concentrazione aumenta la distanza di separazione dell'ampiezza tra i cluster di goccioline positivi e negativi, rendendo quindi facile l'analisi dei dati. Tuttavia, quando si sviluppano saggi multiplex di ordine superiore, i cambiamenti in queste concentrazioni possono portare a cambiamenti nella posizione dei bersagli di goccioline positivi, come mostrato nelle Figure 3 e 4. Di conseguenza, un'opzione di ottimizzazione del saggio oltre alla temperatura di ricottura sarebbe quella di modificare la concentrazione target del primer o della sonda per distinguere le goccioline. Questo fenomeno è stato usato e spiegato primadi 14,15,16.
Nonostante le prestazioni del test, questo lavoro è un flusso di lavoro RT-ddPCR in due fasi. La fase di trascrizione inversa extra prima della ddPCR, dà spazio alla contaminazione dei campioni. Tuttavia, se vengono utilizzate tecniche di gestione dei campioni attente e corrette, questo non sarà un problema. Positivamente, il DNA è noto per essere più stabile dell'RNA. La conversione dell'RNA in cDNA può prolungare la durata di conservazione del campione durante la conservazione rispetto all'RNA. Un esperimento RT-ddPCR in due fasi è anche più economico di un esperimento RT-ddPCR in un'unica fase.
Rispetto a RT-qPCR, RT-ddPCR è costoso. Pertanto, è necessario prendere in considerazione l'esecuzione di RT-ddPCR. Ad esempio, durante la diagnosi, si può usare RT-ddPCR nel caso in cui i loro campioni abbiano obiettivi bassi e abbondanti. Tuttavia, esiste la possibilità che i costi degli strumenti e dei reagenti dPCR diminuiscano presto e la tecnica venga adattata in molti laboratori, come è successo in passato con PCR e qPCR regolari. Quindi, è importante impostare protocolli come questo per gli utenti attuali e futuri di dPCR. In conclusione, i saggi sviluppati danno spazio ai potenziali utenti per variare gli obiettivi in base alle loro applicazioni. Il multiplexing garantirà che sia possibile rilevare in modo efficiente molti bersagli all'interno di un singolo campione in una singola reazione. Finora, questo potrebbe essere il primo protocollo che fornisce un dettaglio completo su come utilizzare il sistema AutoDG, incluso il software esterno nel rilevamento di SARS-CoV-2. È ancora necessario lavorare ulteriormente sull'ottimizzazione del test per ottenere una migliore separazione nel test quadruplex. L'uso di standard contribuirà anche a migliorare i saggi sviluppati.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da Megaproject of Infectious Disease Control del Ministero della Salute della Cina, numero di sovvenzione 2017ZX10302301-005 e Sino-Africa Joint Research Center, numero di sovvenzione SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
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