Summary
Dit werk vat stappen samen voor het ontwikkelen van verschillende testen voor SARS-CoV-2-detectie met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. De stappen zijn uitgebreid en er zijn opmerkingen opgenomen over hoe de assays en experimentprestaties kunnen worden verbeterd. Deze testen kunnen worden gebruikt voor meerdere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-toepassingen.
Abstract
Diagnose van de aanhoudende SARS-CoV-2-pandemie is een prioriteit voor alle landen over de hele wereld. Momenteel is reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) de gouden standaard voor SARS-CoV-2-diagnose omdat er geen permanente oplossing beschikbaar is. Hoe effectief deze techniek ook is, er is onderzoek naar voren gekomen dat de beperkingen ervan in detectie en diagnose aantoont, vooral als het gaat om lage overvloedige doelen. Daarentegen is aangetoond dat droplet digital PCR (ddPCR), een recente opkomende technologie met superieure voordelen ten opzichte van qPCR, de uitdagingen van RT-qPCR bij de diagnose van SARS-CoV-2 uit laagovervloedige doelmonsters overwint. In dit artikel worden de mogelijkheden van RT-ddPCR verder uitgebreid door stappen te laten zien voor het ontwikkelen van simplex-, duplex-, triplex-sondemix- en quadruplex-assays met behulp van een tweekleurendetectiesysteem. Met behulp van primers en probes gericht op specifieke locaties van het SARS-CoV-2-genoom (N, ORF1ab, RPP30 en RBD2), wordt aangetoond dat de ontwikkeling van deze testen mogelijk is. Daarnaast worden stap voor stap gedetailleerde protocollen, notities en suggesties gegeven over hoe de testworkflow te verbeteren en gegevens te analyseren. Door deze workflow in toekomstige werkzaamheden aan te passen, wordt ervoor gezorgd dat het maximale aantal doelen gevoelig kan worden gedetecteerd in een kleine steekproef, waardoor de kosten en de monsterdoorvoer aanzienlijk worden verbeterd.
Introduction
Polymerasekettingreactie (PCR), een algemeen erkende techniek, heeft sinds zijn komst verschillende transformaties ondergaan om een krachtige techniek te worden die antwoorden kan bieden op nucleïnezuuronderzoek. Deze transformaties zijn een constante verbetering van de oude techniek. Deze transformaties zijn samen te vatten in drie generaties1. De eerste generatie is conventionele PCR die afhankelijk is van gel-elektroforese om versterkte doelen te kwantificeren en te detecteren. De tweede generatie is kwantitatieve real-time PCR (qPCR) die monsters in realtime kan detecteren en vertrouwt op een standaardcurve om doelen in een monster direct te kwantificeren. De derde generatie, digitale PCR (dPCR), kan zowel detectie als absolute kwantificering van nucleïnezuurdoelen uitvoeren zonder dat een standaardcurve nodig is. dPCR is ook verder verbeterd van reactiekamers die worden gescheiden door de putten van een muur in emulsies van olie, water en stabiliserende chemicaliën in dezelfde put als te zien in op druppels gebaseerde digitale PCR2. In droplet digital PCR (ddPCR) wordt een monster verdeeld in duizenden druppels ter grootte van nanoliter met individuele doelen die later zullen worden gekwantificeerd met behulp van Poisson-statistieken 2,3,4. Deze techniek geeft ddPCR een voorsprong bij het kwantificeren van lage abundante doelen in vergelijking met de andere generaties PCR.
Onlangs hebben meerdere toepassingen de superioriteit van ddPCR ten opzichte van de veelgebruikte qPCR benadrukt bij het detecteren en kwantificeren van lage overvloedige doelen 1,5,6. SARS-CoV-2 is geen uitzondering op deze toepassingen 7,8,9,10,11,12. Sinds de uitbraak van SARS-CoV-2 werken wetenschappers op alle fronten aan oplossingen om het virus te diagnosticeren en efficiënt op te sporen. De huidige gouden standaard moet nog steeds qPCR13 zijn. Van RT-ddPCR is echter aangetoond dat het nauwkeuriger is in het detecteren van lage overvloedige SARS-CoV-2-doelen uit zowel omgevings- als klinische monsters in vergelijking met RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De meeste van de SARS-CoV-2 ddPCR gepubliceerde werken zijn afhankelijk van simplex assays met de multiplex assays afhankelijk van commerciële assays. Daarom moet er meer worden gedaan om uit te leggen hoe multiplex RT-dPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie kunnen worden ontwikkeld.
In een goed testontwerp kan multiplexing worden gebruikt om kosten te besparen, de monsterdoorvoer te verhogen en het aantal doelen te maximaliseren dat gevoelig kan worden gedetecteerd in een klein monster. Bij multiplexing met ddPCR moet men rekening houden met het aantal fluoroforen dat in een bepaald systeem kan worden gedetecteerd. Sommige ddPCR-platforms kunnen maximaal drie kanalen ondersteunen, terwijl andere slechts twee kanalen ondersteunen. Daarom moet men bij multiplexing met twee kanalen verschillende benaderingen gebruiken, waaronder multiplexing van hogere orde om meer dan twee doelente detecteren 14,15,16. In dit werk wordt een tweekleurig ddPCR-detectiesysteem gebruikt om stappen te laten zien voor het ontwikkelen van verschillende SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays die kunnen worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring
Wuhan Institute of Virology (WHIOV) is een van de laboratoria en instituten die zijn goedgekeurd door China CDC van de stad Wuhan om onderzoek te doen naar SARS-CoV-2 en COVID-19 te detecteren uit klinische monsters. Onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe diagnostische technieken voor COVID-19 met behulp van klinische monsters is ook goedgekeurd door de ethische commissie van het Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Workflow voor monsterverwerking (figuur 1A)
OPMERKING: In het hele protocol is het belangrijk om aparte ruimtes te gebruiken met speciale pipetten voor monsterbehandeling (extractie en opslag), reagens/mastermix-bereiding en -opslag, reactiemixvoorbereiding (monster plus mastermix) en detectie, om kruisbesmetting te voorkomen. De te ontwikkelen assays kunnen worden gebruikt bij de detectie van klinische monsters of onderzoeksmonsters. Alle monsters moeten worden behandeld alsof ze infectieuze agentia kunnen overbrengen, zelfs bij gebruik van veilige laboratoriumprocedures. De monsterverwerkingsstappen moeten worden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) volgens strikte BSL-2-regels, inclusief het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
- Voorbeeld inactivatie
- Neem 1 ml SARS-CoV-2-monster mee naar een BSL-2-laboratorium. Warmte-inactiveer monsters bij 65 °C gedurende 30 min.
OPMERKING: Monsters kunnen afkomstig zijn van verschillende bronnen, daarom moet men ervoor zorgen dat het te inactiveren volume voldoende is om latere RNA-extractie te garanderen. De meeste extractiekits vereisen een klein monstervolume van maximaal 200 μL, vandaar dat een monstervolume van ongeveer 1 ml voldoende zou zijn voor inactivering. Oppervlakteactieve stoffen, kits en lysisbuffers kunnen ook worden gebruikt voor directe inactivatie en RNA-extractie volgens de eigen SOP van de laboratoria. - Neem monsters mee naar een bioveiligheidskast (BSC) en laat ze 10 minuten op kamertemperatuur staan om potentiële aerosolen te laten bezinken. Bewaar monsters in 4 °C gedurende maximaal 24 uur als ze niet onmiddellijk worden verwerkt.
OPMERKING: Er is geen specifieke container vereist voor monsteropslag. Monsters kunnen worden opgeslagen in de buizen of containers die tijdens de inactivering worden gebruikt. Voor dit werk werden de meeste monsters opgeslagen in virale transportmedia (VTM) buizen of 1,5 ml buizen.
- Neem 1 ml SARS-CoV-2-monster mee naar een BSL-2-laboratorium. Warmte-inactiveer monsters bij 65 °C gedurende 30 min.
- RNA-extractie
OPMERKING: Veel RNA-extractie-instrumenten en -kits met specifieke protocollen zijn beschikbaar voor gebruik voor gebruik. Hier wordt een geautomatiseerde procedure volgens de instructies van de fabrikant gepresenteerd.- Haal de voorgevulde 96-diepe putopeningplaat eruit; Keer het zachtjes ondersteboven om de magnetische kralen te mengen. Schud de plaat na het mengen voorzichtig op een plat oppervlak om reagens en magnetische kralen die zich op de muur kunnen bevinden naar de bodem van de plaat te concentreren.
- Scheur de afdichtingsfilm van aluminiumfolie voorzichtig af om trillingen van de plaat en morsen van vloeistof te voorkomen. Voeg 20 μL proteïnase K en 200 μL van het monster per put toe in rijen 2 en 8 van de 96-putplaat. Plaats vervolgens de 96-putplaat op de basis van het 32-kanaals automatische nucleïnezuurextractie-instrument.
OPMERKING: Voer het programma uit op de computer binnen 1 uur na het toevoegen van het voorbeeld. - Plaats de magnetische staafhuls in de kaartsleuf van het 32-kanaals automatische nucleïnezuurextractie-instrument. Selecteer het programma GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (snelle versie) en voer het uit.
- Na voltooiing van de extractie neemt u de nucleïnezuurmonsters in rijen 6 en 12 (ongeveer 100 μL / monster) en verdeelt u deze in een schone nucleasevrije 96-putplaat. Bewaar de monsters bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur tot gebruik of bij -20 °C gedurende langere tijd.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een meerkanaalspipet van 100 μL te gebruiken om monsters over te brengen naar een nieuwe plaat van 100-200 μL, omdat deze rechtstreeks overeenkomt met de kolommen van de monsterplaat.
- cDNA generatie
OPMERKING: Voor monsters die lange tijd zijn opgeslagen, vermijdt u meerdere vries-/dooicycli. Voer cDNA-generatie uit met behulp van een cDNA-kit volgens de instructies van de fabrikant.- Voeg in een PCR-buis van 100 of 200 μL op ijs/koelblok 2 μL 5x RT-mastermix (bijv. Perfect Real Time), 5 μL monster-RNA en 3 μL RNase-vrije ddH2O per reactie (totaal volume 10 μL) toe.
- Plaats de PCR-buis in een thermische cycler die is ingesteld op 37 °C gedurende 15 minuten (omgekeerde transcriptie), 85 °C gedurende 5 s (warmte-inactivatie van reverse transcriptase) en 4 °C gedurende een oneindige tijd.
OPMERKING: Verwerk de monsters onmiddellijk of bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur tot gebruik of bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
2. Optimalisatie van ddPCR assay en workflow
OPMERKING: Optimaliseer de testen voor/na het lezen van de druppels. Afhankelijk van de resultaten kunnen ze op elk moment van het werk worden geoptimaliseerd om betere resultaten te bereiken. Hieronder vindt u enkele veelvoorkomende factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het optimaliseren van ddPCR-experimenten.
- Valideer de ddPCR primers en probes (tabel 1).
OPMERKING: De primers ORF1ab en N zijn aangepast van China CDC17, het menselijke endogene controlegen (RPP30) van Lu et al.18 en RBD2 van Nyaruaba et al.13. Alle primers en probes behalve RBD2 waren al ddPCR getest en geoptimaliseerd 7,8,18. - Voer de ddPCR-testmonsterbesturingselementen uit die bestaan uit een positieve controle (een voorbeeld met alle vier de doelen), Geen sjabloonbesturingselement (NTC; Nucleasevrij water of monster zonder doelen) en extractie/negatieve controle (totaal nucleïnezuur geëxtraheerd uit een niet-infectieuze gekweekte menselijke cel of gepoolde monsters van gezondheidsvrijwilligers).
OPMERKING: Standaard controlemonsters met bekende kopieën van doelgenen hebben de voorkeur. Als er echter geen normen zijn, gebruikt u de beschikbare steekproeven om hun controles of monstermatrix te definiëren. Voer de besturingselementen samen met testvoorbeelden uit. - Optimaliseer de gloeitemperatuur (figuur 2D) door een temperatuurgradiënt van 55 °C tot 65 °C in de gloeistap van PCR in te brengen (stap 3.2).
OPMERKING: Optimalisatie van de gloeitemperatuur helpt bij het vinden van de beste temperatuur waarbij de druppelscheiding maximaal is (eenvoudige doelidentificatie) met minimale regen. Na het verkrijgen van de resultaten, verklein het temperatuurbereik voor een betere optimalisatie, bijvoorbeeld 55 °C tot 60 °C. - Optimaliseer de primer- en sondeconcentraties. Als in de testen geen optimale scheiding tussen positieve en negatieve druppels wordt bereikt, varieer dan de primer (300-900 nM) en/of probe (100-400 nM) concentraties.
OPMERKING: Het verlagen van primer/probe-concentraties resulteert in een lagere doeldruppelamplitude en het verhogen ervan verhoogt ook de amplitude van het doelwit. Dit kan nuttig zijn bij multiplexing op basis van amplitude. - Test de analytische gevoeligheid rekening houdend met verschillende parameters, waaronder de limiet van blanco (LoB), detectiegrens (LoD), specificiteit en gevoeligheid met behulp van zowel standaard- als testmonsters, zoals gewenst.
3. ddPCR-workflow (figuur 1B) en testontwikkeling (tabel 2)
OPMERKING: Net als andere ddPCR-detectiesystemen bestaat deze workflow ook uit vier stappen (figuur 1B), waaronder reactiemixvoorbereiding, druppelgeneratie, PCR-versterking en druppellezing.
- Voorbereiding van de reactiemix
OPMERKING: Bereid alle testen voor in een schone aparte ruimte en in een BSC. Neem de standaardvoorzorgsmaatregelen in acht, waaronder het gebruik van schone handschoenen, schone pipetten, nucleasevrij water en ontsmettingsmiddelen. Aliquote reagentia in afzonderlijke buizen en bewaren bij -20 oC om herhaalde vriesontdooicycli te voorkomen. Bereid assays voor zoals aangegeven in tabel 2. Primer- en sonde-stamoplossingen moeten in hoge concentraties van 100 μM worden bewaard. De werkoplossingen kunnen worden opgeslagen in aliquots van 20-40 μM (verdund in nucleasevrij water).- Gemeenschappelijke stappen in alle assays
OPMERKING: Bereken voordat u de assays voorbereidt het totale benodigde volume mastermix op basis van het aantal monsters. Hier werd elk mastermix-componentvolume vermenigvuldigd met 1,05 om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten.- Ontdooi en balanceer reactiematerialen tot kamertemperatuur. Vortex de reactiecomponenten kort (30 s) om homogeniteit te garanderen en kort centrifugeren om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen.
- Bereid per test een primer-probe (PP) mengsel voor door specifieke reactievolumes zoals beschreven in tabel 2 van de werkoplossingen te mengen.
- Bereid de mastermix door 11 μL (1x) 2x ddPCR supermix voor sondes (Geen dUTP), PP-mix (afhankelijk van de test zoals weergegeven in tabel 2 van de werkoplossing) en nucleasevrij water te mengen tot een eindvolume van 19,8 μL per put. Verdeel de mastermix in de putjes van een nucleasevrije 96-well ddPCR-plaat op basis van het aantal monsters.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle 8 putjes in één kolom de oplossing hebben. Als slechts een paar putten worden gebruikt, bijvoorbeeld 5 monsters, vul dan de andere 3 putten met elk 22 μL nucleasevrij water of controlebuffer. - Om het uiteindelijke reactiemengselvolume (22 μL) te krijgen, voegt u 2,2 μL cDNA-monster toe per put met mastermix. Sluit de plaat af met een wegwerp PCR-plaatsealer.
OPMERKING: Voer de monstertoevoegingen uit in de daarvoor bestemde ruimte. Neem de controles op, d.w.z. positief, NTC en extractie. Bovendien, als de RNA-monsters een lage concentratie hebben, vermindert u het volume water in de mastermix en verhoogt u het monstervolume dienovereenkomstig tot 5,5 uL. - Zodra het reactiemengsel per put is verdeeld, vortex kort (15-30 s) en centrifugeer (10-15 s) om de inhoud aan de onderkant van de plaat te verzamelen. Ga verder met het genereren van druppels.
- Gemeenschappelijke stappen in alle assays
- Geautomatiseerde druppelgeneratie (aanvullende figuur 1)
OPMERKING: Verschillende druppelgeneratoren kunnen worden gebruikt; deze studie werd echter uitgevoerd met een geautomatiseerde druppelgenerator (AutoDG). Om ampliconbesmetting te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de druppelgenerator en lezers speciale ruimte hebben in afzonderlijke gebieden. Bij het laden van verbruiksartikelen wordt aanbevolen om te beginnen met laden vanaf de achterkant van het instrument en naar voren toe te werken om te voorkomen dat de handen over de verbruiksartikelen bewegen om kruisbesmetting te voorkomen.- Verkrijg alle verbruiksartikelen die nodig zijn om de AutoDG in te stellen, inclusief AutoDG-olie voor sondes, DG32-cartridges, pipetpunten, koelblok, monsterplaat, druppelplaat (nieuwe schone ddPCR-plaat) en een afvalbak.
- Tik op het AutoDG-aanraakscherm op Monsterplaat configureren en selecteer kolommen waar monsters zich op de monsterplaat bevinden en druk op OK.
OPMERKING: Het scherm wordt geel en geeft aan te geven dat er verbruiksartikelen moeten worden geladen. - Open de AutoDG-deur en laad verbruiksartikelen op hun respectievelijke plaatsen.
OPMERKING: De respectievelijke plaatsen waar verbruiksartikelen moeten worden geladen, hebben een gele indicator die later groen wordt als de verbruiksartikelen worden geladen. Dit is vergelijkbaar met het touchscreen. - Laad de monsterplaat en druppelgeneratieplaat.
OPMERKING: De druppelgeneratieplaat moet op het koelblok worden geplaatst. Zorg ervoor dat het koelblok paars is (klaar voor gebruik) en niet roze (moet in een vriezer worden bewaard totdat de kleur weer paars wordt). - Sluit de AutoDG-klep, zorg ervoor dat het scherm groen is (verbruiksartikelen geladen) en selecteer/zorg ervoor dat het olietype Olie voor sondes is voordat u op Start Droplet Generation drukt.
- Wacht tot de druppels zijn gegenereerd. Open de deur zodra het scherm Droplets Ready toont en verwijder de plaat met de druppels.
- Sluit de plaat af met een doorboorbare folieafdichting met behulp van een plaatsealer die is ingesteld om gedurende 5 s op 185 oC te draaien. Ga verder met PCR-versterking.
OPMERKING: PCR-versterking moet binnen 30 minuten na het genereren van druppels worden gestart.
- PCR-versterking
- Plaats de verzegelde druppelplaat in een 96-diepe bronthermische cycler, stel het monstervolume in op 40 μL en de temperatuur van het deksel op 105 °C.
- PCR versterkt de druppels met behulp van het programma: 95 °C gedurende 10 minuten (enzymactivering), 40 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s en 1 min gloeien / extensie bij 57 ° C, enzymdeactivering bij 98 ° C gedurende 10 minuten en stap voor onbepaalde tijd bij 4 °C vasthouden. Lees na de PCR de druppels af of bewaar ze maximaal 24 uur bij 4 °C.
OPMERKING: Gebruik een hellingsnelheid van 2 °C /s bij alle stappen, omdat de hellingsnelheden kunnen verschillen voor verschillende thermische cyclers. Houd de plaat ten minste 30 minuten bij 4 °C om druppelstabilisatie mogelijk te maken voordat u de druppels afleest.
- Druppel lezen
- Breng de thermisch gefietste 96-well plaat over in een druppellezer en open / start op een computer die is aangesloten op de druppellezer de bijbehorende software.
- Selecteer in de installatiemodus Nieuw en dubbelklik vervolgens op een put om het dialoogvenster Broneditor te openen. Selecteer de te lezen putjes en kies Experiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix for Probes (geen dUTP), Target 1 Type: Ch1 Unknown, Target 2 Type: Ch2 Unknown.
OPMERKING: Negatief, leeg, NTC of positief kan worden geselecteerd in het vervolgkeuzemenu van het doeltype 1/2 voor de controlemonsters. - Wijs de doel- of voorbeeldnamen toe op basis van de plaatindeling en selecteer Toepassen. Als u klaar bent, selecteert u OK en slaat u de gemaakte sjabloon op. Klik op Uitvoeren en kies desgevraagd de juiste kleur (FAM/HEX).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het systeem voor de eerste keer dat u het uitvoert te primen voordat u het uitvoert. Controleer ook of alle lampjes in de lezer groen zijn en zo niet, volg dan de aanbevolen toepassing op de status van de tooltip. - Nadat de gegevensverzameling is voltooid, verwijdert u de plaat uit de lezer. Analyseer gegevens indien nodig.
OPMERKING: Aangezien voorlopige resultaten op het scherm te zien zijn, kan het uitvoeren van de positieve monsters in de eerste putten worden gebruikt voor realtime kwaliteitscontrole.
4. Gegevensanalyse (aanvullende figuren 2 en 3)
- Controleer de gegevens van alle putten voor het totale aantal druppels. Als het aantal druppels < 10.000 is, gooit u de resultaten weg en herhaalt u de test. Stel een cut-off in om positieve en negatieve resultaten te accepteren. Een druppeltelling van maximaal 3 of meer positieve druppels kan bijvoorbeeld worden beschouwd als de afsnijding voor positieve resultaten.
OPMERKING: Gegevens voor alle assays, inclusief simplex, duplex, triplex probe mix en quadruplex assays worden gegenereerd met behulp van de bijbehorende software. Deze software is echter alleen geschikt voor simplex en duplex assays. Voor high order multiplex assays (>3 targets) is externe software nodig. - Simplex en duplex assays
OPMERKING: De externe software kan ook simplex- en duplexgegevens analyseren. Het gebruik van de bijbehorende software is echter gemakkelijker voor deze testen, vandaar dat deze in dit artikel worden gebruikt.- Dubbelklik op het te analyseren .qlp-bestand om het te openen en selecteer Analyseren.
- Gebruik de drempelgereedschappen in de 1D-amplitude en 2D-amplitude om onderscheid te maken tussen positieve en negatieve druppels voor elke put in het juiste kanaal. De NTC- en positieve controlemonsters kunnen worden gebruikt als leidraad voor het instellen van drempels.
OPMERKING: FAM-resultaten zijn te zien in kanaal 1 en HEX/VIC in kanaal 2. - Na het instellen van de drempel kunnen de resultaten worden geëxporteerd als een .csv bestand en verder worden geanalyseerd in Excel of worden vastgelegd door rechtstreeks in het resultatenvenster te lezen.
- Triplex probe mix (aanvullende figuur 2) en quadruplex assays (aanvullende figuur 2)
OPMERKING: Voordat u de triplex probe mix en de quadruplex assay analyseert, downloadt u de externe software. Raadpleeg de minimale systeemvereisten voordat u installeert.- Open het .qlp-bestand door er met de rechtermuisknop op te klikken en Openen met de externe software te kiezen, of door de externe software te openen en op de optie Bladeren te klikken om het .qlp-bestand in uw map te zoeken, of door gewoon het .qlp-bestand te slepen en neer te zetten op de reeds geopende externe software.
- Selecteer op het tabblad plaateditor de putten die u wilt analyseren aan de rechterkant van het tabblad.
- Voor triplex probe mix selecteert u Direct Quantification (DQ) als experimenttype, selecteert u Probe Mix Triplex als assay-informatie en voert u dienovereenkomstig doelnamen in en klikt u vervolgens op Toepassen.
- Voor quadruplex selecteert u Direct Quantification (DQ) als experimenttype, selecteert u Amplitude Multiplex als testinformatie en voert u dienovereenkomstig doelnamen in en klikt u vervolgens op Toepassen.
- Gebruik aan de linkerkant van het tabblad 2D-amplitude de Hulpmiddelen voor grafieken om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelclusters na de pop-upsuggesties voor het venster Selecteren om cluster toe te wijzen .
OPMERKING: De voorkeursclustermodus kan worden toegepast op basis van de voorkeur van de gebruiker. - Zodra de doelkleuren zijn toegewezen, kunnen kwantificeringsgegevens worden gelezen in het venster Putgegevens rechtsonder. Exporteer gegevens naar Excel /csv voor verdere analyse met behulp van het pictogram met drie balken in de rechterbovenhoek van de brongegevenstabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een proof-of-concept studie werden de analytische prestaties van de multiplex assays getest op klinische en onderzoeksmonsters19. De prestaties van de multiplex assays waren superieur aan die van een RT-PCR19. Omdat lage aantallen druppels kunnen wijzen op een probleem tijdens het genereren van druppels, is in dit artikel een cutoff van 10.000 druppels per put ingesteld op basis van empirische gegevens.
Een goede scheiding tussen positieve en negatieve druppels met minimale regeninterferentie kan helpen bij data-analyse. Daarom is in een goed experiment assay-optimalisatie de sleutel19. Zoals te zien is in de resultaten van de temperatuurgradiëntanalyse in figuur 2D, konden hoge gloeitemperaturen (bijv. 65 °C) positieve druppels niet duidelijk onderscheiden van negatieve druppels wanneer een duplextest (N (FAM) en RPP30 (HEX)) werd uitgevoerd. Met een daling van de gloeitemperatuur werd echter een optimale scheiding tussen positieve en negatieve druppels bereikt. Een temperatuur van 57 °C werd optimaal bevonden. Dit kan ook worden waargenomen in andere testen19.
Met behulp van een tweekleurig (FAM/HEX) RT-ddPCR-detectiesysteem is het mogelijk om één (figuur 2A, B), twee (figuur 2C), drie (figuur 3A) en vier (figuur 3B) SARS-CoV-2-doelen binnen één monster te detecteren. Tijdens de gegevensanalyse kan de bijbehorende software die wordt gebruikt om druppels te lezen alleen simplex- en duplextests analyseren zoals weergegeven in figuur 2. Dit betekent dat voor hogere orde multiplex assays (>3 targets) externe software moet worden gebruikt voor data-analyse zoals weergegeven in figuren 3, S2 en S3. Het is belangrijk om ook op te merken dat de externe software ook kan worden gebruikt om simplex- en duplexgegevens te analyseren. Voor simplex- en duplexgegevens is de analyse vrij eenvoudig, omdat doelen worden gescheiden als positieve of negatieve druppels in hun respectieve kanalen, zoals weergegeven in figuur 2. Een NTC-monster kan helpen bij het lokaliseren van negatieve druppels die op hun beurt kunnen helpen bij het instellen van drempels voor gegevensanalyse zoals weergegeven in figuur 2A. Voor de duplextest kan analyse worden uitgevoerd in individuele kanalen (figuur 2B i,ii) of in de 2D-amplitude (figuur 2B iii).
Voor multiplex-assays van hogere orde is data-analyse niet eenvoudig en moet de aandacht worden gericht op de toewijzing van druppeldoelen. Nadat u de externe software hebt geïnstalleerd, selecteert u de te analyseren putten, selecteert u het juiste experimenttype en wijst u doelclusters toe op basis van het experimenttype, zoals weergegeven in figuur S2 en S3. Het venster Selecteren om cluster toe te wijzen zal u helpen bij het toewijzen van clusters in de hogere multiplex-assays. Gebruik de grafiekgereedschappen om maximaal 8 druppelclusters toe te wijzen voor de triplex probe mix assay (figuur 3A) en maximaal 16 druppelclusters voor de quadruplex amplitude-gebaseerde assay (figuur 3B).
Na het toewijzen van clusters en drempels kunnen kwantificeringsgegevens voor elk doel in de vorm van kopieën/μL worden gelezen in het putgegevensvenster rechtsonder in de externe software. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om het aantal kopieën van doelen in de startsteekproef te schatten. Als bijvoorbeeld 2,2 μL van het monster werd gebruikt in een eindvolume van 22 μL en de software 30,5 kopieën/μL registreerde voor ORF1ab, waren er 30,5 x 22 = 671 kopieën van ORF1ab in de PCR-mix. Het mengsel bevatte 2,2 μL origineel monster, vandaar dat er 671 kopieën van ORF1ab in het startmonster zaten en 671/2,2 = 305 kopieën/μL ORF1ab in het originele monster. Deze methode kan worden gebruikt om de concentratie van elk doelwit in alle assays te schatten.
| Doel | Reeks 5' tot 3' | Sondekleurstof(fen) | Productlengte (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Voorwaarts | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM en BHQ1-3' 5'- HEX en BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Omkeren | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sonde | STEGGTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Voorwaarts | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM en BHQ1-3' 5'- HEX en BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Omkeren | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sonde | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Voorwaarts | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX en BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Omkeren | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sonde | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Voorwaarts | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM en BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Omkeren | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sonde | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabel 1: Primer- en sondesequenties die zijn gebruikt om de verschillende SARS-CoV-2-assays te ontwikkelen.
| Eindconcentratie van primer-probe per assay in nMa | |||||
| Doel | Primer/sonde | Simplexb | Dubbelzijdigc | Triplex sonde mixd | Fourplex amplitudee |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a In alle assays kunnen de doelen worden uitgewisseld op basis van de voorkeur van de gebruiker. De gebruikte doelen zijn voor demonstratiedoeleinden van dit experiment. | |||||
| b Er kan slechts één doel tegelijk worden gedetecteerd in de simplex-test in het FAM- of HEX-kanaal. RBD2 wordt gebruikt om FAM-kanaalresultaten te demonstreren, terwijl RPP30 wordt gebruikt voor het HEX-kanaal. | |||||
| c Twee doelen kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd in de duplextest in het FAM- en HEX-kanaal. | |||||
| d Drie doelen kunnen worden gedetecteerd met behulp van beide kanalen, d.w.z. doel 1 zal worden gedetecteerd in FAM (1× sondeconcentratie), doel twee in HEX (1× sondeconcentratie) en doel 3 in beide kanalen (een mengsel van 0,5× HEX- en 0,5× FAM-sondeconcentraties om de uiteindelijke 1× te vormen). | |||||
| e In elk kanaal worden twee doelen gedetecteerd (FAM en HEX) met een 1× en O.5× sondeconcentratie in elk kanaal. | |||||
Tabel 2: Eindconcentratie van verschillende primer- en sondeparen per assay.
Figuur 1: Monsterverwerking en druppel digitale PCR-workflow. (A) De monsterverwerkingsworkflow omvat monsterverzameling en transport naar een BSL-2-faciliteit, inactivering, extractie en cDNA-generatie. (B) De digitale PCR-workflow voor druppels begint met de voorbereiding van de mastermix, het laden van de mastermix in een ddPCR-plaat en het toevoegen van monster(s), het genereren van druppels, het versterken van doelen in druppels door PCR en ten slotte het lezen van de versterkte druppels met behulp van een druppellezer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Simplex en duplex assay resultaten, inclusief gloeitemperatuur optimalisatie. (A) Simplex assay resultaten wanneer een enkel doel (RBD2) FAM gelabeld was. (B) Simplex-testresultaten wanneer een enkel doel (RPP30) HEX-gelabeld was. (C) Duplex testresultaat van twee doelen in 1D en 2D (iii) Kanalen nadat N (i) FAM was gelabeld en RPP30 (ii) HEX was gelabeld. D) Resultaten van een duplextest gelabeld met ORF1ab (FAM) en RPP30 (HEX) met een gloeitemperatuurgradiënt (65 °C tot 55 °C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Triplex probe mix en quadruplex amplitude-gebaseerde multiplex assay resultaten. (A) Triplex probe mix assay resultaten wanneer drie doelen werden gelabeld met de volgende verhoudingen van FAM:HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) en RPP30 (0:1). (B) op Quadruplex amplitude gebaseerde testresultaten nadat vier doelen waren gelabeld met de volgende verhoudingen van FAM:HEX; RBD2(0,5:0), N (1:0), RPP30 (0:0,5) en ORF1ab (0:1). 1 en 0,5 zijn sondeconcentraties van respectievelijk 250 nM en 125 nM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Druppelgeneratie met behulp van een geautomatiseerde druppelgenerator. (A) Verbruiksartikelen die nodig zijn om de AutoDG in te stellen. (B) Tik op het AutoDG-aanraakscherm op Monsterplaat configureren en selecteer kolommen waar monsters zich op de monsterplaat bevinden en druk op OK. (C) Eenmaal geselecteerd, wordt het scherm geel om aan te geven waar verbruiksartikelen moeten worden geladen. (D) Open de AutoDG-deur en laad verbruiksartikelen op de respectieve plaatsen. Laad verbruiksartikelen van achteren die naar voren werken. Zorg ervoor dat elke keer dat een verbruiksartikel wordt toegevoegd, het licht op die locatie van geel naar groen gaat. (E) Zorg ervoor dat het gebruikte olietype olie voor sondes is. (F) Sluit de AutoDG-deur en zorg ervoor dat alle reagentia op hun plaats zijn ingesteld door te controleren of het AutoDG-aanraakscherm groen is. (G) Druk op START Droplet Generation om druppels te genereren. (H) Nadat het genereren van druppels is voltooid, opent u de AutoDG en verwijdert u de druppelplaat. (I) Verzegel de druppelplaat met behulp van een doorboorbare foliewarmteafdichting. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Stappen voor de analyse van op amplitude gebaseerde multiplex ddPCR-testresultaten met behulp van externe software. (A) Installeer de externe software op een computer. (B) Open het .qlp-bestand door er met de rechtermuisknop op te klikken en Openen met de geïnstalleerde externe software te kiezen of door de externe software te openen en op de optie Bladeren te klikken om het bestand in uw map te zoeken. Als alternatief kan men het .qlp-bestand slepen en het neerzetten in de open externe software om het te openen. (C) Eenmaal geopend, aan de rechterkant van het tabblad Plaateditor , kiest u probe mix triplex in het vervolgkeuzemenu en wijst u dienovereenkomstig doelinformatie toe en klikt u op Toepassen. (D) Gebruik aan de linkerkant van het tabblad 2D-amplitude de grafiekgereedschappen om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelen voor detectie en kwantificering. Zodra druppelclusterdoelen zijn geïdentificeerd, zijn de kwantificeringsresultaten te zien in het venster Putgegevens op hetzelfde tabblad 2D-amplitude. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Stappen voor de analyse van op amplitude gebaseerde multiplex ddPCR-testresultaten met behulp van externe software. (A) Installeer de externe software op een computer. (B) Open het .qlp-bestand door er met de rechtermuisknop op te klikken en Openen met de geïnstalleerde externe software te kiezen, of door de externe software te openen en op de optie Bladeren te klikken om het bestand in uw map te zoeken. Als alternatief kan men het .qlp-bestand slepen en neerzetten in de reeds geopende externe software om het te openen. (C) Eenmaal geopend, aan de rechterkant van het tabblad Plaateditor , kiest u amplitudemultiplex in het vervolgkeuzemenu en wijst u doelinformatie dienovereenkomstig toe en klikt u op Toepassen. (D) Gebruik aan de linkerkant van het tabblad 2D-amplitude de grafiekgereedschappen om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelen voor detectie en kwantificering. Zodra druppelclusterdoelen zijn geïdentificeerd, zijn de kwantificeringsresultaten te zien in het venster Putgegevens op hetzelfde tabblad 2D-amplitude. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn weinig bronnen beschikbaar over het ontwikkelen van RT-ddPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie. Hoewel niet gebruikt in dit artikel, kunnen standaardmonsters met bekende kopieën worden gebruikt om assays te ontwikkelen en te optimaliseren. In dit werk werden SARS-CoV-2-monsters gekweekt in Vero-E6-cellen echter geprikt in een achtergrond van menselijk genomisch RNA en gebruikt als standaardmonsters om de assays te ontwikkelen. Goede primer- en sondesequenties zijn essentieel bij het ontwikkelen van assays. Aangezien het meeste voorbereidende werk aan SARS-CoV-2 RT-ddPCR de China CDC-primer en sondes gebruikte die gericht waren op het ORF1ab- en N-gen, hadden ze ze geschikt gevonden om in dit werk te worden opgenomen 7,8,9,10,11. De analytische specificiteit en sensitiviteit van deze primers zijn ook vergeleken met ddPCR in het vorige werk7. De RBD2 primers en probe13 zijn in eigen huis ontwikkeld en geschikt bevonden voor RT-ddPCR. Omdat de assays voor verschillende toepassingen kunnen worden gebruikt, waaronder diagnose, werd het Ribonuclease P protein subunit p30 (RPP30) specifieke menselijke gen opgenomen in alle multiplex assays. Deze genen kunnen worden gebruikt als een menselijke endogene controle voor diagnostische experimenten. In het geval van milieubemonstering of ander onderzoek dat het menselijke referentiegen niet nodig heeft, kan men dit doelwit echter afwisselen met een ander SARS-CoV-2-doelwit.
In alle assays is het belangrijk om controles op te nemen om assays en experimentele gegevens te valideren. Deze controles kunnen zijn: NTC (nucleasevrij water als monster) om te helpen bij het instellen van drempelwaarden en het lokaliseren van negatieve druppelclusters; positieve controle (monster met alle SARS-CoV-2-doelen, inclusief het menselijke referentiegen) om reagensfalen, primer- en sonde-integriteit en substantiële reverse transcriptiedetectie/locatie van positieve druppeldoelen te beoordelen; en extractiecontroles (gepoolde menselijke monsters van gezonde vrijwilligers of totaal nucleïnezuur geëxtraheerd uit een niet-infectieuze gekweekte menselijke cel) om het falen of succes van de extractiestap te detecteren.
De meeste ddPCR-systemen, waaronder het QX200-systeem, hebben een smal dynamisch bereik van 1 tot 120.000 kopieën/20 μL-reactie. Bij het detecteren van onbekende monsters is de doelconcentratie in het startmonster vaak onbekend en dit kan problemen opleveren bij het kwantificeren van sterk geconcentreerde monsters. Om dit te ondervangen, wordt aanbevolen dat bij het kwantificeren van monsters waarvan wordt vermoed dat ze grote hoeveelheden doelmoleculen bevatten (zoals celkweek), men van plan is om het startmonster dienovereenkomstig te verminderen. In het geval dat het doelkopienummer/-genoom onbekend is, moet men de optimale starthoeveelheid bepalen door middel van een reeks van vier tienvoudige seriële verdunning van elk monster binnen het verwachte digitale bereik. Door deze vier punten te testen, wordt ervoor gezorgd dat een van de datapunten binnen het optimale digitale bereik ligt.
Het gebruik van hoge primer en lage sondeconcentratie is een perquisite van de meeste simplex en duplex ddPCR experimenten. Dit verschil in concentratie vergroot de amplitudescheidingsafstand tussen de positieve en negatieve druppelclusters, waardoor het gemakkelijk is om gegevens te analyseren. Bij het ontwikkelen van multiplextests van hogere orde kunnen veranderingen in deze concentraties echter leiden tot veranderingen in de positie van positieve druppeldoelen zoals weergegeven in figuur 3 en 4. Als gevolg hiervan zou een optimalisatieoptie voor de test, afgezien van de gloeitemperatuur, zijn om de doelprimer of sondeconcentratie te veranderen om druppels te onderscheiden. Dit fenomeen is gebruikt en verklaard vóór14,15,16.
Ondanks de testprestaties is dit werk een RT-ddPCR-workflow in twee stappen. De extra reverse transcriptie stap voor ddPCR, geeft ruimte voor contaminatie van monsters. Als echter zorgvuldige en juiste monsterbehandelingstechnieken worden gebruikt, is dit een non-issue. Positief is dat DNA stabieler is dan RNA. De omzetting van RNA naar cDNA kan de houdbaarheid van het monster tijdens opslag verlengen in vergelijking met RNA. Een RT-ddPCR-experiment in twee stappen is ook goedkoper dan een RT-ddPCR-experiment in één stap.
In vergelijking met RT-qPCR is RT-ddPCR duur. Daarom moeten overwegingen worden genomen bij het uitvoeren van RT-ddPCR. Tijdens de diagnose kan men bijvoorbeeld RT-ddPCR gebruiken in het geval dat hun monsters lage overvloedige doelen hebben. Er is echter een mogelijkheid dat de kosten van dPCR-instrumenten en reagentia binnenkort zullen dalen en dat de techniek in veel laboratoria zal worden aangepast, zoals in het verleden gebeurde met reguliere PCR en qPCR. Daarom is het belangrijk om protocollen zoals deze in te stellen voor huidige en toekomstige gebruikers van dPCR. Kortom, de ontwikkelde assays geven ruimte voor potentiële gebruikers om doelen te variëren op basis van hun toepassingen. Multiplexing zorgt ervoor dat men efficiënt veel doelen binnen één monster in één reactie kan detecteren. Tot nu toe is dit mogelijk het eerste protocol dat een volledig detail geeft over het gebruik van het AutoDG-systeem, inclusief de externe software bij SARS-CoV-2-detectie. Er moet nog meer werk worden gemaakt van assay-optimalisatie om een betere scheiding in de quadruplex-assay te bereiken. Het gebruik van standaarden zal ook helpen om de ontwikkelde assays te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door Megaproject of Infectious Disease Control van het Ministerie van Volksgezondheid van China, subsidienummer 2017ZX10302301-005 en Sino-Africa Joint Research Center, subsidienummer SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
