Summary
该协议提出了一种培养和处理从成年小鼠后味分离出的味觉干细胞中提取的语言器官的方法。
Abstract
味觉由舌头上的味蕾进行介质，由快速更新的味道受体细胞（TRCs）组成。这种持续的周转是由局部祖细胞驱动的，使味觉功能容易受到多种药物治疗的干扰，进而严重影响生活质量。因此，在药物治疗的背景下研究这个过程对于了解是否以及如何影响味觉祖传功能和 TRC 生产至关重要。鉴于伦理问题和人类味觉组织的有限可用性，通常使用与人类相似的味觉系统。与 活体 方法相比，这种方法既费时又昂贵，而且不适合高通量研究，而穆林语言器官可以使实验在许多复制物和更少的小鼠下快速运行。在这里，先前公布的协议已经调整，并提出了一个标准化的方法，从从成年小鼠的环状（ CVP ）分离的味觉祖细胞生成味觉器官。品尝CVP表达LGR5中的祖细胞，可以通过EGFP荧光激活细胞分拣（FACS）从携带Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 等位基因的小鼠身上分离出来。分拣的细胞被镀在基于基质凝胶的3D培养系统上，培养12天。器官通过增殖在培养期的前6天扩张，然后进入分化阶段，在此期间，它们与非味上皮细胞一起产生所有三种味觉细胞类型。器官可在第12天成熟时或在RNA表达和免疫组织化学分析的生长过程中随时采集。标准化从成人干细胞中生产语言器官的培养方法将提高可重复性，并推动语言器官作为一种强大的药物筛选工具，帮助体验味觉障碍的患者。
Introduction
在啮齿动物中，语言味蕾被安置在真菌状的中，前分布，双边叶状后部，以及舌头1后部中线的单个环状（ CVP ）。每个味蕾由50-100个短寿命、快速更新的味觉受体细胞（TRCs）组成，其中包括I型胶质状支持细胞、检测甜、苦和乌玛米的II型细胞，以及检测酸2、3、4的III型细胞。在小鼠CVP中，LGR5+干细胞沿基底拉米纳产生所有TRC类型以及非味上皮细胞5。更新味觉血统时，LGR5女儿细胞首先被指定为进入味蕾并能够分化为三种 TRC 类型6中的任何一种的后味觉前体细胞（IV 型细胞）。TRC的迅速更替使味觉系统容易受到医疗的干扰，包括放射和某些药物疗法7，8，9，10，11，12，13。因此，在味觉干细胞调控和TRC分化的背景下研究味觉系统对于理解如何缓解或预防味觉功能障碍至关重要。
老鼠是味觉科学中自然研究的传统模型，因为它们的味觉系统与人类14、15、16的组织相似。然而，小鼠不适合高吞吐量研究，因为它们的维护成本高，工作时间长。为了克服这一点，近年来已经开发了体外器官培养方法。味觉器官可以从原生CVP组织生成，在这个过程中，器官从孤立的老鼠CVP上皮培养出前体内17。这些器官显示与体内味觉系统一致的多层上皮。2014年，任等人开发出一种更有效的方法来生成不需要前体内CVP培养物的器官。适应方法和文化介质首先开发成长肠道器官，他们从小鼠CVP中分离出单个Lgr5-GFP-祖细胞，并将其镀在基质凝胶19中。这些单细胞产生的语言器官在培养的头6天增殖，在第8天左右开始分化，到培养期结束时含有非味上皮细胞和所有三种TRC类型18，20。迄今为止，利用语言器官模型系统的多项研究已发表17、18、20、21、22：然而，用于生成这些器官的方法和文化条件因出版物而异（补充表1）。因此，这些方法已经调整和优化在这里提出了一个详细的标准化协议，从LGR5-成年小鼠CVP的祖先衍生的语言器官培养。
语言器官为研究推动味觉细胞发育和更新的细胞生物过程提供了独特的模型。随着语言器官应用的扩大和越来越多的实验室转向利用 体外 器官模型，该领域必须努力开发和采用标准化协议，以提高可重复性。在味觉科学中建立语言器官作为标准工具，将使高通量研究能够区分单个干细胞如何产生成人味觉系统的分化细胞。此外，语言器官可以用来快速筛选药物对味觉平衡的潜在影响，然后可以在动物模型中更彻底地研究。这种方法最终将加强努力，为未来的药物接受者设计改善生活质量的疗法。
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Protocol
所有动物程序均在AAALAC认可的设施内按照《实验室动物护理和使用指南》、《动物福利法》和《公共卫生服务政策》执行，并经科罗拉多大学安舒茨医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本协议中使用的Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 小鼠来自杰克逊实验室，库存号008875。
注：在开始之前应完成以下步骤，以确保协议的顺利和及时进展：将水浴设置为 37 °C， 将离心机设置为 4 °C，将注射和分离酶溶液从 10 毫克/mL 脱脂、拼贴酶和弹性酶库存溶液（参见 材料表）中取出基质凝胶从 -20 °C 冰柜中取出（48 井板所需的 ±750 μL），然后通过将小瓶浸入冰中解冻。至少 3-4 小时，未稀释的 FBS 中的预涂层微中心管，在室温下轻轻摇晃至少 30 分钟（两个 2 mL 管用于组织收集，两个 1.5 mL 管用于分离细胞，一个 1.5 mL 管用于从细胞分拣机收集单个细胞;使用前去除多余的 FBS）。
1. CVP 上皮的分离
注：要获得足够的LGR5+ 细胞，以获得一个完整的48井板，收集三个Lgr5-EGFP CVP在同一管和过程同时。重要的是，在单独的管子中并行采集和处理至少一个野生类型的垃圾的CVP，并利用它作为一个鳄鱼控制来设置FACS参数（见 代表结果）。
- 根据IACUC的规定，用CO2 窒息对小鼠实施安乐死，然后采用经批准的辅助方法，如双边胸腔切除术、颈椎错位、斩首或摘除。
- 使用大无菌解剖剪刀切开脸颊，打断下巴。抬起舌头，切开语言，将舌头从口腔的地板上分离开来。切掉舌头，收集在无菌冰冷的杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐（dPBS）与Ca2+和Mg2+。
- 删除和丢弃前舌，只需用剃须刀刀片切割前部的间星体显赫（图1A，虚线）。使用精细的任务擦拭，从后舌中去除任何头发和多余的液体。
- 在 Ca 2+ /Mg 2+ 中填充 1 mL 注射器，加入 200-300 μL 注射酶溶液（最终浓度：2 毫克/mL 类型-I 拼贴酶和5毫克/mL 迪斯帕塞II）含 dPBS， 稀释从10毫克/mL库存溶液），并插入一个30G x 1/2针正上方的间星显赫（图1B，黑箭头），直到只是前CVP（图1B， 黑匣子）。将酶溶液注射到上皮和底层组织（拉米纳丙烯、肌肉）之间的 CVP 的横向边缘。注射时，将注射器缓慢而连续地从舌头中取出。
- 在室温下将舌头孵育在无菌 Ca2+/Mg2+无 dPBS 中，精确为 33 分钟。
- 使用额外的细解剖剪刀，在上皮上进行双边和前身的小切口，然后用细钳轻轻剥去上皮。一旦沟渠上皮没有底层结缔组织，将其放置在一个空的2mL微中心管预涂有FBS。在分离 CVP 上皮之前或之后进行上皮修剪（图 1C，D）。
2. CVP 上皮分离
注：CVP上皮和电镀的分离在 图2中以图形表示。
- 加入分离酶鸡尾酒（最终浓度：2毫克/mL型I型拼贴剂， 2 毫克/mL 弹性酶，和 5 毫克/mL 迪斯帕塞 II 在 Ca2+/Mg2+- 含 dPBS，稀释从 10 毫克/mL 库存溶液）到含有去皮 CVP 表皮的管子（每 CVP 200 μL）。在 37 °C 的水浴中孵育 45 分钟。漩涡每15分钟短暂一次。
注： 预热 0.25% Trypsin-EDTA 在 37 °C 水浴在最后 15 分钟的酶鸡尾酒孵化。 - 孵化后，漩涡（三个脉冲）然后用玻璃巴斯德移液器三叶草1分钟。组织片落定后，将含有第一批分离细胞的超高分子移液器放入与基因型对应的新型FBS涂层的1.5mL微中心管中。按照第 2.3 步中所述，进一步处理剩余的组织片段。下面。
- 在 370 x g 和 4 °C 下旋转超高分子 5 分钟，以颗粒细胞。
- 取出产生的超高分子，在荧光激活细胞分拣 （FACS） 缓冲区（1 mM EDTA、25 m HEPES（pH 7.0）和 1% FBS 中重新吸收荧光激活细胞分拣（每个 CVP 50 μL）中的细胞颗粒。储存在冰上。
- 在执行步骤 2.2.1 和 2.2.2 时，将剩余的组织片段从步骤 2.2 分离出来，在原始 2 mL 微中心管中加入预热 0.25% 的 trypsin-EDTA（每 CVP 200 μL），并在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。漩涡每10分钟短暂一次。
- 孵化后，旋涡管包含组织片（三个脉冲），然后用玻璃巴斯德移液器三叶草1分钟。组织片落定后，将超高分子移液器放入含有2.2.2.2步细胞的1.5mL微中心管中。丢弃含有剩余组织块的管子。
- 在 370 x g 和 4 °C 下用分离的细胞旋转管 5 分钟，以颗粒细胞旋转 4 °C。
- 取出 FACS 缓冲区中的超高分子和再悬浮细胞颗粒（每 CVP 100 μL）。储存在冰上。
- 通过 30 μm 尼龙网过滤器传递细胞，并在 FACS 之前将 DAPI （+排放= 450 nm） 添加到细胞混合物中。使用绿色荧光蛋白通道（= 488 nm; =排放= 530 nm）通过 FACS 分离 Lgr5-GFP® 细胞。使用 100 μm 喷嘴将电池排序到新鲜的 FBS 涂层的 1.5 mL 微中心管中，其中含有 300 μL 的 Ca2+/Mg2+免费 dPBS。将细胞放在冰上直到电镀。
3. Lgr5-EGFP细胞的电镀
- 确定从流细胞仪接收的 LGR5+ 细胞悬浮量。
- 根据从分拣机获得的细胞数，计算每个 μL 的细胞数。然后，确定获得电镀所需的细胞数量所需的体积（我们每口 48 井板使用 200 个细胞），并将悬浮电池的总容量转移到新的微中心管中。
- 在 370 x g 和 4 °C 下旋转管子 5 分钟以颗粒细胞（颗粒可能看不见）。取出超高线，将管子放在冰上。
- 轻轻地将细胞颗粒重新用于适量的基质凝胶（48 井板每口井 15 μL）;移液器上下轻轻地将细胞彻底分布在基质凝胶中。将 15 μL 的基质凝胶/细胞混合物放在每口井的中心。在电镀过程中，将微中心管放在冰上 50 mL 圆锥形管中，以防止矩阵凝胶凝胶凝胶凝胶凝胶。继续混合矩阵凝胶/细胞混合物在整个电镀通过管道上下每三口井，以确保细胞均匀分布在井之间。
- 将盘子放在孵化器中（37 °C，5%CO 2，+95% 湿度）10 分钟，让基质凝胶凝胶凝胶。然后，将 300 μL 的室温 WENRAS = Y27632 介质添加到每口井中，并将板返回到孵化器中。
4. 器官维护
注：在传统的器官介质（WENR）中生长有机体，包括重组EGF和50%的有条件介质，包括Wnt3a、Noggin和R-海绵丁23。药物A8301和SB202190被添加为文化时期的前6天，以优化增长（WENRAS媒体）（图5），然后删除，以促进差异化（WENR媒体）20。Y27632 被添加为前 2 天的文化， 以促进生存。 图4中介绍了与文化时间表相关的媒体条件。
- 电镀两天后，使用 1 mL 移液器从每口井中取出 WENRAS – Y27632 介质，确保不会交叉污染。在井边添加 300 μL 的 WENRAS 介质，以不破坏矩阵凝胶。将盘子放回孵化器。
- 每2天更换一次媒体，使用适当的媒体进行文化舞台（图4）。保持器官，直到第12天，当器官准备收获。
5. RNA 处理
- 为RNA采集器官
- 将 48 井板放在冰上 30 分钟，以去聚合基质凝胶。
- 使用 1 mL 移液器，拉起器官介质;然后，当媒体返回井中时，使用移液器的尖端划伤并进一步分解矩阵凝胶。将内含物转移到 1.5 mL 微中心管中，将三口井中的内容集中到一根管子中。在室温下，在 300 x g 下将管子离心 5 分钟。
- 在不去除任何器官的情况下，尽可能多地去除介质超高超分子;然后，在室温下在 300 x g 下再次旋转管子 5 分钟。
- 取出剩余的介质，在 350 μL 裂解缓冲器中重新使用器官 - β-麦芽醇 （βME） （每 1 mL 裂解缓冲区 10 μL éME）。将样品放在冰上，立即提取RNA或储存在-80°C。
- 定量 RT-PCR 分析
- 通过光谱光度计测量RNA数量。使用 cDNA 合成套件反转录 RNA。
- 混合 cDNA 相当于 5 ng RNA 与 200 nM 预先验证的前进和反向底漆 （表 1）和荧光 PCR 主混合。运行 qRT-PCR 反应 40 周期： 95 °C 为 15s， 然后 60 °C 为 60s.
6. 免疫化学
- 收集和固定器官
- 将 48 井板放在冰上 30 分钟以松开基质凝胶。
- 取出器官介质，在每口井中加入 400 μL 的冰冷 PBS。然后，取出 PBS，并在每口井中加入 400 μL 的冰冷电池恢复解决方案。在 4 °C 下轻轻摇动 30 分钟。
- 在 PBS 中涂上 1 mL 管道尖端，并轻轻地上下管道内容，以分解矩阵凝胶。将器官转移到放置在冰上的1.5mL微中心管。
- 用 300 μL PBS + 1% BSA 冲洗每口井，并将任何剩余的器官转移到相应的管子上。从每个管子中取出细胞恢复解决方案/PBS + BSA。加入 400 μL 的冰冷 PBS，然后用另一个冰冷的 PBS 冲洗重复。
- 取出PBS，用300微升冰冷4%PFA（0.1 M PB）固定器官20分钟，在室温下孵育。取出 PFA，用 400 μL 冰冷 PBS 冲洗器官。
- 删除 PBS;然后，添加 400 μL PBS = 1% BSA。储存在 4 °C。
- 免疫荧光染色
- 在 500 μL PBS = 1% BSA 中冲洗器官。然后，在阻断溶液中孵育器官（5% 正常山羊或驴血清，1% 牛血清白蛋白，0.3% Triton X 100 在 1x PBS pH 7.3）2 小时，在室温下轻轻摇动。
- 加入原发抗体溶液（在阻断溶液中稀释的主要抗体），在4°C下轻轻摇晃3晚。
- 用 500 μL PBS + 0.2% Triton 将器官 4x 洗为 1 小时，在室温下轻轻摇动。在 4 °C 下添加二级抗体溶液（在阻断溶液中稀释的二级抗体）和岩石器官，不受光线保护。
- 用 500 μL PBS + 0.2% Triton 将器官 3x 洗净 1 小时，不受光线照射，并在室温下轻轻摇晃。用 DAPI 稀释 1：10，000 在 0.1 M PB 中孵育 20 分钟，在室温下摇摆和覆盖。
- 用 0.1 M PB 将器官清洗 3 倍 20 分钟，轻轻摇动，并在室温下覆盖。
- 用于倒置共聚焦显微镜的器官的滑动安装。
注：幻灯片安装过程的分步图片显示在 图7中。- 在显微镜滑梯上创建 +1 毫米厚的 22 x 22 mm 平方的无毒建模粘土周长。
- 从微中心管中取出 0.1 M PB，并在 100 μL 的安装介质中轻轻重新悬浮器官;然后，转移到粘土广场的中心。
- 填充粘土方块，直到安装介质几乎达到顶部。然后，将 22 x 22 mm 方形盖片放在粘土上，并牢牢地压在盖唇的两侧以密封。让它按照制造商的说明（这里，室温1-2天）治愈，并储存在4°C。
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Representative Results
老鼠有一个CVP，位于舌头的后部，LGR5+ 干细胞可以从中分离出来（图1A，黑匣子）。在 CVP （图 1B）下和周围注射酶溶液会导致上皮轻微肿胀和结缔组织的消化。经过33分钟的孵化后，可以实现充分的消化，从而可以轻松地将CVP上皮与底层组织分离。在尝试剥去 CVP 上皮时，应在距离 CVP 足够远的地方进行切割，以确保战壕不会中断或损坏（图 1C）。这也使一个人能够抓住上皮使用钳子，而不会损害CVP。修剪 CVP 周围的上皮，通过减少纵的组织质量（图 1D ）去除非目标细胞，并提高以下步骤的效率。在将 CVP 上皮添加到微中心管之前，必须检查两个战壕（图 1C、黑色箭头）是否存在：成功剥落的CVP包括冯埃布纳的腺体和管道的一部分（图1D，黑箭头）。如果去皮的上皮不包含这两种不透明的结构，则沟渠上皮很可能由于结缔组织的消化不完整而破裂。
为了建立适当的FACS设置来收集Lgr5-EGFP细胞，分离CVP的细胞分别从野生类型和Lgr5-EGFP小鼠中获取。首先分析野生型CVP细胞，以确定盖子参数，这个过程使细胞群按兴趣特征24在散射图输出中分类。在这里，四个参数用于最终识别电镀细胞。第一个参数，向前散射，根据检测到的表面积过滤掉颗粒和碎片。此参数删除了排序期间检测到的所有事件的 ±70%（图 3）。宽度参数进一步筛选基于大小的事件，以确保选择单个单元格（单个单元）。大约90%的事件是单打（图3）。核标记DAPI被死亡，但不是活细胞，因此允许死细胞整理25。此协议优化了细胞的生存能力，因为超过 90% 的事件是活细胞（图 3）。最后，GFP制胶参数设置在野生类型细胞的自发光水平之上。不收集野生类型细胞：它们仅用作 GFP 荧光的门控。根据从野生类型样本确定的测定参数，Lgr5-EGFP 样本中的细胞随后通过流细胞仪进行排序以进行收集。盖茨可以在Lgr5-EGFP分类的开头进行调整，以适应某些细胞群的清晰聚集，但不应在中类中发生显著变化。研究发现，三个聚合 Lgr5-EGFP CVP 分离产生 500，000 个细胞，包括平均 10，000 个 GFP+ 细胞。
适当的媒体和文化条件对于器官的最佳生长和分化至关重要。先前利用语言器官进行的研究以肠道器官领域的器官成分为模型，包括Wnt3a、EGF、Noggin和R-海绵丁17、18、19、20、21、22。然而，当语言器官使用类似的方法（WENR介质）培养时，器官不会有效生长（图5A）。在人体肠道器官中，药物A8301（TGF+信号抑制剂）和SB202190（p38 MAPKinase信号抑制剂）用于促进器官生长26。事实上，添加这些抑制剂（WENRAS介质）会诱导语言器官的强劲生长（图5A）。有趣的是，在6天后从媒体上去除这些抑制剂会导致一般TRC标记Kcnq1的表达率更高，这表明A8301和SB202190阻碍味觉细胞分化（图5B）。因此，从第 0-6 天到第 6 天（图 4、图 5）在WENRAS媒体中培养器官，分别获得最佳生长和分化。
器官细胞类型组成可以具有qRT-PCR或免疫造血术的特征。成熟的器官既包含以Kcnq1和KRT8为标志的味觉细胞，也含有以Krt13/KRT13（图6，8A）为标志的非味上皮细胞。这表明孤立的LGR5+ 细胞在体外具有与体内类似的效力，因为在成人舌头中，Lgr5-GFP® 细胞同时产生味觉和非味觉谱系 5。此外，Krt13的表达水平高于所有3个TRC标记（图6），表明器官主要由非味上皮细胞组成。事实上，基因表达27的相对量化表明Krt13的表达比一般的TRC标记Kcnq1（学生的t-测试，p = 0.0004）高出50倍。这是意料之中的，因为舌头的味觉与非味觉上皮1的比例相似。器官表示所有三种 TRC 类型（图6、8B、C）。I型细胞（以Entpd2标记）和苦味II型细胞（以Gnat3标记）在味觉器官中表达强烈，而酸性感应III型细胞（以Car4标记）则不太常见（图6）。TRC是随机分布在器官（图8），而不是在体内观察到的离散味蕾结构。
图1：解剖舌头和去皮的CVP上皮。 （A） 舌头被解剖，前舌通过切除前体间显赫（破线）前部，留下后舌，包括CVP（黑匣子）（B）一根针，只插入前体间显赫（黑箭头），酶混合物被注射到下面和CVP（黑匣子）的横向边缘。（C） CVP 战壕（黑箭）和（D） 修剪去皮 CVP 上皮周围未修剪的去皮上皮。冯·埃布纳的腺体和管道（D，黑色箭头）在战壕成功剥落后可见。比例栏：1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：语言器官生成的工作流程。 舌头从Lgr5-EGFP小鼠身上取出。CVP 沟渠绰号（红盒）从底层结缔组织剥离并分离成单细胞。GFP– 细胞被分离并镀在基质凝胶中，密度为每井 200 个细胞，在 48 井板中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：荧光激活细胞分拣的门答声。（A） 控制（野生型CVP细胞）运行确定FACS门，通过向前散射消除碎片和破碎细胞，通过侧散射宽度识别单体，将DAPIneg活体与DAPI-死细胞分离，并建立野生类型细胞的自发光水平。（B） 先前确定的门应用于实验运行（Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP细胞），以分离无碎片、单体、活体、Lgr5-EGFP+细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：语言器官培养时间表和所需媒体。 ROCK 抑制剂 Y27632 被添加到介质中，用于前 48 小时培养，以促进细胞存活。在增殖阶段，有机体被喂食含有A8301和SB202190（WENRAS）的有条件介质，以优化生长。这些药物从第6天开始被媒体（WENR）扣留，以促进分化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：药物A8301和SB202190影响器官生长和分化。 （A） 在WENR介质（第0-12天）、WENRAS介质（第0-12天）或WENRAS（第0-6天）中生长的器官的亮场图像（第6-12天）。图像是在第 2 天、第 6 天和第 12 天使用实时成像软件拍摄的。比例栏：400 μm（B） 当药物 A8301 和 SB202190 在器官分化期间出现时，全球 TRC 标记 Kcnq1的相对基因表达显著减少。每个点代表一个生物复制，其中包括三个汇集井。相对基因表达（水平线）的平均变化是通过平均三个生物复制来计算的。错误条：±SD. 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：语言器官表达规范味细胞标记。与家政基因Rpl19相比，全球TRC标记Kcnq1、非味上皮标记细胞角蛋白13（Krt13）、I型TRC标记恩普德2、II型苦味TRC标记Gnat3和III型酸性TRC标记Car4的周期阈值变化。每个点代表一个生物复制，其中包括三个从48井板的池井。每个标记的 Ct 值（水平线）的平均变化是通过平均三个生物复制来计算的。未修复的学生t测试， *p < 0.05.错误条：± SD.请单击此处查看此图的较大版本。
图7：为倒置共聚焦显微镜安装语言器官。 （A） 产生一串1毫米厚的无毒建模粘土。（B） 粘土被雕刻成 +20 毫米 x 20 毫米方形，位于 24 毫米 x 75 毫米显微镜滑梯的中心。（C） 22 毫米 x 22 毫米正方形盖唇密封悬挂在安装介质中的器官。比例栏：10毫米。 请点击这里查看此图的较大版本。
图8：完整语言器官的免疫标签。 固定的、免疫染色的器官的共聚焦图像。（A） 非味上皮标记 KRT13（绿色）和一般 TRC 标记 KRT8（品红色）的器官染色光学部分。（B） 最大投影一个器官染色的一个圆锥形的凸起，用于 I 型胶质状细胞标记 NTPDase2（绿色）和 KRT8（品红色）。（C） 最大投影两个部分显示的器官（白色破折号轮廓）和一个完整的器官染色为 III 型酸检测细胞标记 CAR4（绿色），和苦涩检测 II 型细胞标记 GUSTDUCIN（品红色）。比例尺：A、B 和 C. 核标记 DAPI（蓝色、右柱）100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 基因名称 | 前进引线 （5'-3'） | 反向引线 （5'-3'） | 评估编号 | ||||||
| 汽车4 | 特克塔加卡·阿格特加奇 | CTCCACTGTGTGGGGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| 恩普德 2 | 加加卡塔克特格 | 格特卡加卡特卡卡卡特克 | NM_009849.2 | ||||||
| 格纳特3 | 阿卡格加特卡格茨克 | 特格特卡茨卡克加特 | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | 特格特卡特卡茨卡特卡格 | 格特格特格塔加格 | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | 特卡特克特克特克特克加 | 特加特克特克特格特加加格 | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | 格特克特格特加特克卡特卡茨卡茨 | 克布拉格加特加特卡 | NM_009078.2 | ||||||
表1：用于定量RT-PCR的引物序列。
补充表1：已出版的语言器官培养媒体成分的比较。 请点击这里下载此表。
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Discussion
这里报道的是一种高效且易于重复的方法，用于培养、维持和处理从成年小鼠味干细胞中提取的语言器官。研究发现，使用3个CVP从8至20周大的Lgr5-EGFP小鼠足以获得€10，000 GFP+ 细胞进行实验使用，导致50口井镀在密度为200细胞每井在48井板。通过注射新制作的 Dispase II 和 I 型拼贴液，然后进行 33 分钟的孵化，优化了 CVP 沟渠上皮的去除。然而，更短的潜伏时间，旧的酶，不同的批次，或使用来自不同制造商的酶，可能会导致不完整的沟渠去除。相反，较长的潜伏时间会导致组织过度消化，导致味觉组织完整性丧失。剥皮后，通过修剪 CVP 周围的上皮来进一步丰富 CVP 沟渠。
在分离和收集过程中使用的所有微中心管都涂有 FBS 以防止组织和细胞粘附在管子的塑料壁上，从而显著减少分离细胞的恢复（数据未显示），这一点至关重要。使用轻质FBS，在使用前从管子中去除多余的液体，可最大限度地减少对Trypsin或其他酶的抑制作用。
语言器官已经从分离的CVP组织中成功生长，无需事先对LGR5+细胞17进行排序。虽然这种方法导致器官的形成，我们发现，与从孤立的祖细胞中生长的器官相比，这些器官中含有味觉细胞的比例较小（数据未显示）。Lgr5-EGFP 的流动排序–细胞丰富了味觉能力的祖细胞，导致味觉丰富的器官比例更高。目前，我们收集所有细胞超过GFP自发光阈值（图3）：然而，GFP 亮度水平可能与可变器官形成效率或味觉能力相关联。这一假设尚未得到检验，但它是未来工作的一条有希望的途径，因为它可以允许进一步丰富含有味觉细胞的器官。
众所周知，电镀密度影响器官分化的效率，我们建议在实验28之前确定最佳电镀密度。在确定电镀密度时，应考虑油井的大小和深度以及基质凝胶体积。根据我们的初步工作（数据未显示），我们发现，在 48 井板中，15 μL 的基质凝胶和每口井 200 个细胞的电镀密度允许所有三种 TRC 类型的高效器官膨胀和分化。我们发现，语言器官可以在减少生长因子基础膜提取物 （RGF BME） 中成功和可重复地培养，这是一种合成和成本较低的基质凝胶替代品。其他替代矩阵也可能支持语言器官培养，但需要进一步测试来研究这种可能性。
在电镀过程中，收集的细胞应彻底但轻轻地在基质凝胶中重新沉积，通过频繁上下管道来保持细胞悬浮的均匀性。在整个电镀过程中，含有细胞基质凝胶混合物的管子也应保存在冰上，以防止基质凝胶在管的两侧凝胶。这些措施确保细胞在井间均匀分布，在手电镀细胞时产生更可重复的结果。值得注意的是，微流体技术的最新发展为细胞分配提供了高吞吐量的选择，是未来工作的一个很有前途的工具。
为了评估培养器官中的基因表达，发现有必要为每个生物复制品至少收集三口井，以获得足够的RNA和复制物的一致性（图6）。还确定，根据特定制造商的说明立即解莱分收获的器官，优化提取RNA的质量和数量。虽然没有在此处进行测试，但存储试剂中的闪存冻结或重新悬浮等其他存储选项也可能保持 RNA 产量和质量。
对器官进行免疫造血术可能具有挑战性，因为初级和二级抗体必须穿透任何残留的基质凝胶和整个器官上皮。在以前的报告中，器官被固定，同时仍然悬浮在基质凝胶中，这随后需要极高浓度的原发性抗体溶液来揭示蛋白质表达17，18。与其他报告类似，在固定之前使用细胞恢复解决方案从基质凝胶中去除器官可以提高染色效率，而无需高抗体浓度30，31：然而，检测一些味觉细胞标记，例如CAR4，需要更高的抗体浓度。此外，在原发性抗细胞中孵育器官3晚会增加抗体结合的概率。然而，如果器官在免疫染色后洗涤不足，这种方法也可能增加背景荧光。重要的是，稀释的原发抗体溶液可以保存并成功重复使用一次或多次，如果存储不到一个星期（数据未显示）。为了获得最佳成像效果，将遮盖唇放在建模粘土的粘土周长上，以保持其 3D 结构。将盖玻璃直接放在滑梯上压缩并打破有机体，防止进行适当的分析。
有机培养是一种非常适用、经济高效的技术。一些应用包括，但不限于疾病建模和药物筛选和干细胞和发育生物学的研究32。因此，标准化器官模型以允许跨实验室的可重复性至关重要。将来，开发一种标准化的通过语言器官的方法，保证味觉干细胞的功效可以在序列通道中传播，从而减少对额外动物产生更多器官的需要。重要的是，虽然语言器官由味觉和非味上皮细胞组成，但这些细胞的组织与体内味觉系统不同。器官和体内味觉上皮之间的差异可能是由于用于器官培养和/或器官体缺乏与味蕾微环境的相互作用，包括来自阵风神经和味蕾形成和维持所需的拉米纳丙ria的重要信号22，33，34，35。未来的工作，将神经或血管纳入语言器官培养，目前正在采取的策略，在其他器官系统，可以允许更准确的建模体内味觉上皮36，37。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢彼得·登普西博士和莫妮卡·布朗博士（科罗拉多大学安舒茨医学院器官和组织建模共享资源）提供了WNR条件媒体和有价值的讨论。我们还感谢科罗拉多大学癌症中心细胞技术和流细胞学共享资源，特别是德米特里·巴图林的细胞分拣专业知识。这项工作由：NIH/NIDCD R01 DC012383资助， DC012383-S1、DC012383-S2、NIH/NCI R21 CA236480 至 LAB、R21DC016131 和 R21DC016131-02S1 至 DG，以及 F32 DC015958 至 EJG。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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