Summary
El protocolo presenta un método para cultivar y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales aisladas de la papila gustal posterior de ratones adultos.
Abstract
El sentido del gusto está mediado por las papilas gustativas en la lengua, que se componen de células receptoras del gusto (TRC) que se renuevan rápidamente. Esta rotación continua es impulsada por células progenitoras locales y hace que la función gustal sea propensa a la interrupción por una multitud de tratamientos médicos, lo que a su vez afecta gravemente la calidad de vida. Por lo tanto, estudiar este proceso en el contexto del tratamiento farmacológico es vital para comprender si y cómo se ven afectadas la función progenitora del gusto y la producción de CVR. Dadas las preocupaciones éticas y la disponibilidad limitada de tejido gustativo humano, los modelos de ratón, que tienen un sistema de sabor similar al de los humanos, se utilizan comúnmente. En comparación con los métodos in vivo, que consumen mucho tiempo, son costosos y no susceptibles de estudios de alto rendimiento, los organoides linguales murinos pueden permitir que los experimentos se ejecuten rápidamente con muchas réplicas y menos ratones. Aquí, se han adaptado protocolos publicados anteriormente y se presenta un método estandarizado para generar organoides del gusto a partir de células progenitoras del gusto aisladas de la papila circunvalada (CVP) de ratones adultos. Las células progenitoras gustales en el CVP expresan LGR5 y se pueden aislar a través de la clasificación celular activada por fluorescencia EGFP (FACS) de ratones portadores de un alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Las células clasificadas se enchan en un sistema de cultivo 3D basado en gel de matriz y se cultivan durante 12 días. Los organoides se expanden durante los primeros 6 días del período de cultivo a través de la proliferación y luego entran en una fase de diferenciación, durante la cual generan los tres tipos de células gustales junto con las células epiteliales no gustales. Los organoides se pueden cosechar al madurar en el día 12 o en cualquier momento durante el proceso de crecimiento para la expresión de ARN y el análisis inmunohistoquímico. La estandarización de los métodos de cultivo para la producción de organoides linguales a partir de células madre adultas mejorará la reproducibilidad y hará avanzar los organoides linguales como una poderosa herramienta de detección de drogas en la lucha para ayudar a los pacientes que experimentan disfunción del gusto.
Introduction
En roedores, las papilas gustativas linguales se alojan en papilas fungiformes distribuidas anteriormente, papilas foliadas bilaterales posteriormente, así como una sola papila circunvalada (CVP) en la línea media posterodorsal de la lengua1. Cada papila gustativa está compuesta por 50-100 células receptoras del gusto (TRC) de corta duración y rápida renovación, que incluyen células de soporte tipo I similares a las gliales, células tipo II que detectan dulce, amargo y umami, y células tipo III que detectan agrias2,3,4. En el CVP de ratón, las células madre LGR5+ a lo largo de la lámina basal producen todos los tipos de TRC, así como las células epiteliales no gustales5. Al renovar el linaje del gusto, las células hijas LGR5 se especifican primero como células precursoras del gusto postmitótico (células tipo IV) que entran en una papila gustativa y son capaces de diferenciarse en cualquiera de los tres tipos deCVR 6. La rápida rotación de los TRP hace que el sistema de sabor sea susceptible a la interrupción por tratamientos médicos, incluida la radiación y ciertas terapias farmacológicas7,8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, estudiar el sistema de sabor en el contexto de la regulación de las células madre del gusto y la diferenciación de la CVR es vital para comprender cómo mitigar o prevenir la disfunción del gusto.
Los ratones son un modelo tradicional para los estudios in vivo en la ciencia del gusto, ya que tienen un sistema de sabor organizado de manera similar a los humanos14,15,16. Sin embargo, los ratones no son ideales para estudios de alto rendimiento, ya que son costosos de mantener y requieren mucho tiempo para trabajar. Para superar esto, en los últimos años se han desarrollado métodos de cultivo de organoides in vitro. Los organoides del gusto se pueden generar a partir de tejido CVP nativo, un proceso en el que los organoides brotan a partir del epitelio CVP aislado de ratón cultivado ex vivo17. Estos organoides muestran un epitelio multicapa consistente con el sistema de sabor in vivo. Una forma más eficiente de generar organoides que no requiere cultivo cvP ex vivo fue desarrollada por Ren etal. en 201418. Adaptando los métodos y medios de cultivo desarrollados por primera vez para cultivar organoides intestinales, aislaron células progenitoras individuales de Lgr5-GFP+ de CVP de ratón y las enchaparon en gel de matriz19. Estas células individuales generan organoides linguales que proliferan durante los primeros 6 días de cultivo, comienzan a diferenciarse alrededor del día 8, y al final del período de cultivo contienen células epiteliales no gustales y los tres tipos deCVR 18,20. Hasta la fecha, se han publicado múltiples estudios que utilizan el sistema modelo de organoideslinguales 17,18,20,21,22; sin embargo, los métodos y las condiciones de cultivo utilizados para generar estos organoides varían entre las publicaciones (Tabla suplementaria 1). Por lo tanto, estos métodos se han ajustado y optimizado aquí para presentar un protocolo estandarizado detallado para el cultivo de organoides linguales derivados de LGR5+ progenitores de CVP de ratón adulto.
Los organoides linguales proporcionan un modelo único para estudiar los procesos biológicos celulares que impulsan el desarrollo y la renovación de las células gustales. A medida que las aplicaciones de los organoides linguales se expanden y más laboratorios avanzan hacia la utilización de modelos organoides in vitro, es importante que el campo se esfuerce por desarrollar y adoptar protocolos estandarizados para mejorar la reproducibilidad. El establecimiento de organoides linguales como una herramienta estándar dentro de la ciencia del gusto permitiría estudios de alto rendimiento que separan cómo las células madre individuales generan las células diferenciadas del sistema de sabor adulto. Además, los organoides linguales podrían emplearse para detectar rápidamente los medicamentos en busca de posibles impactos en la homeostasis del gusto, que luego podrían investigarse más a fondo en modelos animales. En última instancia, este enfoque mejorará los esfuerzos para diseñar terapias que mejoren la calidad de vida de los futuros receptores de medicamentos.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación acreditada por AAALAC de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado. Los ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilizados en este protocolo son de The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
NOTA: Los siguientes pasos deben completarse antes de comenzar para garantizar una progresión suave y oportuna del protocolo: establecer el baño de agua a 37 ° C, configurar la centrífuga a 4 ° C, hacer soluciones enzimáticas de inyección y disociación de las soluciones de stock de 10 mg / ml de dispasa, colagenasa y elastasa (consulte la Tabla de materiales),eliminar el gel de matriz del congelador de -20 ° C (~ 750 μL necesario para una placa de 48 pozos) y descongelar sumergiendo el vial en hielo para en un al menos 3-4 h, tubos de microcentrífuga pre-recubrimiento en FBS sin diluir balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante al menos 30 min (dos tubos de 2 ml para la recolección de tejidos, dos tubos de 1,5 ml para células disociadas y un tubo de 1,5 ml para la recolección de células individuales del clasificador celular; elimine el exceso de FBS antes de su uso).
1. Aislamiento del epitelio CVP
NOTA: Para obtener suficientes células LGR5+ para una placa completa de 48 pomos, recoja tres CVP Lgr5-EGFP en el mismo tubo y procese simultáneamente. Es importante destacar que cosecha y procesa el CVP de al menos un compañero de camada de tipo silvestre en paralelo en un tubo separado y utilícelo como un control de gating para establecer los parámetros de FACS (consulte Resultados representativos).
- Eutanasiar a los ratones con asfixia por CO2 de acuerdo con las regulaciones de la IACUC, seguido de un método secundario aprobado como la toracotomía bilateral, la dislocación cervical, la decapitación o la exsanguinación.
- Use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral. Cortar la lengua y recogerla en solución salina tamponada con fosfato (dPBS) estéril y helada de Dulbecco con Ca2+ y Mg2+.
- Retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia intermolar con una cuchilla de afeitar(Figura 1A,línea discontinua). Use una delicada toallita para tareas para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.
- Llene 1 ml de jeringa con 200-300 μL de solución enzimática inyectable (concentración final: 2 mg/ml de colagenasa tipo I y 5 mg/ml de dispasa II en Ca2+/Mg2+que contenga dPBS, diluida a partir de soluciones madre de 10 mg/ml) e inserte una aguja de 30 G x 1/2 justo encima de la eminencia intermolar(Figura 1B,flecha negra)hasta justo antes de la CVP(Figura 1B, Figura 1B), caja negra). Inyecte la solución enzimática debajo y en los bordes laterales de la CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes (lámina propia, músculo). Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua a medida que se realiza la inyección.
- Incubar la lengua en dPBS estériles libres de Ca2+/Mg2+a temperatura ambiente durante exactamente 33 min.
- Haga pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP usando tijeras de disección extra finas, y pele suavemente el epitelio levantándolo con fórceps finas. Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml pre-recubierto con FBS. Realice el recorte epitelial antes o después de separar el epitelio CVP(Figura 1C,D).
2. Disociación del epitelio CVP
NOTA: La disociación del epitelio CVP y el chapado se representan gráficamente en la Figura 2.
- Añadir el cóctel enzimático de disociación (concentración final: 2 mg/mL de colagenasa tipo I, 2 mg/ml de elastasa y 5 mg/ml de dispasa II en Ca2+/Mg2+que contiene dPBS, diluido a partir de soluciones madre de 10 mg/ml) a los tubos que contienen epitelios CVP pelados (200 μL por CVP). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 45 min. Vórtice brevemente cada 15 min.
NOTA: Precalentado 0.25% de Tripsina-EDTA en baño de agua a 37 °C durante los últimos 15 min de incubación del cóctel de enzimas. - Después de la incubación, el vórtice (tres pulsos) luego tritura con una pipeta Pasteur de vidrio durante 1 min. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante que contiene la primera colección de células disociadas, en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml recubiertos de FBS correspondientes al genotipo. Procese las piezas de tejido restantes como se describe en el paso 2.3. abajo.
- Girar el sobrenadante durante 5 min a 370 x g y 4 °C a las células de pellets.
- Retire el sobrenadante resultante y resuspante el pellet celular en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) y 1% FBS en Ca2+/ Mg2+-libre de PBS (50 μL por CVP)). Almacenar en hielo.
- Mientras lleva a cabo los pasos 2.2.1 y 2.2.2, disociar las piezas de tejido restantes del paso 2.2 agregando tripsina-EDTA al 0,25% precalentadas (200 μL por CVP) a los tubos originales de microcentrífuga de 2 ml e incube en un baño de agua de 37 °C durante 30 min. Vórtice brevemente cada 10 min.
- Después de la incubación, vórtice el tubo que contiene piezas de tejido (tres pulsos) y luego triture con una pipeta Pasteur de vidrio durante 1 min. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contienen células del paso 2.2.2. Deseche los tubos que contienen las piezas de tejido restantes.
- Girar los tubos con células disociadas durante 5 min a 370 x g y 4 °C a células de pellets.
- Retire los gránulos de células sobrenadantes y resuspend en FACS Buffer (100 μL por CVP). Almacenar en hielo.
- Pase las células a través de un filtro de malla de nylon de 30 μm y agregue DAPI(emisión de λ = 450 nm) a las mezclas celulares antes de FACS. Aislar células Lgr5-GFP+ vía FACS utilizando el canal de proteína fluorescente verde(excitación λ = 488 nm;emisión λ = 530 nm). Clasificar las células usando una boquilla de 100 μm en un tubo de microcentrífuga fresco recubierto de FBS de 1,5 ml que contenga 300 μL de Ca2+/ Mg2+ dPBS libre. Coloque las células sobre hielo hasta que se enchapar.
3. Recubrimiento de células Lgr5-EGFP
- Determine el volumen de suspensión celular LGR5+ recibido del citómetro de flujo.
- En función del número de celdas obtenidas del clasificador, calcule el número de células por μL. Luego, determine el volumen necesario para obtener el número deseado de células para el recubrimiento (usamos 200 células por pozo de una placa de 48 pozos) y transfiera ese volumen total de células suspendidas a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Gire el tubo durante 5 minutos a 370 x g y 4 °C a las células de pellet (el pellet puede no ser visible). Retire el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo.
- Resuspenda suavemente el pellet celular en la cantidad adecuada de gel de matriz (15 μL por pozo para placas de 48 pozos); pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para distribuir completamente las células en gel de matriz. Coloque 15 μL de gel de matriz/mezcla celular en el centro de cada pozo. Mantenga el tubo de la microcentrífuga sobre hielo en un tubo cónico de 50 ml durante el recubrimiento para evitar que el gel de matriz se gelifique. Continúe mezclando la mezcla de gel de matriz / célula a lo largo del revestimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo cada tres pozos para garantizar una distribución uniforme de las células a través de los pozos.
- Coloque la placa en la incubadora (37 ° C, 5% de CO2,~ 95% de humedad) durante 10 minutos para permitir la gelificación del gel de matriz. Luego, agregue 300 μL de medios WENRAS + Y27632 a temperatura ambiente a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora.
4. Mantenimiento de organoides
NOTA: Los organoides se cultivan en medios organoides convencionales (WENR) que comprenden EGF recombinante y 50% de medios acondicionados que contienen Wnt3a, Noggin y R-spondin23. Los fármacos A8301 y SB202190 se agregan durante los primeros 6 días del período de cultivo para optimizar el crecimiento (WENRAS media) (Figura 5), luego se eliminan para promover la diferenciación (WENR media)20. Y27632 se agrega durante los primeros 2 días de cultivo para promover la supervivencia. Las condiciones de los medios en relación con la línea de tiempo de la cultura se presentan en la Figura 4.
- Dos días después del chapado, retire los medios WENRAS + Y27632 de cada pozo utilizando una pipeta de 1 ml, asegurando que no haya contaminación cruzada. Agregue 300 μL de medios WENRAS por el lado del pozo para no interrumpir el gel de la matriz. Devuelva la placa a la incubadora.
- Cambiar los medios cada 2 días, utilizando los medios apropiados para la etapa de cultivo (Figura 4). Mantenga los organoides hasta el día 12, cuando los organoides estén listos para cosechar.
5. Procesamiento de ARN
- Recolección de organoides para ARN
- Coloque la placa de 48 pozos sobre hielo durante 30 minutos para despolimerizar el gel de matriz.
- Usando una pipeta de 1 ml, tire hacia arriba de los medios organoides; luego, a medida que el medio se devuelve al pozo, use la punta de la pipeta para rayar y romper aún más el gel de la matriz. Transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agrupando el contenido de tres pozos en un tubo. Centrifugar los tubos durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
- Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante de medios sin eliminar ningún organoide; luego, vuelva a girar los tubos durante 5 minutos a 300 x g a temperatura ambiente.
- Retire los medios restantes y resuspónda los organoides en tampón de lisis de 350 μL + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME por tampón de lisis de 1 ml). Coloque las muestras en hielo para la extracción inmediata de ARN o guárdelo a -80 °C.
- Análisis cuantitativo de RT-PCR
- Mida la cantidad de ARN mediante espectrofotómetro. Transcribir inversamente el ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc.
- Mezclar aDNc equivalente a ARN de 5 ng con cebadores de avance y retroceso prevalidados de 200 nM (Tabla 1) y Master Mix de PCR fluorescente. Ejecute la reacción qRT-PCR durante 40 ciclos a: 95 °C durante 15 s, luego a 60 °C durante 60 s.
6. Inmunohistoquímica
- Recolección y fijación de los organoides
- Coloque la placa de 48 pozos sobre hielo durante 30 minutos para aflojar el gel de matriz.
- Retire los medios organoides y agregue 400 μL de PBS helado a cada pozo. Luego, retire el PBS y agregue 400 μL de solución de recuperación celular helada a cada pozo. Balancear suavemente a 4 °C durante 30 min.
- Cubra una punta de pipeta de 1 ml con 1% de BSA en PBS, y pipetee suavemente el contenido del pozo hacia arriba y hacia abajo para romper el gel de matriz. Transfiera los organoides a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml colocado sobre hielo.
- Enjuague cada pozo con 300 μL PBS + 1% BSA y transfiera los organoides restantes a los tubos correspondientes. Retire Cell Recovery Solution/PBS + BSA de cada tubo. Agregue 400 μL de PBS helado, luego repita con otro enjuague de PBS helado.
- Retire el PBS y fije los organoides con 300 μL de PFA al 4% en frío (en 0,1 M PB) durante 20 min, incubando a temperatura ambiente. Retire el PFA y enjuague los organoides con PBS helado de 400 μL.
- Eliminar PBS; luego, agregue 400 μL PBS + 1% BSA. Conservar a 4 °C.
- Tinción por inmunofluorescencia
- Enjuague los organoides en 500 μL PBS + 1% BSA. Luego, incube los organoides en solución bloqueadora (5% de suero normal de cabra o burro, 1% de albúmina sérica bovina, Tritón X 100 al 0,3% en 1x PBS pH 7.3) durante 2 h, balanceándose suavemente a temperatura ambiente.
- Añadir la solución de anticuerpos primarios (anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo) y escríerla suavemente durante 3 noches a 4 °C.
- Lave los organoides 4x durante 1 h con PBS de 500 μL + Tritón al 0,2%, balanceándose suavemente a temperatura ambiente. Añadir solución secundaria de anticuerpos (anticuerpos secundarios diluidos en solución bloqueante) y organoides de roca durante la noche, protegidos de la luz, a 4 °C.
- Lave los organoides 3x durante 1 h con PBS de 500 μL + Tritón al 0,2%, protegido de la luz y balanceándose suavemente a temperatura ambiente. Incubar con DAPI diluido 1:10.000 en PB de 0,1 M durante 20 min, balanceando y cubriendo a temperatura ambiente.
- Lavar los organoides 3x durante 20 min con 0.1 M PB, balanceándolos suavemente y cubiertos a temperatura ambiente.
- Montaje deslizante de organoides para microscopía confocal invertida.
NOTA: Las imágenes paso a paso del proceso de montaje de diapositivas se muestran en la Figura 7.- Cree un perímetro cuadrado de ~ 1 mm de espesor de 22 x 22 mm de arcilla de modelado no tóxica en un portaobjetos de microscopio.
- Retire 0,1 M pb del tubo de la microcentrífuga y resuspenda suavemente los organoides en el medio de montaje de 100 μL de su elección; luego, transfiera al centro del cuadrado de arcilla.
- Llene el cuadrado de arcilla hasta que el medio de montaje esté casi en la parte superior. Luego, coloque la cubierta cuadrada de 22 x 22 mm sobre arcilla y presione firmemente hacia abajo en los lados de la cubierta para sellar. Deje que se cure de acuerdo con las instrucciones del fabricante (aquí, a temperatura ambiente durante 1-2 días) y guárdelo a 4 ° C.
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Representative Results
Los ratones tienen un CVP, ubicado posteriormente en la lengua, del cual se pueden aislar células madre LGR5+ (Figura 1A,caja negra). La inyección de una solución enzimática debajo y alrededor de la CVP(Figura 1B)da como resultado una ligera hinchazón del epitelio y la digestión del tejido conectivo. Se logra una digestión suficiente después de una incubación de 33 minutos, lo que permite una fácil separación del epitelio CVP del tejido subyacente. Al intentar pelar el epitelio CVP, los cortes deben hacerse a una distancia suficiente del CVP para garantizar que las zanjas no se interrumpan o dañen (Figura 1C). Esto también permite agarrar el epitelio usando forrceps sin dañar el CVP. El recorte del epitelio que rodea la CVP elimina las células no objetivo y aumenta la eficiencia de los siguientes pasos al disminuir la masa de tejido que se manipula(Figura 1D). Es importante comprobar que las dos zanjas(Figura 1C,flechas negras)estén presentes antes de añadir epitelio CVP al tubo de la microcentrífuga; El peeling exitoso de la CVP incluye parte de las glándulas y conductos de Von Ebner(Figura 1D,flechas negras). Si el epitelio pelado no contiene estas dos estructuras opacas, lo más probable es que el epitelio de la zanja se rompa debido a la digestión incompleta del tejido conectivo.
Para establecer la configuración adecuada de FACS para recolectar células Lgr5-EGFP, las células de CVP disociados se obtienen por separado de ratones de tipo salvaje y Lgr5-EGFP. Las células CVP de tipo salvaje se analizan primero para establecer parámetros de gating, un proceso en el que las poblaciones de células se clasifican dentro de la salida del diagrama de dispersión por características de interés24. Aquí, se utilizaron cuatro parámetros para identificar en última instancia las células para el revestimiento. El primer parámetro, la dispersión hacia adelante, filtra las partículas y los desechos en función del área de superficie detectada. Este parámetro elimina ~70% de todos los eventos detectados durante la ordenación (Figura 3). El parámetro width filtra aún más los eventos en función del tamaño para garantizar la selección de celdas individuales (singlets). Aproximadamente el 90% de los eventos son singletes(Figura 3). El marcador nuclear DAPI es absorbido por células muertas pero no vivas y, por lo tanto, permite clasificar las células muertas25. Este protocolo optimiza la viabilidad celular, ya que más del 90% de los eventos son células vivas(Figura 3). Por último, los parámetros de gFP se establecen por encima del nivel de autofluorescencia de las células de tipo silvestre. Las células de tipo salvaje no se recolectan; se utilizan únicamente como control de gating para la fluorescencia GFP. Con los parámetros de gating determinados a partir de la muestra de tipo salvaje, las células de la muestra Lgr5-EGFP se ejecutan a través del citómetro de flujo para ser clasificadas para su recolección. Las puertas se pueden ajustar al comienzo de la clasificación Lgr5-EGFP para acomodar la agrupación clara de ciertas poblaciones celulares, pero no deben cambiarse significativamente a mitad de la clasificación. Se encontró que la disociación de tres CVP Lgr5-EGFP agrupados produce ~ 500,000 células, incluido un promedio de 10,000 células GFP+.
Las condiciones adecuadas de los medios y el cultivo son vitales para el crecimiento óptimo y la diferenciación de los organoides. Estudios previos que utilizaron organoides linguales modelaron sus componentes medios después de los del campo organoide intestinal, incluidos Wnt3a, EGF, Noggin y R-spondin17,18,19,20,21,22. Sin embargo, cuando los organoides linguales se cultivan utilizando un método similar (medios WENR), los organoides no crecen de manera eficiente(Figura 5A). En los organoides intestinales humanos, los fármacos A8301 (un inhibidor de la señalización TGFß) y SB202190 (un inhibidor de la señalización de la MAPQuinasa p38) se utilizan para promover el crecimiento organoide26. De hecho, la adición de estos inhibidores (medios WENRAS) induce un crecimiento robusto de organoides linguales(Figura 5A). Curiosamente, la eliminación de estos inhibidores de los medios después de 6 días da como resultado una mayor expresión del marcador general de TRC Kcnq1,lo que sugiere que A8301 y SB202190 dificultan la diferenciación de las células gusta gusta gustares(Figura 5B). Así, se obtiene un crecimiento y diferenciación óptimos mediante el cultivo de organoides en medios WENRAS de los días 0-6 y medios WENR de los días 6-12(Figura 4, Figura 5),respectivamente.
La composición de tipo organoide se puede caracterizar por qRT-PCR o inmunohistoquímica. Los organoides maduros contienen tanto células gustales, marcadas por Kcnq1 y KRT8, como células epiteliales no gustales, marcadas por Krt13/ KRT13(Figura 6,8A). Esto sugiere que las células LGR5+ aisladas tienen una potencia in vitro similar a la que tienen in vivo ya que, en la lengua adulta, las células Lgr5-GFP+ producen linajes gustales y no gustales5. Además, Krt13 se expresa en niveles más altos que los 3 marcadores de TRC(Figura 6),lo que sugiere que los organoides están compuestos predominantemente de células epiteliales no gustales. De hecho, la cuantificación relativa de la expresióngénica 27 indica que Krt13 se expresa 50 veces más alto que el marcador general de TRC Kcnq1 (prueba tde Student, p = 0,0004). Esto es de esperar, ya que la lengua tiene una proporción similar de sabor versus epitelio nogustado 1. Los organoides expresan los tres tipos de TRC(Figura 6,8B, C). Las células de tipo I (marcadas por Entpd2)y las células amargas de tipo II (marcadas por Gnat3)están altamente expresadas en organoides gustativos, mientras que las células de tipo III de detección agria (marcadas por Car4)son menos comunes (Figura 6). Los TCR se distribuyen aleatoriamente en organoides(Figura 8)en lugar de en estructuras discretas de papilas gustativas observadas in vivo.
Figura 1: Lengua diseccionada y epitelio CVP pelado. (A) La lengua se disecciona, y la lengua anterior se extrae cortando justo antes de la eminencia intermolar (línea discontinua), dejando la lengua posterior, que incluye la CVP (caja negra) (B) Se inserta una aguja justo antes de la eminencia intermolar (flecha negra), y se inyecta una mezcla de enzimas debajo y en los bordes laterales de la CVP (caja negra). (C) Epitelio pelado sin recortar que rodea las zanjas CVP (flechas negras) y (D) epitelio CVP pelado recortado. Las glándulas y conductos de Von Ebner(D,flechas negras) son visibles después de la peladura exitosa de las trincheras. Barra de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo de generación de organoides linguales. La lengua se retira de los ratones Lgr5-EGFP. Los epitelios de zanja CVP (caja roja) se pelan del tejido conectivo subyacente y se disocian en células individuales. Las células GFP+ se aíslan y se chapan en gel de matriz a una densidad de 200 células por pozo en una placa de 48 pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gating para la clasificación celular activada por fluorescencia. (A) El control (células CVP de tipo salvaje) ejecutadas determina las compuertas FACS que eliminan los desechos y las células rotas a través de la dispersión hacia adelante, identifica los singletes a través del ancho de dispersión lateral, separa DAPIneg vivo de DAPI+ células muertas y establece el nivel de autofluorescencia de las células de tipo salvaje. (B) Las compuertas previamente determinadas se aplican a la ejecución experimental (células LGr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP) para aislar células Lgr5-EGFP+ libres de escombros, únicas, vivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cronología del cultivo de organoides linguales y medios requeridos. El inhibidor de ROCK Y27632 se agrega a los medios durante las primeras 48 h de cultivo para promover la supervivencia celular. Durante la fase de proliferación, los organoides se alimentan con un medio acondicionado que contiene A8301 y SB202190 (WENRAS) para optimizar el crecimiento. Estos medicamentos se retienen de los medios de comunicación (WENR) a partir del día 6 para promover la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:Los fármacos A8301 y SB202190 afectan el crecimiento y la diferenciación de los organoides. (A) Imágenes de campo brillante de organoides cultivados en medios WENR (día 0-12), medios WENRAS (día 0-12) o WENRAS (día 0-6), luego WENR (día 6-12). Las imágenes se capturaron en el día 2, el día 6 y el día 12 de cultivo utilizando software de imágenes en vivo. Barra de escala: 400 μm (B) La expresión génica relativa de un marcador global de TRC Kcnq1 se reduce significativamente cuando los fármacos A8301 y SB202190 están presentes durante la diferenciación organoide. Cada punto representa una réplica biológica, que incluyó tres pozos agrupados. El cambio medio en la expresión génica relativa (línea horizontal) se calculó promediando tres réplicas biológicas. Barras de error: ±SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Los organoides linguales expresan marcadores canónicos de células gustales. Cambio en el valor del umbral del ciclo (Ct) del marcador global de TRC Kcnq1,el marcador epitelial no gustativo citoqueratina 13(Krt13),el marcador TRC tipo I Entpd2,el marcador TRC amargo tipo II Gnat3y el marcador TRC agrio tipo III Car4,en comparación con el gen de limpieza Rpl19. Cada punto representa una réplica biológica, que incluyó tres pozos agrupados de una placa de 48 pozos. El cambio medio en el valor de Ct (línea horizontal) para cada marcador se calculó promediando tres réplicas biológicas. Prueba t de Student no emparejada,*p < 0.05. Barras de error: ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Montaje de organoides linguales para microscopía confocal invertida. ( A ) Se creaunacadena de ~ 1 mm de espesor de arcilla de modelado no tóxica. (B) La arcilla está esculpida como un cuadrado de ~ 20 mm x 20 mm en el centro de un portaobjetos de microscopio de 24 mm x 75 mm. (C) Una cubierta cuadrada de 22 mm x 22 mm sella organoides suspendidos en medio de montaje. Barra de escala: 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Inmunoetiquetado de organoides linguales intactos. Imágenes confocales de organoides fijos e inmunotaineds. (A) Sección óptica de un organoide teñido para el marcador epitelial sin sabor KRT13 (verde) y el marcador TRC general KRT8 (magenta). (B) Proyección máxima de una pila z confocal de un organoide teñido para el marcador celular glial tipo I NTPDase2 (verde) y KRT8 (magenta). (C) Proyección máxima de una pila Z confocal de dos organoides parcialmente mostrados (contornos de rayas blancas) y un organoide completo teñido para el marcador celular de detección agria tipo III CAR4 (verde), y el marcador celular de detección amarga tipo II GUSTDUCIN (magenta). Barra de escala: 100 μm para A, B y C. Marcador nuclear DAPI (azul, columna derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del gen | Imprimación delantera (5'-3') | Imprimación inversa (5'-3') | Número de evaluación | ||||||
| Coche4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas para la RT-PCR cuantitativa.
Tabla complementaria 1: Comparación de los componentes de los medios de cultivo de organoides linguales publicados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Aquí se informa que es un método eficiente y fácilmente repetible para cultivar, mantener y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos. Se encontró que el uso de tres CVP de ratones Lgr5-EGFP de 8 a 20 semanas de edad es suficiente para obtener ~ 10,000 células GFP+ para uso experimental, lo que resulta en 50 pomos chapados a una densidad de 200 células por pozo en placas de 48 pomos. La eliminación de los epitelios de zanja CVP se optimiza inyectando el epitelio lingual con solución de Dispasa II y colagenasa tipo I recién hecha, seguida de una incubación de 33 minutos. Sin embargo, un tiempo de incubación más corto, alícuotas de enzimas viejas, diferentes lotes o el uso de enzimas de diferentes fabricantes pueden resultar en una eliminación incompleta de la zanja. Por el contrario, un tiempo de incubación más largo causa una digestión excesiva del tejido, lo que resulta en la pérdida de la integridad del tejido del gusto. Después del peeling, se realizó un mayor enriquecimiento para las zanjas de CVP recortando el epitelio que rodea el CVP.
Es fundamental que todos los tubos de microcentrífuga utilizados durante el proceso de disociación y recolección estén recubiertos con FBS para evitar que el tejido y las células se adhieran a las paredes de plástico de los tubos, lo que reduce significativamente la recuperación de células aisladas (datos no mostrados). El uso de una capa ligera de FBS y la eliminación del exceso de líquido de los tubos antes de su uso minimiza los posibles efectos inhibitorios sobre la tripsina u otras enzimas.
Los organoides linguales se han cultivado con éxito a partir de tejido CVP disociado sin clasificación previa de células LGR5+ 17. Aunque este método da como resultado la formación de organoides, hemos encontrado que una proporción menor de estos organoides contienen células gustales en comparación con las cultivadas a partir de progenitores aislados (datos no mostrados). La clasificación de flujo para células Lgr5-EGFP+ enriquece a los progenitores competentes en el gusto, lo que resulta en una mayor proporción de organoides repletos de sabor. Actualmente, recogemos todas las células por encima del umbral de autofluorescencia GFP (Figura 3); sin embargo, es posible que los niveles de brillo de GFP estén asociados con la eficiencia variable de formación de organoides o la competencia gustativo. Esta hipótesis aún no se ha probado, pero es una vía prometedora para el trabajo futuro, ya que podría permitir un mayor enriquecimiento de los organoides que contienen células gustativos.
Es bien sabido que la densidad de chapado afecta a la eficiencia de la diferenciación organoide, y recomendamos que se determine la densidad óptima de chapado antes de la experimentación28. El tamaño y la profundidad de los pozos, así como el volumen de gel de la matriz, deben considerarse al establecer la densidad de revestimiento. Basándonos en nuestro trabajo preliminar (datos no mostrados), encontramos que en una placa de 48 pozos, 15 μL de gel de matriz y una densidad de recubrimiento de 200 células por pozo permite una expansión y diferenciación organoide eficiente de los tres tipos de TRC. Hemos encontrado que los organoides linguales se pueden cultivar con éxito y reproduciblemente en el extracto de membrana basal del factor de crecimiento reducido (RGF BME), una alternativa de gel de matriz sintética y menos costosa. Otras matrices alternativas también pueden apoyar el cultivo de organoides linguales, pero se requieren más pruebas para investigar esta posibilidad.
Durante el recubrimiento, las células recolectadas deben resuspendirse a fondo pero suavemente en gel de matriz mediante el pipeteo frecuente hacia arriba y hacia abajo para mantener la suspensión celular homogénea. El tubo que contiene la mezcla de gel de matriz celular también debe mantenerse en hielo durante todo el proceso de recubrimiento para evitar que el gel de matriz se gelifique en los lados del tubo. Estas medidas aseguran una distribución uniforme de las células a través de los pozos, produciendo resultados más reproducibles al emplatar las células a mano. En particular, los desarrollos recientes en tecnologías microfluídicas proporcionan opciones de alto rendimiento para la dispensación de células y es una herramienta prometedora para el trabajo futuro29.
Para evaluar la expresión génica en organoides cultivados, se encontró que era necesario agrupar al menos tres pozos para cada réplica biológica para obtener suficiente ARN y consistencia entre las réplicas(Figura 6). También se determinó que el lisado inmediato de los organoides extraídos de acuerdo con las instrucciones específicas del fabricante optimiza la calidad y la cantidad de ARN extraído. Si bien no se han probado aquí, otras opciones de almacenamiento, como la congelación instantánea o la resuspensión en reactivos de almacenamiento, también pueden preservar el rendimiento y la calidad del ARN.
Realizar inmunohistoquímica en organoides puede ser un desafío, ya que los anticuerpos primarios y secundarios deben penetrar en cualquier gel de matriz residual y en todo el epitelio organoide. En informes anteriores, los organoides se fijaron mientras aún estaban suspendidos en gel de matriz, lo que posteriormente requirió concentraciones extremadamente altas de solución primaria de anticuerpos para revelar la expresión deproteínas 17,18. Al igual que otros informes, se encontró que la eliminación de organoides del gel de matriz utilizando Cell Recovery Solution antes de la fijación aumenta la eficiencia de la tinción sin la necesidad de una alta concentración de anticuerpos30,31; sin embargo, la detección de algunos marcadores de células gusta gustadas, por ejemplo, CAR4, requiere una mayor concentración de anticuerpos. Además, la incubación de organoides en antiseos primarios durante 3 noches aumenta la probabilidad de unión a anticuerpos. Sin embargo, este método también puede aumentar la fluorescencia de fondo si los organoides no se lavan lo suficiente después de la inmunotinción. Es importante destacar que la solución de anticuerpos primarios diluidos se puede guardar y reutilizar con éxito una o más veces si se almacena durante menos de una semana (datos no mostrados). Para obtener imágenes óptimas, los organoides se montan colocando un codal en la parte superior de un perímetro de arcilla de modelado para preservar su estructura 3D. Colocar el vidrio de la cubierta directamente sobre el portaobjetos comprime y rompe organoides, impidiendo un análisis adecuado.
El cultivo de organoides es una técnica altamente aplicable y rentable. Algunas aplicaciones incluyen, pero no se limitan a, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos y el estudio de las células madre y la biología del desarrollo32. Por lo tanto, es crucial estandarizar los modelos organoides para permitir la reproducibilidad en todos los laboratorios. En el futuro, sería útil desarrollar un método estandarizado para el paso de organoides linguales que garantice que la potencia de las células madre gustadas se pueda propagar a través de pasajes en serie, reduciendo así la necesidad de animales adicionales para generar más organoides. Es importante destacar que, si bien los organoides linguales están compuestos de células epiteliales gustales y no gustales, la organización de estas células difiere en comparación con el sistema de sabor in vivo. Las discrepancias entre los organoides y el epitelio del gusto in vivo pueden deberse a los medios utilizados para el cultivo de organoides y / o porque los organoides carecen de interacción con el microambiente de las papilas gustativas, incluidas las señales importantes de los nervios gustativos y la lámina propia que se requieren para la formación y el mantenimiento de las papilas gustativas22,33,34,35. El trabajo futuro para incorporar nervios o vasculatura en el cultivo de organoides linguales, una estrategia que se está adoptando actualmente en otros sistemas organoides, podría permitir un modelado más preciso del epitelio del gusto in vivo 36,37.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Peter Dempsey y Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por proporcionar medios condicionados por WNR y discusiones valiosas. También agradecemos a los Recursos Compartidos de Tecnologías Celulares y Citometría de Flujo del Centro de Cáncer de la Universidad de Colorado, especialmente a Dmitry Baturin, por su experiencia en clasificación celular. Este trabajo fue financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, y NIH/NCI R21 CA236480 a LAB, y R21DC016131 y R21DC016131-02S1 a DG, y F32 DC015958 a EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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