Summary
يقدم البروتوكول طريقة لزراعة ومعالجة الأجهزة العضوية اللغوية المشتقة من الخلايا الجذعية المذاق المعزولة عن حليمة الذوق الخلفي للفئران البالغة.
Abstract
يتم التوسط في حاسة الذوق من قبل براعم الذوق على اللسان ، والتي تتكون من خلايا مستقبلات الذوق المتجددة بسرعة (TRCs). هذا الدوران المستمر مدعوم من خلايا السلف المحلية ويجعل وظيفة الذوق عرضة للاضطراب من قبل العديد من العلاجات الطبية ، والتي بدورها تؤثر بشدة على نوعية الحياة. وبالتالي، فإن دراسة هذه العملية في سياق العلاج من المخدرات أمر حيوي لفهم ما إذا كانت وظيفة سلف الذوق وإنتاج TRC تتأثر وكيفية ذلك. وبالنظر إلى المخاوف الأخلاقية والتوافر المحدود لأنسجة الذوق البشري ، فإن نماذج الماوس ، التي لديها نظام طعم مشابه للبشر ، تستخدم عادة. بالمقارنة مع أساليب الجسم الحي ، والتي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغير قابلة للدراسات عالية الإنتاجية ، يمكن أن تمكن الأجهزة اللغوية المورين من تشغيل التجارب بسرعة مع العديد من التكرارات وعدد أقل من الفئران. هنا، تم تكييف البروتوكولات المنشورة سابقا ويتم تقديم طريقة موحدة لتوليد الأجهزة العضوية الذوق من خلايا السلف الذوق معزولة عن الحليمة المحيطة (CVP) من الفئران البالغة. خلايا السلف الذوق في CVP التعبير LGR5 ويمكن عزلها عن طريق EGFP تفلور تنشيط فرز الخلايا (FACS) من الفئران التي تحمل Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 أليل. يتم صفيحة الخلايا المفرزة على نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قائم على هلام المصفوفة ومثقفة لمدة 12 يوما. الأجهزة العضوية توسيع لأول 6 أيام من فترة الثقافة عن طريق الانتشار ومن ثم الدخول في مرحلة التمايز، والتي تولد جميع أنواع الخلايا طعم ثلاثة جنبا إلى جنب مع الخلايا الظهارية غير الذوق. يمكن حصاد الأجهزة العضوية عند النضج في اليوم 12 أو في أي وقت أثناء عملية النمو للتعبير عن الحمض النووي الريبي والتحليل الكيميائي المناعي. توحيد أساليب الثقافة لإنتاج organoids لغوية من الخلايا الجذعية الكبار سوف يحسن استنساخ وتقدم organoids اللغوية كأداة قوية لفحص المخدرات في الكفاح من أجل مساعدة المرضى الذين يعانون من خلل الذوق.
Introduction
في القوارض ، يتم إيواء براعم الذوق اللغوي في حليمة فطرية موزعة بشكل مسبق ، حليمة مناجاة ثنائية الخلفي ، وكذلك حليمة محيطة واحدة (CVP) في خط الوسط الملصقات لللسان1. ويتكون كل برعم طعم من 50-100 قصيرة الأجل، وتجديد سريع خلايا مستقبلات الذوق (TRCs)، والتي تشمل نوع الأول مثل خلايا الدعم glial، نوع الخلايا الثانية التي تكشف الحلو، المر، وumami، والخلايا من النوع الثالث التي تكشف الحامض2،3،4. في CVP الماوس، LGR5+ الخلايا الجذعية على طول الصفيحة القاعدية تنتج جميع أنواع TRC وكذلك الخلايا الظهارية غير الذوق5. عند تجديد نسب الذوق ، يتم تحديد خلايا ابنة LGR5 لأول مرة كخلايا سلائف طعم ما بعد الميتوتيك (خلايا النوع الرابع) التي تدخل برعم الذوق وقادرة على التفريق في أي من أنواع TRCالثلاثة 6. دوران سريع من TRCs يجعل نظام الذوق عرضة للاضطراب من قبل العلاجات الطبية، بما في ذلك الإشعاع وبعض العلاجات الدوائية7،8،9،10،11،12،13. وبالتالي ، فإن دراسة نظام الذوق في سياق تنظيم الخلايا الجذعية الذوق والتمايز TRC أمر حيوي لفهم كيفية التخفيف من أو منع خلل الذوق.
الفئران هي نموذج تقليدي لدراسات الجسم الحي في علم الذوق حيث أن لديها نظام الذوق نظمت على نحو مماثل للبشر14،15،16. ومع ذلك ، فإن الفئران ليست مثالية لدراسات الإنتاجية العالية ، لأنها مكلفة للحفاظ عليها وتستغرق وقتا طويلا للعمل معها. للتغلب على ذلك، تم تطوير أساليب في المختبر زراعة الجهازية في السنوات الأخيرة. يمكن أن تولد الأجهزة العضوية الذوق من الأنسجة CVP الأصلية، وهي العملية التي الأجهزة برعم قبالة من ظهارة CVP الماوس معزولة مثقف ex vivo17. هذه organoids عرض ظهارة متعددة الطبقات تتفق مع نظام الذوق في الجسم الحي. تم تطوير طريقة أكثر كفاءة لتوليد organoids التي لا تتطلب ثقافة CVP الجسم الحي السابق من قبل رين وآخرون. تكييف أساليب والثقافة وسائل الإعلام وضعت لأول مرة لتنمو organoids المعوية، فإنها عزل Lgr5-GFP واحد+ خلايا السلف من CVP الماوس ومطلي لهم في هلام مصفوفة19. ولدت هذه الخلايا وحيدة organoids اللغوية التي تتكاثر خلال الأيام ال 6 الأولى من الثقافة، وتبدأ في التفريق حول اليوم 8، وبحلول نهاية فترة الثقافة تحتوي على خلايا الظهارية غير الذوق وجميع أنواع TRCالثلاثة 18،20. حتى الآن، وقد نشرت دراسات متعددة باستخدام نظام نموذج organoid لغوي17،18،20،21،22؛ ومع ذلك، تختلف الأساليب والظروف الثقافية المستخدمة لتوليد هذه الأجهزة العضوية عبر المنشورات(الجدول التكميلي 1). وهكذا، تم تعديل هذه الأساليب وتحسينها هنا لتقديم بروتوكول موحد مفصل لثقافة organoids اللغوية المستمدة من LGR5+ السلف من CVP الماوس الكبار.
توفر الأجهزة العضوية اللغوية نموذجا فريدا لدراسة العمليات البيولوجية للخلايا التي تقود تطور خلايا الذوق وتجديدها. مع توسع تطبيقات الأجهزة العضوية اللغوية والتحرك نحو استخدام المزيد من المختبرات في نماذج الجهازية المختبرية ، من المهم أن يسعى المجال إلى تطوير واعتماد بروتوكولات موحدة لتحسين القابلية للاستنساخ. إن إنشاء أعضاء لغوية كأداة قياسية في علم الذوق من شأنه أن يمكن دراسات الإنتاجية العالية التي تتباعد كيف تولد الخلايا الجذعية المفردة الخلايا المتمايزة لنظام ذوق البالغين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجهزة اللغوية لفحص الأدوية بسرعة للتأثيرات المحتملة على التوازن الذوقي ، والتي يمكن بعد ذلك التحقيق فيها بشكل أكثر شمولا في النماذج الحيوانية. وسيعزز هذا النهج في نهاية المطاف الجهود الرامية إلى ابتكار علاجات تحسن نوعية حياة متلقي الأدوية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية في منشأة معتمدة من AAALAC وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، وقانون رعاية الحيوان ، وسياسة خدمة الصحة العامة ، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في حرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول هي من مختبر جاكسون، المخزون رقم 008875.
ملاحظة: يجب إكمال الخطوات التالية قبل البدء لضمان التقدم السلس وفي الوقت المناسب للبروتوكول: تعيين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية، تعيين الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية، وجعل الحقن وحلول إنزيم التفكك من 10 ملغم / مل ديسباس، Collagenase، وحلول المخزون Elastase (انظر جدول المواد)،وإزالة هلام مصفوفة من -20 درجة مئوية الفريزر (~ 750 ميكرولتر اللازمة للوحة 48 بئر) وذوبان عن طريق غمر القارورة في الجليد لفي ما لا يقل عن 3-4 ساعة، أنابيب الطرد المركزي الدقيق قبل معطف في FBS غير مخففة عن طريق هزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل (أنبوبين 2 مل لجمع الأنسجة، واثنين من أنابيب 1.5 مل للخلايا المفككة، وأنبوب واحد 1.5 مل لجمع خلايا واحدة من فرز الخلايا؛ إزالة FBS الزائدة قبل الاستخدام).
1. عزل ظهارة CVP
ملاحظة: للحصول على ما يكفي LGR5+ خلايا لوحة كاملة 48 جيدا، وجمع ثلاثة LGR5-EGFP CVPs في نفس الأنبوب وعملية في وقت واحد. الأهم من ذلك، حصاد ومعالجة CVP من نوع واحد على الأقل البرية littermate بالتوازي في أنبوب منفصل والاستفادة منه كتحكم في gating لتعيين المعلمات FACS (انظر النتائج التمثيلية).
- قتل الفئران مع الاختناق CO2 وفقا للوائح IACUC، تليها طريقة ثانوية معتمدة مثل استئصال الصدر الثنائي، خلع عنق الرحم، قطع الرأس، أو exsanguination.
- استخدام مقص تشريح معقم كبير لقطع الخدين وكسر الفك. رفع اللسان وقطع الفرينوم اللغوي لفصل اللسان عن أرضية تجويف الفم. قطع اللسان وجمعه في العقيمة الجليد الباردة دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (dPBS) مع Ca2 + و Mg2 +.
- إزالة وتجاهل اللسان الأمامي عن طريق قطع فقط الأمامية من سماحة بين النجوم مع شفرة حلاقة (الشكل 1A، خط متقطع ). استخدام مسح مهمة حساسة لإزالة أي شعر والسائل الزائد من اللسان الخلفي.
- ملء 1 مل حقنة مع 200-300 ميكرولتر من محلول إنزيم الحقن (التركيز النهائي: 2 ملغم / مل نوع I Collagenase و 5 ملغ / مل Dispase II في Ca2 +/ Mg2 +- تحتوي على dPBS ، مخفف من 10 ملغ / مل حلول الأسهم) وإدراج إبرة 30 G × 1/2 فقط فوق سماحة بين الكائنات(الشكل 1B، السهم الأسود)حتى مجرد الأمامية إلى CVP ( الشكل1B، الصندوق الأسود). حقن محلول الانزيم تحت وعلى الحواف الجانبية للCVP بين الظهارة والأنسجة الكامنة (الصفيحة البربريا, العضلات). سحب الحقنة ببطء وباستمرار من اللسان كما يتم تنفيذ الحقن.
- احتضان اللسان في Ca2+/ Mg2 +خالية dPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 33 دقيقة على وجه التحديد.
- إجراء تخفيضات صغيرة في الظهارة ثنائيا وفقط الأمامية إلى CVP باستخدام مقص تشريح غرامة اضافية، وتقشير بلطف الظهارة عن طريق رفعه مع ملقط غرامة. بمجرد أن تكون ظهارة الخندق خالية من النسيج الضام الأساسي ، ضعه في أنبوب طرد دقيق فارغ سعة 2 مل مغلف مسبقا ب FBS. هل التشذيب الظهاري قبل أو بعد فصل ظهارة CVP (الشكل 1C، D).
2. تفكك ظهارة CVP
ملاحظة: يتم تمثيل فصل ظهارة CVP والطلاء بيانيا في الشكل 2.
- إضافة كوكتيل إنزيم الفصام (التركيز النهائي: 2 ملغم/مل من النوع I Collagenase، 2 ملغم/مل إيلاستاز، و5 ملغم/مل ديسباس الثاني في Ca2+/Mg2+-تحتوي على dPBS، مخففة من 10 ملغم/مل من حلول المخزون) إلى أنابيب تحتوي على ظهارة CVP مقشرة (200 ميكرولتر لكل CVP). احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة كل 15 دقيقة.
ملاحظة: ما قبل الحرب 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 °C حمام مائي خلال آخر 15 دقيقة من حضانة كوكتيل انزيم. - بعد الحضانة، دوامة (ثلاث نبضات) ثم triturate مع ماصة باستور الزجاج لمدة 1 دقيقة. بعد أن تستقر قطع الأنسجة ، ماصة الناسخة التي تحتوي على المجموعة الأولى من الخلايا المفككة ، إلى أنابيب طرد ميكروروكتري 1.5 مل جديدة مغلفة ب FBS تتوافق مع النمط الجيني. معالجة قطع الأنسجة المتبقية كذلك كما هو موضح في الخطوة 2.3. ادناه.
- تدور supernatant لمدة 5 دقائق في 370 × ز و 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
- إزالة supernatant الناتجة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في فلورسينس تنشيط فرز الخلية (FACS) العازلة (1 mM EDTA، 25 mM HEPES (الرقم الحموضة 7.0) و 1٪ FBS في كا2 +/ ملغ2 +- برنامج تلفزيوني مجاني (50 ميكرولتر لكل CVP)). تخزين على الجليد.
- أثناء تنفيذ الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2، قم بفك قطع الأنسجة المتبقية من الخطوة 2.2 بإضافة أنابيب طرد مركزي دقيقة مسبقة الدفء بنسبة 0.25٪ من التريبسين-EDTA (200 ميكرولتر لكل CVP) إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق الأصلية سعة 2 مل واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة كل 10 دقيقة.
- بعد الحضانة، دوامة الأنبوب الذي يحتوي على قطع الأنسجة (ثلاث نبضات) ثم triturate مع ماصة باستور الزجاج لمدة 1 دقيقة. بعد أن تستقر قطع الأنسجة، تقوم ماصة المصبوبة العملاقة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل التي تحتوي على خلايا من الخطوة 2.2.2. تجاهل الأنابيب التي تحتوي على قطع الأنسجة المتبقية.
- تدور الأنابيب مع الخلايا المفككة لمدة 5 دقائق في 370 × ز و 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
- إزالة الكريات الخلية الفائقة وإعادة الإنفاق في المخزن المؤقت FACS (100 ميكرولتر لكل CVP). تخزين على الجليد.
- تمرير الخلايا من خلال مرشح شبكة النايلون 30 ميكرومتر وإضافة DAPI (λالانبعاثات = 450 نانومتر) إلى خليط الخلية قبل FACS. عزل Lgr5-GFP+ الخلايا عبر FACS باستخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر (λالإثارة = 488 نانومتر؛λ الانبعاثات = 530 نانومتر). فرز الخلايا باستخدام فوهة 100 ميكرومتر في أنبوب طارد دقيق جديد مغلف ب FBS 1.5 مل يحتوي على 300 ميكرولتر من Ca2 +/ Mg2 + dPBS مجانا. ضع الخلايا على الجليد حتى الطلاء.
3. طلاء Lgr5-EGFP الخلايا
- تحديد حجم LGR5+ تعليق الخلية الواردة من تدفق الخلايا.
- استنادا إلى عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من الفرز، احسب عدد الخلايا لكل ميكرولتر. ثم، تحديد حجم اللازمة للحصول على العدد المطلوب من الخلايا للطلاء (نستخدم 200 خلية لكل بئر من لوحة 48 جيدا) ونقل هذا الحجم الإجمالي من الخلايا المعلقة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد.
- تدور أنبوب لمدة 5 دقائق في 370 × ز و 4 درجة مئوية لخلايا بيليه (بيليه قد لا تكون مرئية). إزالة supernatant ووضع الأنبوب على الجليد.
- إعادة إنفاق بيليه الخلية بلطف في الكمية المناسبة من هلام المصفوفة (15 ميكرولتر لكل بئر لصفائح 48 بئرا)؛ ماصة صعودا وهبوطا بلطف لتوزيع الخلايا بدقة في هلام مصفوفة. ضع 15 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة / الخلية في وسط كل بئر. الحفاظ على أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد في أنبوب مخروطي 50 مل أثناء الطلاء لمنع هلام مصفوفة من التبلور. الاستمرار في خلط مصفوفة هلام / خليط الخلية في جميع أنحاء الطلاء عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا كل ثلاثة آبار لضمان توزيع متساو للخلايا عبر الآبار.
- ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، ~ 95٪ رطوبة) لمدة 10 دقائق للسماح بجل المصفوفة. ثم، إضافة 300 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة WENRAS + Y27632 وسائل الإعلام إلى كل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة.
4. صيانة الجهاز
ملاحظة: تزرع Organoids في الوسائط العضوية التقليدية (WENR) التي تضم EGF المؤتلف و 50٪ وسائط مكيفة تحتوي على Wnt3a و Noggin و R-spondin23. يتم إضافة الأدوية A8301 و SB202190 لأول 6 أيام من فترة الثقافة لتحسين النمو (وسائل الإعلام WENRAS) (الشكل 5)، ثم إزالتها لتعزيز التمايز (WENR وسائل الإعلام)20. يضاف Y27632 لأول يومين من الثقافة لتعزيز البقاء على قيد الحياة. يتم عرض شروط الوسائط المتعلقة بالجدول الزمني للثقافة في الشكل 4.
- بعد يومين من الطلاء، قم بإزالة وسائط WENRAS + Y27632 من كل بئر باستخدام ماصة 1 مل، مما يضمن عدم وجود تلوث متقاطع. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام WENRAS أسفل الجانب من البئر لعدم تعطيل هلام مصفوفة. أعد الطبق إلى الحاضنة.
- تغيير وسائل الإعلام كل يومين، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المناسبة لمرحلة الثقافة (الشكل 4). الحفاظ على organoids حتى اليوم 12، عندما تكون الأجهزة العضوية جاهزة للحصاد.
5. تجهيز الحمض النووي الريبي
- حصاد الأجهزة العضوية للجيش الملكي النيبالي
- ضع طبق 48 جيدا على الجليد لمدة 30 دقيقة لإزالة غمر هلام المصفوفة.
- باستخدام ماصة 1 مل، سحب ما يصل وسائل الإعلام organoid. ثم، كما يتم إرجاع وسائل الإعلام إلى البئر، واستخدام غيض من ماصة إلى الصفر وتفكك مزيد من هلام مصفوفة. نقل المحتويات إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق، وتجميع محتويات ثلاثة آبار في أنبوب واحد. طرد الأنابيب لمدة 5 دقائق في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة أكبر قدر ممكن من وسائل الإعلام العملاقة دون إزالة أي organoids؛ ثم، تدور أسفل أنابيب مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الوسائط المتبقية وإعادة إنفاق الأجهزة العضوية في 350 μL تحلل العازلة + β ميركابتوثانول (βME) (10 ميكرولتر βME لكل 1 مل تحلل العازلة). ضع العينات على الجليد لاستخراج الحمض النووي الريبي الفوري أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
- تحليل ال RT-PCR الكمي
- قياس كمية الحمض النووي الريبي عن طريق مطياف. عكس نسخ الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة توليف cDNA.
- مزيج cDNA يعادل 5 نانوغرام الجيش الملكي النيبالي مع 200 nM التحقق مسبقا إلى الأمام وعكس التمهيديات (الجدول 1) والفلورسنت PCR ماجستير ميكس. تشغيل رد فعل qRT-PCR لمدة 40 دورة في: 95 درجة مئوية لمدة 15 s، ثم 60 درجة مئوية لمدة 60 s.
6. الكيمياء المناعية
- حصاد وإصلاح الأجهزة العضوية
- ضع طبق 48 جيدا على الجليد لمدة 30 دقيقة لتخفيف هلام المصفوفة.
- إزالة الوسائط organoid وإضافة 400 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. ثم، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 400 ميكرولتر من الجليد الباردة حل استعادة الخلايا إلى كل بئر. صخرة بلطف في 4 °C لمدة 30 دقيقة.
- معطف تلميح ماصة 1 مل مع 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني، ومحتويات pipet بلطف من البئر صعودا وهبوطا لتفريق هلام مصفوفة. نقل organoids إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وضعت على الجليد.
- شطف كل بئر مع 300 μL PBS + 1٪ BSA ونقل أي organoids المتبقية إلى الأنابيب المقابلة. إزالة حل استعادة الخلية / برنامج تلفزيوني + BSA من كل أنبوب. إضافة 400 ميكروغرام من الجليد الباردة PBS، ثم كرر مع آخر الجليد الباردة PBS شطف.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح organoids مع 300 ميكرولتر الجليد الباردة 4٪ PFA (في 0.1 M PB) لمدة 20 دقيقة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة. إزالة PFA وشطف organoids مع 400 ميكرولتر الجليد الباردة PBS.
- إزالة برنامج تلفزيوني; ثم، إضافة 400 μL PBS + 1٪ BSA. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تلطيخ الفلورة المناعية
- شطف organoids في 500 μL PBS + 1٪ BSA. ثم، احتضان organoids في حل حجب (5٪ الماعز العادي أو مصل الحمير، 1٪ ألبوم مصل البقر، 0.3٪ تريتون X 100 في 1x PBS pH 7.3) لمدة 2 ساعة، هزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الحل الأساسي للأجسام المضادة (الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل حجب) والصخور بلطف لمدة 3 ليال في 4 درجة مئوية.
- غسل organoids 4x ل 1 ساعة مع 500 μL PBS + 0.2٪ تريتون، هزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة. إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة الثانوية المخففة في حل حجب) والأعضاء الصخرية بين عشية وضحاها، محمية من الضوء، في 4 درجة مئوية.
- غسل organoids 3x ل 1 ساعة مع 500 μL PBS + 0.2٪ تريتون، محمية من الضوء وهزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة. حضانة مع DAPI المخفف 1:10،000 في 0.1 M PB لمدة 20 دقيقة، هزاز ومغطاة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل organoids 3x لمدة 20 دقيقة مع 0.1 M PB، هزاز بلطف ومغطاة في درجة حرارة الغرفة.
- تصاعد الشريحة من organoids للمجهر الكونفوجال مقلوب.
ملاحظة: تظهر الصور خطوة بخطوة لعملية تصاعد الشرائح في الشكل 7.- إنشاء ~ 1 مم سميكة 22 × 22 ملم محيط مربع من الطين النمذجة غير سامة على شريحة المجهر.
- إزالة 0.1 M PB من أنبوب الطرد المركزي الدقيق, و العضويات resuspend بلطف في 100 ميكرولتر تصاعد المتوسطة من الاختيار; ثم، نقل إلى وسط الساحة الطينية.
- ملء مربع الطين حتى المتوسطة المتصاعدة تقريبا إلى الأعلى. ثم ضع 22 × 22 مم مربع يغطي على الطين واضغط لأسفل بقوة على جانبي غطاء لختم. السماح لها علاج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (هنا، ودرجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 أيام) وتخزينها في 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفئران لديها CVP واحد، وتقع الخلفي على اللسان، والتي يمكن عزل LGR5+ الخلايا الجذعية (الشكل 1A،الصندوق الأسود). حقن محلول إنزيم تحت وحول CVP(الشكل 1B)يؤدي إلى تورم طفيف في الظهارة وهضم النسيج الضام. يتم تحقيق هضم كاف بعد حضانة 33 دقيقة ، مما يسمح بفصل ظهارة CVP بسهولة عن الأنسجة الأساسية. عند محاولة تقشير ظهارة CVP ، يجب إجراء تخفيضات على مسافة كافية من CVP لضمان عدم تعطيل الخنادق أو تلفها(الشكل 1C). وهذا يمكن أيضا واحد لقبضة الظهارة باستخدام ملقط دون الإضرار CVP. تقليم الظهارة المحيطة CVP يزيل الخلايا غير المستهدفة ويزيد من كفاءة الخطوات التالية عن طريق تقليل كتلة الأنسجة التي يجري التلاعب بها(الشكل 1D). من المهم التحقق من أن الخندقين(الشكل 1C، الأسهم السوداء)موجودان قبل إضافة ظهارة CVP إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق . تقشير ناجحة من CVP يتضمن جزءا من الغدد فون Ebner والقنوات (الشكل 1D، الأسهم السوداء). إذا لم تحتوي الظهارة المقشرة على هذين الهيكلين المبهمين ، فمن المرجح أن تمزق ظهارة الخندق بسبب الهضم غير المكتمل للأنسجة الضامة.
لإنشاء إعدادات FACS المناسبة لجمع خلايا Lgr5-EGFP ، يتم الحصول على خلايا من CVPs المنفصلة بشكل منفصل من النوع البري والفئران Lgr5-EGFP. يتم تحليل خلايا CVP البرية من النوع الأول لإنشاء معلمات gating ، وهي عملية يتم فيها تصنيف مجموعات الخلايا داخل إخراج scatterplot حسب خصائصالاهتمام 24. هنا، تم استخدام أربعة معلمات لتحديد الخلايا في نهاية المطاف للطلاء. المعلمة الأولى، مبعثر إلى الأمام، مرشحات من الجسيمات والحطام على أساس مساحة السطح المكتشفة. تزيل هذه المعلمة ~ 70٪ من كافة الأحداث التي تم اكتشافها أثناء الفرز (الشكل 3). المعلمة width كذلك تصفية الأحداث استنادا إلى الحجم لضمان تحديد الخلايا المفردة (مفرد). حوالي 90٪ من الأحداث هي singlets (الشكل 3). يتم تناول العلامة النووية DAPI من قبل الخلايا الميتة ولكن ليس الحية ، وبالتالي يسمح للخلايا الميتة ليتم فرزها25. يعمل هذا البروتوكول على تحسين صلاحية الخلية، حيث أن أكثر من 90٪ من الأحداث هي خلايا حية(الشكل 3). وأخيرا، يتم تعيين المعلمات GFP gating فوق مستوى autofluorescence من الخلايا البرية نوع. لا يتم جمع خلايا النوع البرية. يتم استخدامها فقط كتحكم في غاينغ لفلورسينس GFP. مع معلمات gating المحددة من عينة النوع البرية ، يتم تشغيل الخلايا من عينة Lgr5-EGFP بعد ذلك من خلال مقياس التدفق الخلوي ليتم فرزها لجمعها. يمكن تعديل البوابات في بداية فرز Lgr5-EGFP لاستيعاب التجمع الواضح لبعض مجموعات الخلايا ولكن لا ينبغي تغييرها بشكل كبير في منتصف النوع. ووجد أن تفكك ثلاثة تجمع Lgr5-EGFP CVPs تسفر عن ~ 500،000 الخلايا، بما في ذلك ما متوسطه 10،000 GFP+ الخلايا.
وسائل الإعلام المناسبة وظروف الثقافة أمر حيوي للنمو الأمثل والتمايز من organoids. الدراسات السابقة التي تستخدم organoids لغوية على غرار مكونات وسائل الإعلام الخاصة بهم بعد تلك من مجال الجهاز المعوي، بما في ذلك Wnt3a، EGF، Noggin، وR-spondin17،18،19،20،21،22. ومع ذلك ، عندما يتم استزراع الأجهزة العضوية اللغوية باستخدام طريقة مماثلة (وسائط WENR) ، لا تنمو الأعضاء بكفاءة(الشكل 5A). في الأجهزة المعوية البشرية ، يتم استخدام الأدوية A8301 (مثبط إشارات TGFß) و SB202190 (مثبط إشارات P38 MAPKinase) لتعزيز نمو الجهازية26. في الواقع، إضافة هذه المثبطات (وسائل الإعلام WENRAS) يحفز النمو القوي من organoids لغوية(الشكل 5A). ومن المثير للاهتمام، وإزالة هذه المثبطات من وسائل الإعلام بعد 6 أيام النتائج في التعبير عن أعلى من علامة TRC العام Kcnq1، مما يشير إلى A8301 وSB202190 تعوق التمايز خلية الذوق(الشكل 5B). وهكذا، يتم الحصول على النمو الأمثل والتمايز عن طريق زرع organoids في وسائل الإعلام WENRAS من أيام 0-6 و WENR وسائل الإعلام من أيام 6-12 (الشكل 4، الشكل 5، على التوالي.
يمكن أن يتميز تكوين نوع الخلية العضوية ب qRT-PCR أو الكيمياء المناعية. تحتوي الأجهزة العضوية الناضجة على كل من خلايا الذوق ، التي تتميز ب Kcnq1 و KRT8 ، والخلايا الظهارية غير المذاق ، التي تتميز Krt13/ KRT13 (الشكل 6، 8A). وهذا يشير إلى أن خلايا LGR5+ المعزولة لها قوة مماثلة في المختبر كما تفعل في الجسم الحي منذ ذلك الحين ، في لسان الكبار ، تنتج Lgr5-GFP+ الخلايا كلا من الأنساب الذوقية وغيرالذوقية 5. علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن Krt13 بمستويات أعلى من جميع علامات TRC 3 (الشكل 6) ، مما يشير إلى أن الأعضاء تتكون في الغالب من خلايا ظهارية غير مذوق. في الواقع، يشير القياس الكمي النسبي للتعبير الجيني27 إلى أن Krt13 يعبر عنه أعلى ب 50x من علامة TRC العامة Kcnq1 (اختبار الطالب t،p = 0.0004). ومن المتوقع أن هذا، كما اللسان لديه نسبة مماثلة من الذوق مقابل ظهارة غير الذوق1. Organoids التعبير عن جميع أنواع TRC الثلاثة (الشكل 6، 8B ، C). يتم التعبير عن الخلايا من النوع الأول (التي تتميز Entpd2)والخلايا من النوع الثاني المريرة (التي تتميز Gnat3)بشكل كبير في الأجهزة العضوية الذوق ، في حين أن الخلايا الحامضة الاستشعار من النوع الثالث (التي تتميز Car4)هي أقل شيوعا (الشكل 6). يتم توزيع TRCs عشوائيا في organoids (الشكل 8) بدلا من هياكل برعم الذوق المنفصلة التي لوحظت في الجسم الحي.
الشكل 1: تشريح اللسان وظهارة CVP مقشر. (أ)يتم تشريح اللسان ، ويتم إزالة اللسان الأمامي عن طريق قطع فقط الأمامية من سماحة بين ال النجوم (خط متقطع) ، وترك اللسان الخلفي ، والذي يتضمن CVP (الصندوق الأسود) (ب) يتم إدخال إبرة فقط الأمامي إلى سماحة بين الكائنات (السهم الأسود) ، ويتم حقن خليط الانزيم أدناه و إلى الحواف الجانبية للCVP (الصندوق الأسود). (ج) ظهارة مقشرة غير مشذبة تحيط خنادق CVP (الأسهم السوداء) و (D) قلصت ظهارة CVP مقشر. فون Ebner الغدد والقنوات(D، السهام السوداء) مرئية بعد تقشير ناجحة من الخنادق. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل من توليد organoid لغوي. تتم إزالة اللسان من Lgr5-EGFP الفئران. يتم تقشير ظهارة خندق CVP (الصندوق الأحمر) من النسيج الضام الأساسي وينقسم إلى خلايا واحدة. يتم عزل GFP+ الخلايا ومطلية في هلام مصفوفة في كثافة 200 خلية لكل بئر في لوحة 48 جيدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:غاتينج لفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس. (أ)التحكم (البرية نوع خلايا CVP) تشغيل يحدد بوابات FACS التي تقضي على الحطام والخلايا المكسورة عن طريق مبعثر إلى الأمام، ويحدد المفردات عبر عرض مبعثر الجانب، يفصل DAPIneg يعيش من DAPI+ الخلايا الميتة، ويحدد مستوى autofluorescence من الخلايا نوع البرية. (ب)يتم تطبيق بوابات محددة سابقا لتشغيل التجريبية (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP الخلايا) لعزل خالية من الحطام، واحد، ويعيش، Lgr5-EGFP+ الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الجدول الزمني لثقافة اللغة organoid ووسائل الإعلام المطلوبة. يتم إضافة مثبط ROCK Y27632 إلى وسائل الإعلام لأول 48 ساعة من الثقافة لتعزيز بقاء الخلية. خلال مرحلة الانتشار، يتم تغذية الأجهزة العضوية المتوسطة مكيفة تحتوي على A8301 و SB202190 (WENRAS) لتحسين النمو. يتم حجب هذه الأدوية عن وسائل الإعلام (WENR) ابتداء من اليوم السادس لتعزيز التمايز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الأدوية A8301 و SB202190 تؤثر على نمو الجهازية والتمايز. (أ) صور برايتفيلد من organoids نمت في وسائل الإعلام WENR إما (اليوم 0-12)، وسائل الإعلام WENRAS (اليوم 0-12)، أو WENRAS (اليوم 0-6)، ثم WENR (اليوم 6-12). تم التقاط الصور في اليوم الثاني واليوم السادس واليوم الثاني عشر للثقافة باستخدام برامج التصوير الحي. مقياس شريط: 400 ميكرومتر(ب)يتم تقليل التعبير الجيني النسبي لعلامة TRC العالمية Kcnq1 بشكل كبير عندما تكون الأدوية A8301 و SB202190 موجودة أثناء التمايز العضوي. وتمثل كل نقطة تكرارا بيولوجيا واحدا، شمل ثلاث آبار مجمعة. تم حساب متوسط التغير في التعبير الجيني النسبي (الخط الأفقي) بمتوسط ثلاث نسخ بيولوجية متماثلة. أشرطة الخطأ: ±SD. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: organoids اللغوية التعبير عن علامات الخلايا الذوق الكنسي. تغيير في عتبة دورة (Ct) قيمة العلامة العالمية TRC Kcnq1, علامة الظهارية غير الذوق cytokeratin 13 (Krt13), نوع I TRC علامة Entpd2, نوع الثاني علامة TRC المريرة Gnat3, ونوع الثالث الحامض TRC علامة Car4, بالمقارنة مع التدبير المنزلي الجين Rpl19. وتمثل كل نقطة تكرارا بيولوجيا واحدا، شمل ثلاثة آبار مجمعة من صفيحة من 48 بئرا. تم حساب متوسط التغير في قيمة Ct (الخط الأفقي) لكل علامة بمتوسط ثلاث نسخ بيولوجية متماثلة. غير مدفوعة الطالب راختبار ، * ع < 0.05. أشرطة الخطأ: ± SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تركيب الأجهزة العضوية اللغوية للمجهر الكونفوجال المقلوب. (A) يتم إنشاء سلسلة سميكة ~ 1 مم من طين النمذجة غير السامة. (ب)الطين منحوت ك ~ 20 ملم × 20 ملم مربع في وسط شريحة المجهر 24 ملم × 75 ملم. (C) A 22 مم × 22 مم مربع يغطي الأختام organoids علقت في تصاعد المتوسطة. شريط المقياس: 10 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8:الالتباس المناعي للأعضاء اللغوية السليمة. صور كونفوجكال من الأجهزة العضوية الثابتة والملطخة بالمناعة. (أ) المقطع البصري من organoid ملطخة لعلامة الظهارية غير الذوق KRT13 (الأخضر) وعلامة TRC العامة KRT8 (أرجواني). (ب) الإسقاط الأقصى من confocal z-كومة من واحد organoid ملطخة لنوع الأول glial مثل علامة الخلية NTPDase2 (الأخضر) وKRT8 (أرجواني). (C) الإسقاط الأقصى من confocal z-كومة من اثنين من organoids أظهرت جزئيا (الخطوط العريضة البيضاء متقطعة) واحد العضوي الكامل الملون لنوع الثالث الحامض الكشف عن علامة الخلية CAR4 (الأخضر)، والمريرة الكشف عن نوع الثاني علامة الخلية GUSTDUCIN (أرجواني). شريط المقياس: 100 ميكرومتر للعلامات A وB وC. Nuclear DAPI (أزرق، عمود أيمن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الجينات | التمهيدي الأمامي (5'-3') | التمهيدي العكسي (5'-3') | رقم التقييم | ||||||
| سيارة4 | كتغكاغاكاغاغاك | لجنة مكافحة الإرهاب | NM_007607.2 | ||||||
| إنتبد2 | غاغاغاكاغاتسغ | جي تي كاغاكاتكاكاكاغاكتك | NM_009849.2 | ||||||
| جنات3 | أتكاغاتاجاجكاتك | تغتاتكاككغغاغت | NM_001081143.1 | ||||||
| مدينة Kcnq1 | 8- تاتغتكاتكاتكاتكاتغ | جي تي تكتغغغتاجاغاغ | NM_008434.2 | ||||||
| كريت13 | تكتكتكغتغتككتغغا | تغاتكتاتكتكغتسغكاجاغ | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | جي جي تكتغ تغاتشاتكاتغ | سيكغغاغاغاتكا | NM_009078.2 | ||||||
الجدول 1: تسلسلات التمهيدي المستخدمة في الكمية RT-PCR.
الجدول التكميلي 1: مقارنة مكونات وسائط الثقافة العضوية اللغوية المنشورة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وذكرت هنا هو وسيلة فعالة وقابلة للتكرار بسهولة لزراعة وصيانة ومعالجة organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار. ووجد أن استخدام ثلاثة CVPs من 8 إلى 20 أسبوعا Lgr5-فئران EGFP كافية للحصول على ~ 10000 GFP+ الخلايا للاستخدام التجريبي ، مما أدى إلى 50 بئرا مطلية بكثافة 200 خلية لكل بئر في لوحات 48 بئرا. إزالة الظهارة الخندق CVP هو الأمثل عن طريق حقن الظهارة اللغوية مع Dispase الثاني الطازجة ونوع I كولاجيناز الحل، تليها حضانة 33 دقيقة. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي وقت حضانة أقصر، أليكوتس الإنزيم القديم، الكثير مختلفة، أو باستخدام الإنزيمات من الشركات المصنعة المختلفة في إزالة خندق غير مكتملة. وعلى العكس من ذلك، فإن فترة حضانة أطول تسبب الإفراط في هضم الأنسجة، مما يؤدي إلى فقدان سلامة أنسجة الذوق. بعد التقشير ، تم إجراء المزيد من الإثراء لخنادق CVP عن طريق تشذيب الظهارة المحيطة ب CVP.
من الأهمية بمكان أن تكون جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيق المستخدمة أثناء عملية التفكك والتجميع مغلفة ب FBS لمنع الأنسجة والخلايا من الالتصاق بالجدران البلاستيكية للأنابيب ، مما يقلل بشكل كبير من استعادة الخلايا المعزولة (البيانات غير المعروضة). استخدام معطف خفيف من FBS وإزالة السائل الزائد من الأنابيب قبل الاستخدام يقلل من الآثار المثبطة المحتملة على تريبسين أو الإنزيمات الأخرى.
نمت الأجهزة العضوية اللغوية بنجاح من أنسجة CVP المفككة دون الفرز المسبق ل LGR5+ الخلايا17. على الرغم من أن هذه الطريقة تؤدي إلى تكوين الأجهزة العضوية ، فقد وجدنا أن نسبة أقل من هذه الأجهزة تحتوي على خلايا طعم مقارنة بتلك التي تزرع من السلف المعزولة (البيانات غير مبينة). تدفق الفرز لLgr5-EGFP+ الخلايا يثري للذريات الذوق المختصة، مما أدى إلى نسبة أعلى من organoids الذوق تزخر. حاليا، ونحن جمع جميع الخلايا فوق عتبة الفلورة التلقائية GFP (الشكل 3)؛ ومع ذلك، فمن الممكن أن ترتبط مستويات السطوع GFP مع متغير العضوي تشكيل الكفاءة أو الكفاءة الذوق. هذه الفرضية لم تختبر بعد ولكنها وسيلة واعدة للعمل في المستقبل لأنها يمكن أن تسمح بمزيد من الإثراء للأعضاء المحتوية على خلايا الذوق.
ومن المعروف جيدا أن كثافة الطلاء يؤثر على كفاءة التمايز العضوي، ونحن نوصي بأن يتم تحديد كثافة الطلاء الأمثل قبل التجريب28. حجم وعمق الآبار، وكذلك حجم هلام مصفوفة، ينبغي النظر عند إنشاء كثافة الطلاء. استنادا إلى عملنا الأولي (البيانات غير مبينة)، نجد أنه في لوحة 48 بئرا، 15 ميكرولتر من هلام مصفوفة وكثافة الطلاء من 200 خلية لكل بئر يسمح التوسع العضوي كفاءة والتمايز من جميع أنواع TRC الثلاثة. لقد وجدنا أن organoids لغوية يمكن أن تكون مثقفة بنجاح وبشكل مستنسخ في انخفاض عامل النمو استخراج غشاء الطابق السفلي (RGF BME)، وهو بديل هلام مصفوفة الاصطناعية وأقل تكلفة. قد تدعم المصفوفات البديلة الأخرى أيضا الثقافة العضوية اللغوية ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الاختبار للتحقيق في هذا الاحتمال.
أثناء الطلاء ، يجب أن تكون الخلايا التي تم جمعها إعادة إنفاقها بدقة ولكن بلطف في هلام المصفوفة عن طريق الأنابيب في كثير من الأحيان صعودا وهبوطا للحفاظ على تعليق الخلية متجانسا. كما يجب الاحتفاظ بالأنبوب الذي يحتوي على خليط هلام مصفوفة الخلية على الجليد خلال عملية الطلاء بأكملها لمنع هلام المصفوفة من التبلور على جانبي الأنبوب. تضمن هذه التدابير توزيعا متعادلا للخلايا عبر الآبار ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر قابلية للاستنساخ عند طلاء الخلايا يدويا. وتجدر الإشارة إلى أن التطورات الأخيرة في تقنيات microfluidic توفر خيارات عالية الإنتاجية للاستغناء عن الخلايا وهي أداة واعدة للعمل المستقبلي29.
لتقييم التعبير الجيني في organoids المستزرعة، وجد أن من الضروري لتجميع ما لا يقل عن ثلاثة آبار لكل تكرار البيولوجية للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي والاتساق عبر يكرر(الشكل 6). كما تقرر أن اللحص على الفور الأجهزة التي تم حصادها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة محددة يحسن نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج. في حين لم يتم اختبارها هنا، خيارات التخزين الأخرى مثل فلاش تجميد أو إعادة الإنفاق في الكواشف التخزين قد تحافظ أيضا على العائد الحمض النووي الريبي والجودة.
يمكن أن يكون إجراء الكيمياء المناعية على الأعضاء تحديا ، حيث يجب أن تخترق الأجسام المضادة الأولية والثانوية أي هلام مصفوفة متبقية وظهارة الجهازية بأكملها. في التقارير السابقة، تم إصلاح organoids في حين لا تزال معلقة في هلام مصفوفة، والتي تتطلب في وقت لاحق تركيزات عالية للغاية من محلول الأجسام المضادة الأولية للكشف عن التعبير البروتين17،18. على غرار تقارير أخرى، تم العثور على إزالة organoids من هلام مصفوفة باستخدام حل استعادة الخلية قبل التثبيت لزيادة كفاءة تلطيخ دون الحاجة إلى تركيز الأجسام المضادة عالية30،31؛ ومع ذلك ، فإن الكشف عن بعض علامات خلايا الذوق ، على سبيل المثال ، CAR4 ، يتطلب تركيزا أعلى من الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، فإن احتضان الأجهزة العضوية في antisera الأولية لمدة 3 ليال يزيد من احتمال ربط الأجسام المضادة. ومع ذلك، قد تزيد هذه الطريقة أيضا من فلورة الخلفية إذا لم يتم غسل الأعضاء بشكل كاف بعد اللطأ المناعي. الأهم من ذلك، يمكن حفظ محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة وإعادة استخدامها بنجاح مرة واحدة أو أكثر إذا تم تخزينها لمدة تقل عن أسبوع (البيانات غير مبينة). للتصوير الأمثل، يتم تركيب الأجهزة العضوية عن طريق وضع غطاء على قمة محيط طيني من طين النمذجة للحفاظ على بنيتها ثلاثية الأبعاد. وضع الزجاج الغطاء مباشرة على الكمادات الشريحة ويكسر organoids، ومنع التحليل السليم.
الثقافة العضوية هي تقنية قابلة للتطبيق للغاية وفعالة من حيث التكلفة. وتشمل بعض التطبيقات، على سبيل المثال لا الحصر، نمذجة الأمراض وفحص الأدوية ودراسة الخلايا الجذعية وبيولوجيا النمو32. لذلك، من المهم توحيد النماذج العضوية للسماح بالتكاثر عبر المختبرات. في المستقبل، سيكون من المفيد تطوير طريقة موحدة لتمرير الأجهزة العضوية اللغوية التي تضمن أن طعم قوة الخلايا الجذعية يمكن نشرها عبر الممرات التسلسلية، وبالتالي تقليل الحاجة إلى إضافية لتوليد المزيد من الأجهزة العضوية. الأهم من ذلك، في حين تتكون الأجهزة العضوية اللغوية من كل من الخلايا الظهارية الذوق وغير الذوق، وتنظيم هذه الخلايا يختلف بالمقارنة مع نظام الذوق في الجسم الحي. التناقضات بين organoids وظهارة الذوق في الجسم الحي قد يكون بسبب وسائل الإعلام المستخدمة لثقافة organoid و / أو لأن organoids تفتقر إلى التفاعل مع البيئة الدقيقة برعم الذوق، بما في ذلك إشارات هامة من الأعصاب gustatory والبروبريا الصفيحة التي هي مطلوبة لتشكيل برعم الذوق والصيانة22،33،34،35. العمل في المستقبل لدمج الأعصاب أو الأوعية الدموية في الثقافة العضوية اللغوية، وهي استراتيجية يجري اعتمادها حاليا في النظم العضوية الأخرى، يمكن أن تسمح النمذجة أكثر دقة من ظهارة طعم في الجسم الحي 36،37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيتر ديمبسي ومونيكا براون (جامعة كولورادو Anschutz الطبية الحرم الجامعي Organoid والأنسجة النمذجة الموارد المشتركة) لتوفير وسائل الإعلام WNR مشروطة ومناقشات قيمة. نشكر أيضا جامعة كولورادو تقنيات الخلايا مركز السرطان وتدفق الموارد المشتركة قياس الخلايا، وخاصة ديمتري باتورين، لخبرة فرز الخلايا. تم تمويل هذا العمل من قبل: NIH/NIDCD R01 DC012383، DC012383-S1، DC012383-S2، والمعاهد القومية للصحة/NCI R21 CA236480 إلى LAB، وR21DC016131 وR21DC016131-02S1 إلى DG، وF32 DC015958 إلى EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
