Summary
הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.
Abstract
חוש הטעם מתווך על ידי בלוטות טעם על הלשון, אשר מורכבים תאים קולטן טעם מתחדש במהירות (TRCs). מחזור מתמשך זה מופעל על ידי תאי אבות מקומיים והופך את תפקוד הטעם נוטה לשיבוש על ידי שפע של טיפולים רפואיים, אשר בתורו משפיע קשות על איכות החיים. לכן, לימוד תהליך זה בהקשר של טיפול תרופתי חיוני כדי להבין אם וכיצד תפקוד אבות הטעם וייצור TRC מושפעים. בהתחשב בדאגות האתיות ובזמינות המוגבלת של רקמת הטעם האנושית, מודלים של עכברים, שיש להם מערכת טעם דומה לבני אדם, נמצאים בשימוש נפוץ. בהשוואה לשיטות ויוו, שגוזלות זמן רב, יקרות, ולא נוחות למחקרי תפוקה גבוהים, אורגנוידים לשוניים של מורין יכולים לאפשר ניסויים להתנהל במהירות עם שכפולים רבים ופחות עכברים. כאן, פרוטוקולים שפורסמו בעבר הותאמו וגישה שיטה סטנדרטית ליצירת אורגנוידים של טעם מתאי אבות טעם המבודדים מהפאפילה המקיפה (CVP) של עכברים בוגרים. טעם תאי אבות ב- CVP אקספרס LGR5 וניתן לבודדם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מעכברים הנושאים אלל Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. תאים ממוינים מצופים במערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת ג'ל מטריצה ומתרבתים במשך 12 יום. Organoids להרחיב במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות באמצעות התפשטות ולאחר מכן להיכנס לשלב בידול, שבמהלכו הם מייצרים את כל שלושת סוגי תאי הטעם יחד עם תאים אפיתל שאינם טעם. אורגנוידים ניתן לקצור עם ההתבגרות ביום 12 או בכל עת במהלך תהליך הצמיחה עבור ביטוי RNA וניתוח אימונוהיסטוכימי. סטנדרטיזציה של שיטות תרבות לייצור אורגנוידים לשוניים מתאי גזע בוגרים תשפר את הרבייה ותקדם אורגנוידים לשוניים ככלי סינון תרופות רב עוצמה במאבק כדי לעזור לחולים חווים תפקוד לקוי של הטעם.
Introduction
במכרסמים, בלוטות טעם לשוניות שוכנות בפפילות פטריות המופצות בחלק הקדמי, פפילאות עלווה דו-צדדיות אחוריות, כמו גם פפילה אחת (CVP) בקו האמצע posterodorsal של הלשון1. כל בלוטות טעם מורכבת מ-50-100 תאי קולטן טעם קצרי מועד המתחדשים במהירות (TRCs), הכוללים תאי תמיכה דמויי גליה מסוג I, תאי סוג II המזהים מתוקים, מרירים ואומאמי, ותאי סוג III המזהים חמוצים2,3,4. ב- CVP העכבר, LGR5+ תאי גזע לאורך הלמינה הבזלת מייצרים את כל סוגי ה- TRC, כמו גם תאים אפיתל שאינםטעם 5. בעת חידוש שושלת הטעם, תאי הבת של LGR5 מצוינים לראשונה כתאי מבשר טעם פוסט-מיוטי (תאי IV מסוג) המוזנים לבלוטות טעם ומסוגלים להבדיל לכל אחד משלושת סוגי TRC6. המחזור המהיר של TRCs הופך את מערכת הטעם רגישה לשיבושים על ידי טיפולים רפואיים, כולל קרינה וטיפולים תרופתיים מסוימים7,8,9,10,11,12,13. לכן, לימוד מערכת הטעם בהקשר של ויסות תאי גזע טעם ובידול TRC חיוני להבנת כיצד להקל או למנוע תפקוד לקוי של הטעם.
עכברים הם מודל מסורתי למחקרי in vivo במדעי הטעם שכן יש להם מערכת טעם מאורגנת בדומה לבני אדם14,15,16. עם זאת, עכברים אינם אידיאליים עבור מחקרים תפוקה גבוהה, כפי שהם יקרים לתחזוקה זמן רב לעבוד עם. כדי להתגבר על זה, שיטות תרבות האורגנויד במבחנה פותחו בשנים האחרונות. אורגנוידים טעם יכול להיווצר מרקמת CVP מקורית, תהליך שבו organoids ניצן מן האפיתל CVP עכבר מבודד תרבית ex vivo17. אורגנוידים אלה מציגים אפיתל רב שכבתי העולה בקנה אחד עם מערכת הטעם של in vivo. דרך יעילה יותר ליצור organoids שאינו דורש תרבות CVP ex vivo פותחה על ידי רן ואח'בשנת 201418. התאמת שיטות ומדיה תרבית שפותחה לראשונה כדי לגדל organoids מעיים, הם בודדו Lgr5-GFP+ תאי אבות יחידים מ CVP העכבר וציפו אותם בג'ל מטריצה19. תאים בודדים אלה יצרו אורגנוידים לשוניים המתרבים במהלך 6 הימים הראשונים של התרבות, מתחילים להבדיל סביב יום 8, ועד סוף תקופת התרבות מכילים תאים אפיתל שאינם טעם וכל שלושת סוגי TRC18,20. עד כה פורסמו מחקרים רבים המשתמשים במערכת מודל האורגנויד הלינגואלי17,18,20,21,22; עם זאת, שיטות ותנאי תרבות המשמשים ליצירת organoids אלה משתנים בין פרסומים (טבלה משלימה 1). לכן, שיטות אלה הותאמו ומותאמו כאן כדי להציג פרוטוקול סטנדרטי מפורט לתרבות האורגנוידים הלשויים הנגזרים מ- LGR5+ אבות של CVP עכבר מבוגר.
אורגנוידים לשוניים מספקים מודל ייחודי לחקר התהליכים הביולוגיים של התא המניעים את התפתחות והתחדשות תאי הטעם. ככל שהיישומים של אורגנוידים לשוניים מתרחבים ומעבדות נוספות נעות לכיוון ניצול מודלים אורגנוידים במבחנה, חשוב שהתחום ישאף לפתח ולאמץ פרוטוקולים סטנדרטיים לשיפור יכולת הרבייה. הקמת organoids לשוני ככלי סטנדרטי במדעי הטעם תאפשר מחקרי תפוקה גבוהה להקניט לגזרים כיצד תאי גזע בודדים ליצור את התאים המובחנים של מערכת הטעם הבוגרת. בנוסף, אורגנוידים לשוניים יכולים להיות מועסקים כדי לסנן במהירות תרופות עבור השפעות פוטנציאליות על הומאוסטזיס טעם, אשר לאחר מכן ניתן לחקור ביסודיות רבה יותר במודלים בעלי חיים. גישה זו בסופו של דבר תגביר את המאמצים לתכנן טיפולים שישפרו את איכות החיים של מקבלי תרופות עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו במתקן מוסמך AAALAC בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, חוק רווחת בעלי חיים ומדיניות שירות בריאות הציבור, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו Anschutz. עכברי Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 המשמשים בפרוטוקול זה הם ממעבדת ג'קסון, מלאי מס ' 008875.
הערה: השלבים הבאים יש להשלים לפני תחילתו כדי להבטיח התקדמות חלקה בזמן של הפרוטוקול: להגדיר אמבט מים ל 37 °C ,, להגדיר צנטריפוגה ל 4 °C (5 °C), להפוך פתרונות אנזימי הזרקה ודיסוציאציה מן 10 מ"ג / מ"ל Dispase, Collagenase, ופתרונות מלאי אלסטאז (ראה טבלה של חומרים), להסיר ג'ל מטריצה מ -20 °C מקפיא (~ 750 μL הדרוש צלחת 48-באר) ולהפשיר על ידי טביעת הלווייני בקרח עבור ב לפחות 3-4 שעות, צינורות microcentrifuge טרום מעיל ב FBS לא מדולל על ידי נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפחות (שני צינורות 2 מ"ל לאיסוף רקמות, שני צינורות 1.5 מ"ל לתאים מנותקים, וצינור אחד 1.5 מ"ל לאיסוף תאים בודדים מממיין התאים; הסר FBS עודף לפני השימוש).
1. בידוד אפיתל CVP
הערה: כדי להשיג מספיק LGR5+ תאים עבור צלחת מלאה 48-well, לאסוף שלושה CVPs Lgr5-EGFP באותו צינור ולעבד בו זמנית. חשוב לציין, לקצור ולעבד את CVP של לפחות סוג בר אחד המלטה במקביל בצינור נפרד ולהשתמש בו כפקד gating כדי להגדיר פרמטרי FACS (ראה תוצאות מייצגות).
- המתת חסד העכברים עם חנק CO2 על פי תקנות IACUC, ואחריו שיטה משנית מאושרת כגון בית החזה הדו צדדי, נקע צוואר הרחם, עריפת ראש, או דממה.
- השתמש במספריים גדולים סטריליים כדי לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. הרם את הלשון וחתוך את frenulum לשוני כדי להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה. חותכים את הלשון ואוספים אותה בתחבולה סטרילית של דולבק עם חוצץ פוספט (dPBS) עם Ca2+ ו-Mg2+.
- הסר והשלך את הלשון השמאלית על ידי חיתוך רק את קהוריו של ההצטיידות הבין-עמיתית עם סכין גילוח (איור 1A, קו מקווקו). השתמש בנגב משימה עדין כדי להסיר כל שיער ונוזל עודף מהלשון האחורית.
- מלא מזרק 1 מ"ל עם 200-300 μL של פתרון אנזימי הזרקה (ריכוז סופי: 2 מ"ג / מ"ל סוג-I Collagenase ו 5 מ"ג / מ"ל Dispase II ב Ca2 +/ Mg2 +- המכיל dPBS, מדולל מ 10 פתרונות מלאי מ"ג / מ"ל) ולהכניס מחט 30 G x 1/2 רק מעל המעמד הבין-עמי (איור 1B,חץ שחור) עד רק לפני ה- CVP (איור 1B, קופסה שחורה). הזריקו את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות לרוחב של ה- CVP בין האפיתל לרקמות הבסיסיות (למינה פרופריה, שריר). למשוך את המזרק לאט ברציפות מן הלשון כמו הזריקה מבוצעת.
- לדגור על הלשון ב- Ca סטרילי2 +/ מ"ג2 +- dPBS חינם בטמפרטורת החדר במשך 33 דקות בדיוק.
- לעשות חתכים קטנים באפיתל דו-צדדי ופשוט קהורי ל- CVP באמצעות מספריים חתך דקים במיוחד, ולקלף בעדינות את האפיתל על ידי הרמתו עם מלקחיים עדינים. לאחר אפיתל התעלה הוא ללא רקמת החיבור הבסיסית, למקם אותו בצינור microcentrifuge 2 מ"ל ריק מצופה מראש עם FBS. האם חיתוך אפיתל לפני או אחרי ניתוק האפיתל CVP(איור 1C,D).
2. דיסוציאציה של אפיתל CVP
הערה: דיסוציאציה של האפיתל והצילה של CVP מיוצגים באופן גרפי באיור 2.
- הוסיפו את קוקטייל אנזימי הדיסוציאציה (ריכוז סופי: 2 מ"ג/מ"ל סוג-I Collagenase, 2 מ"ג /mL אלסטאז, ו-5 מ"ג/מ"ל Dispase II ב-Ca2+/Mg2+- המכיל dPBS, מדולל מ-10 פתרונות מלאי מ"ג/מ"ל) לצינורות המכילים אפיתליה קלופה CVP (200 μL לכל CVP). דגירה באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 45 דקות. מערבולת בקצרה כל 15 דקות.
הערה: טרום מלחמה 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 °C במהלך 15 הדקות האחרונות של דגירה קוקטייל אנזימים. - לאחר הדגירה, מערבולת (שלושה פולסים) ואז triturate עם פיפטה פסטר זכוכית במשך 1 דקות. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה הסופר-נט המכילה את האוסף הראשון של תאים מנותקים, לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים מצופים FBS בגודל 1.5 מ"ל המתאימים לגנוטיפ. לעבד את חתיכות הרקמה הנותרות עוד יותר כמתואר בשלב 2.3. מתחת.
- ספין את supernatant במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה.
- הסר את supernatant וכתוצאה מכך resuspend גלולה התא ב- Ca2 +/ Mg2 +- חינם PBS (50 μL לכל CVP)). תחסן על קרח.
- בעת ביצוע שלבים 2.2.1 ו 2.2.2, לנתק את חתיכות הרקמה הנותרות לשלב 2.2 על ידי הוספת טריפסין-EDTA התחממות מראש (200 μL לכל CVP) לצינורות microcentrifuge המקוריים 2 מ"ל ודגרה באמבט מים 37 °C במשך 30 דקות. מערבולת בקצרה כל 10 דקות.
- לאחר הדגירה, מערבולת הצינור המכיל חתיכות רקמה (שלושה פולסים) ולאחר מכן triturate עם פיפטת פסטר זכוכית במשך 1 דקות. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה את הסופר-נט לתוך צינורות המיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכילים תאים החל מהשלב 2.2.2. השלך את הצינורות המכילים את חתיכות הרקמה הנותרות.
- לסובב את הצינורות עם תאים מנותקים במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה.
- הסר את כדורי תא supernatant ו resuspend במאגר FACS (100 μL לכל CVP). תחסן על קרח.
- להעביר את התאים דרך מסנן רשת ניילון 30 מיקרומטר ולהוסיף DAPI(פליטת λ = 450 ננומטר) לתערובות תאים לפני FACS. לבודד Lgr5-GFP+ תאים באמצעות FACS באמצעות ערוץ חלבון פלואורסצנטי ירוק(עירור λ = 488 ננומטר;פליטת λ = 530 ננומטר). מיין את התאים באמצעות זרבובית 100 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל טרי מצופה FBS המכיל 300 μL של Ca2 +/ Mg2 + חינם dPBS. מניחים את התאים על קרח עד ציפוי.
3. ציפוי של תאי Lgr5-EGFP
- קבע את עוצמת הקול של השעיית LGR5+ תא שהתקבלה מציטומטר הזרימה.
- בהתבסס על מספר התאים שהתקבלו מהממיין, חשב את מספר התאים ל- μL. לאחר מכן, לקבוע את הנפח הדרוש כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים לציפוי (אנו משתמשים 200 תאים לכל באר של צלחת 48 טוב) ולהעביר את הנפח הכולל של תאים מושעים לתוך צינור microcentrifuge חדש.
- ספין את הצינור במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה (גלולה לא יכול להיות גלוי). הסר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח.
- בעדינות resuspend את גלולה התא בכמות המתאימה של ג'ל מטריצה (15 μL לבאר עבור 48-טוב צלחות); pipette למעלה ולמטה בעדינות כדי להפיץ ביסודיות תאים בג'ל מטריצה. מניחים 15 μL של תערובת ג'ל מטריצה / תא במרכז כל באר. שמור את צינור microcentrifuge על קרח בצינור חרוטי 50 מ"ל במהלך ציפוי כדי למנוע ג'ל מטריצה מג'ל. ממשיכים לערבב תערובת ג'ל/תאים מטריקס לאורך כל ה ציפוי על ידי צנרת למעלה ולמטה כל שלוש בארות כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים על פני בארות.
- מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C), 5% CO2, ~ 95% לחות) במשך 10 דקות כדי לאפשר ג'ל מטריצה. לאחר מכן, להוסיף 300 μL של טמפרטורת החדר WENRAS + Y27632 מדיה לכל באר ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור.
4. תחזוקת אורגנויד
הערה: Organoids גדלים במדיה organoid קונבנציונאלי (WENR) הכוללת EGF רקומביננטי ו 50% מדיה מותנית המכיל Wnt3a, Noggin, ו R-ספונדין23. תרופות A8301 ו- SB202190 מתווספות במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות כדי לייעל את הצמיחה (מדיה WENRAS) (איור 5),ולאחר מכן הוסרו כדי לקדם בידול (מדיה WENR)20. Y27632 מתווסף ליומיים הראשונים של התרבות כדי לקדם הישרדות. תנאי המדיה ביחס לציר הזמן של התרבות מוצגים באיור 4.
- יומיים לאחר ה ציפוי, להסיר WENRAS + Y27632 מדיה מכל באר באמצעות pipette 1 מ"ל, להבטיח ללא זיהום צולב. הוסף 300 μL של מדיה WENRAS בצד של הבאר כדי לא לשבש את ג'ל מטריצה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
- שנה את המדיה כל יומיים, תוך שימוש באמצעי התקשורת המתאימים לשלב התרבות(איור 4). לשמור על organoids עד היום 12, כאשר organoids מוכנים לקצור.
5. עיבוד RNA
- קצירת אורגנוידים לרנ"א
- מניחים צלחת 48-well על קרח במשך 30 דקות כדי depolymerize ג'ל מטריצה.
- באמצעות פיפטה 1 מ"ל, למשוך את המדיה organoid; לאחר מכן, כמו התקשורת מוחזרת לבאר, להשתמש בקצה של pipette כדי לגרד עוד יותר לשבור את ג'ל מטריצה. העבר את התוכן לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, איגום תוכן של שלוש בארות בצינור אחד. צנטריפוגות הצינורות במשך 5 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר.
- הסר מדיה רבה ככל האפשר ללא הסרת organoids; לאחר מכן, לסובב את הצינורות שוב במשך 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.
- הסר את המדיה הנותרת ו resuspend organoids ב 350 μL מאגר תמוגה + β-mercaptoethanol (βME) (10 μL βME לכל 1 מ"ל מאגר תמוגה). מניחים את הדגימות על קרח להפקת RNA מיידית או לאחסן ב -80 °C (70 °F).
- ניתוח RT-PCR כמותי
- מדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. רנ"א לתמלל לאחור באמצעות ערכת סינתזה של cDNA.
- ערבבו cDNA שווה ערך ל- 5 ננוגרם RNA עם פריימרים קדמיים והופוכים של 200 ננומטר אומתו מראש (טבלה 1) ותערובת מאסטר PCR פלואורסצנטית. הפעל את תגובת qRT-PCR עבור 40 מחזורים ב: 95 °C (70 °F) עבור 15 s, ולאחר מכן 60 °C (60 °F) עבור 60 s.
6. אימונוהיסטוכימיה
- קציר ותיקון האורגנוידים
- מניחים צלחת 48-well על קרח במשך 30 דקות כדי לשחרר את ג'ל מטריצה.
- הסר את מדיית האורגנויד ולהוסיף 400 μL של PBS קר כקרח לכל באר. לאחר מכן, להסיר PBS ולהוסיף 400 μL של פתרון שחזור תאים קר כקרח לכל באר. רוק בעדינות ב 4 °C (5 °F) במשך 30 דקות.
- יש לצפות קצה צינור של 1 מ"ל עם 1% BSA ב-PBS, ולהזרים בעדינות את תכולת הבאר למעלה ולמטה כדי לפרק את ג'ל המטריצה. מעבירים את האורגנוידים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המונח על קרח.
- לשטוף כל באר עם 300 μL PBS + 1% BSA ולהעביר את כל organoids הנותרים לצינורות המתאימים. הסר פתרון שחזור תאים/PBS + BSA מכל צינור. הוסיפו 400 מיקרו-אל של PBS קר כקרח, ולאחר מכן חזרו על הפעולה עם שטיפה נוספת של PBS קרה כקרח.
- הסר PBS ולתקן organoids עם 300 μL קר כקרח 4% PFA (ב 0.1 M PB) במשך 20 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר. הסר PFA ולשטוף organoids עם 400 μL קר כקרח PBS.
- הסר PBS; לאחר מכן, להוסיף 400 μL PBS + 1% BSA. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
- כתמי אימונופלואורסצנטיות
- לשטוף organoids ב 500 μL PBS + 1% BSA. לאחר מכן, אורגנוידים מדגירה בתמיסת חסימה (5% סרום עז או חמור רגיל, 1% אלבומין בסרום בקר, 0.3% Triton X 100 ב- 1x PBS pH 7.3) למשך 2 שעות, נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים את תמיסת הנוגדנים העיקרית (נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה) ומנענעים בעדינות במשך 3 לילות ב-4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף organoids 4x עבור 1 שעה עם 500 μL PBS + 0.2% טריטון, מתנדנד בעדינות בטמפרטורת החדר. הוסף פתרון נוגדנים משני (נוגדנים משניים מדוללים בתמיסת חסימה) ואורגנוידים סלע לילה, מוגן מפני אור, ב 4 °C (4 °F).
- לשטוף organoids 3x עבור 1 שעה עם 500 μL PBS + 0.2% טריטון, מוגן מפני אור נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר. דגירה עם DAPI מדולל 1:10,000 ב 0.1 M PB במשך 20 דקות, מתנדנד ומכוסה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את organoids 3x במשך 20 דקות עם 0.1 M PB, מתנדנד בעדינות ומכוסה בטמפרטורת החדר.
- הרכבה של אורגנוידים למיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה.
הערה: תמונות שלב אחר שלב של תהליך הרכבת השקופיות מוצגות באיור 7.- צור היקף מרובע בעובי ~1 מ"מ של חימר מידול לא רעיל במגלשת מיקרוסקופ.
- הסר 0.1 M PB מצינור microcentrifuge, בעדינות resuspend organoids ב 100 μL הרכבה אמצעי בחירה; לאחר מכן, להעביר למרכז כיכר החימר.
- ממלאים את ריבוע החימר עד שהמדיום הרכבה כמעט למעלה. לאחר מכן, מניחים כיסויים מרובעים בגודל 22 x 22 מ"מ מעל חימר ולחצו בחוזקה על צידי הכיסוי כדי לאטום. תן לו לרפא על פי הוראות היצרן (כאן, טמפרטורת החדר במשך 1-2 ימים) ולאחסן ב 4 °C (50 °F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לעכברים יש CVP אחד, הממוקם בחלק האחורי של הלשון, שממנו ניתן לבודד תאי LGR5+ גזע(איור 1A, קופסהשחורה). הזרקת תמיסת אנזימים מתחת ל- CVP ובסביבתהגורמתלנפיחות קלה של האפיתל והעיכול של רקמת החיבור. עיכול מספיק מושגת לאחר דגירה של 33 דקות, המאפשרת הפרדה קלה של אפיתל CVP מהרקמה הבסיסית. כאשר מנסים לקלף את האפיתל CVP, יש לבצע חתכים במרחק מספיק מה- CVP כדי להבטיח שחפירות לא ישבשו או ייפגעו(איור 1C). זה גם מאפשר אחד לאחוז האפיתל באמצעות מלקחיים מבלי לפגוע CVP. חיתוך האפיתל המקיף את ה- CVP מסיר תאים שאינם מטרות ומגביר את היעילות של השלבים הבאים על ידי הפחתת מסת הרקמה המתומרנת (איור 1D). חשוב לבדוק כי שתי החפירות (איור 1C, חצים שחורים) נמצאות לפני הוספת אפיתל CVP לצינור microcentrifuge; פילינג מוצלח של CVP כולל חלק מהבלוטות והתעלות של פון אבנר(איור 1D,חצים שחורים). אם האפיתל הקלוף אינו מכיל את שני המבנים האטומים הללו, האפיתל של התעלה נקרע ככל הנראה עקב עיכול חלקי של רקמת החיבור.
כדי לקבוע הגדרות FACS מתאימות לאיסוף תאי Lgr5-EGFP, תאים מ- CVPs מנותקים מתקבלים בנפרד מעכברי סוג פראי ו- Lgr5-EGFP. תאי CVP מסוג פראי מנותחים תחילה כדי לקבוע פרמטרים של gating, תהליך שבו אוכלוסיות של תאים מסווגות בתוך פלט scatterplot על ידי מאפיינים של עניין24. כאן, ארבעה פרמטרים שימשו בסופו של דבר לזהות תאים ל ציפוי. הפרמטר הראשון, פיזור קדימה, מסנן חלקיקים ופסולת בהתבסס על שטח הפנים שזוהה. פרמטר זה מסיר כ- 70% מכל האירועים שזוהו במהלך המיון (איור 3). פרמטר הרוחב מסנן עוד יותר אירועים בהתבסס על גודל כדי להבטיח בחירה של תאים בודדים (singlets). כ-90% מהאירועים הם רווקים(איור 3). הסמן הגרעיני DAPI נלקח על ידי תאים מתים אך לא חיים ובכך מאפשר לתאים מתים להיות ממוינים25. פרוטוקול זה ממטב את הכדאיות של התאים, שכן יותר מ-90% מהאירועים הם תאים חיים(איור 3). לבסוף, פרמטרי gating GFP מוגדרים מעל רמת autofluorescence של תאים סוג פראי. תאים מסוג פראי אינם נאספים; הם משמשים אך ורק כבקרת gating עבור פלואורסצנטיות GFP. עם פרמטרי gating שנקבעו מדגם סוג הבר, תאים מדגם Lgr5-EGFP עוברים לאחר מכן דרך cytometer הזרימה כדי להיות ממוין לאיסוף. ניתן להתאים שערים בתחילת מיון Lgr5-EGFP כדי להתאים קיבוץ ברור של אוכלוסיות תאים מסוימות, אך אין לשנותם באופן משמעותי באמצע המיון. נמצא כי הניתוק של שלושה CVPs Lgr5-EGFP במאגר מניב ~ 500,000 תאים, כולל ממוצע של 10,000 GFP+ תאים.
תנאי מדיה ותרבות נאותים חיוניים לצמיחה ובידול אופטימליים של organoids. מחקרים קודמים תוך שימוש באורגנוידים לשוניים עיצבו את מרכיבי המדיה שלהם על שם אלה משדה האורגנויד במעיים, כולל Wnt3a, EGF, Noggin, ו- R-spondin17,18,19,20,21,22. עם זאת, כאשר אורגנוידים לשוניים מתורבתים בשיטה דומה (מדיית WENR), האורגנוידים אינם גדלים ביעילות (איור 5A). באורגנוידים במעיים האנושיים, תרופות A8301 (מעכב איתות TGFß) ו- SB202190 (מעכב איתות p38 MAPKinase) משמשות לקידום צמיחת האורגנויד26. ואכן, הוספת מעכבים אלה (מדיה WENRAS) גורמת לצמיחה חזקה של organoids לשוני(איור 5A). מעניין, הסרת מעכבים אלה מהתקשורת לאחר 6 ימים גורמת לביטוי גבוה יותר של סמן TRC כללי Kcnq1, דבר המצביע על A8301 ו- SB202190 לעכב את בידול תאי הטעם (איור 5B). לפיכך, צמיחה ובידול אופטימליים מתקבלים על ידי organoids culturing במדיה WENRAS מימים 0-6 ו- WENR מדיה מימים 6-12 (איור 4, איור 5), בהתאמה.
הרכב סוג התא האורגנויד יכול להיות מאופיין על ידי qRT-PCR או אימונוהיסטוכימיה. אורגנוידים בוגרים מכילים את שני תאי הטעם, המסומנים על ידי Kcnq1 ו- KRT8, ותאי אפיתל שאינם בעלי טעם, המסומנים על ידי Krt13/ KRT13 (איור 6, 8A). זה מרמז LGR5+ תאים מבודדים יש עוצמה דומה במבחנה כפי שהם עושים ב vivo מאז, בלשון הבוגרת, Lgr5-GFP+ תאים לייצר הן טעם ושושלת ללאטעם 5. יתר על כן, Krt13 מתבטא ברמות גבוהות יותר מכל 3 סמני TRC (איור 6), דבר המצביע על כך שאורגנואידים מורכבים בעיקר מתאי אפיתל שאינם בעלי טעם. למעשה, כימות יחסי של ביטויגנים 27 מציין ש- Krt13 מתבטא גבוה פי 50 מסמן TRC כללי Kcnq1 (מבחן tשל סטודנט, p = 0.0004). זה צפוי, כמו הלשון יש שיעור דומה של טעם לעומת אפיתל ללאטעם 1. אורגנואידים מבטאים את כל שלושת סוגי ה-TRC(איור 6,8B,C). תאים מסוג I (המסומנים על ידי Entpd2) ותאי סוג II מרים (המסומנים על ידי Gnat3) באים לידי ביטוי גבוה באורגנוידים של טעם, בעוד שתאי חישה חמוצים מסוג III (המסומנים על ידי Car4) פחות נפוצים(איור 6). TRCs מופצים באופן אקראי באורגנוידים ( איור 8 ) ולא במבניבלוטות טעםנפרדים שנצפו ב- vivo.
איור 1: לשון ניתחה ואפיתל CVP קלוף. (A)הלשון נותחת, והלשון הקדמית מוסרת על ידי חיתוך רק הקדמי של ההצטמצמות הבין-עמיתית (קו מקווקו), ומשאירה את הלשון האחורית, הכוללת את ה- CVP (קופסה שחורה)(B)מחט מוכנסת רק לפני השטח הקדמי לתפארת הבין-עמיתית (חץ שחור), ותערובת אנזימים מוזרקת למטה ולקצוות לרוחב של ה- CVP (קופסה שחורה). (C)אפיתל קלוף ללא טריים המקיף את תעלות CVP (חצים שחורים) ו (D)אפיתל קלוף CVP. הבלוטות והתעלות של פון אבנר(D,חצים שחורים) נראים לאחר קילוף מוצלח של החפירות. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זרימת עבודה של יצירת אורגנויד לשונית. הלשון מוסרת מעכברי Lgr5-EGFP. אפיתליה תעלת CVP (קופסה אדומה) קלופים מרקמת החיבור הבסיסית ומנותקים לתאים בודדים. GFP+ תאים מבודדים מצופים בג'ל מטריצה בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוח של 48 באר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גיטינג למיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. (A)הפקד (תאי CVP מסוג בר) פועל קובע את שערי FACS המבטלים פסולת ותאים שבורים באמצעות פיזור קדימה, מזהה סינגלים באמצעות רוחב פיזור צד, מפריד את DAPIשלילי לחיות מ DAPI+ תאים מתים, וקובע את רמת autofluorescence של תאים מסוג בר. (B)שערים שנקבעו בעבר מוחלים על הריצה הניסיונית (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP תאים) כדי לבודד תאים ללא פסולת, יחיד, חי, Lgr5-EGFP+ . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ציר הזמן של תרבות האורגנוידים הלינגואלית והמדיה הנדרשת. מעכב רוק Y27632 מתווסף לתקשורת עבור 48 h הראשונים של התרבות כדי לקדם את הישרדות התא. במהלך שלב ההתפשטות, organoids מוזן מדיום מותנה המכיל A8301 ו SB202190 (WENRAS) כדי לייעל את הצמיחה. תרופות אלה מעוכבות ממדיה (WENR) החל מהיום 6 כדי לקדם בידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תרופות A8301 ו- SB202190 משפיעות על צמיחת האורגנוידים והבחנה. (A)תמונות ברייטפילד של אורגנוידים הגדלים במדיה של WENR (יום 0-12), מדיית WENRAS (יום 0-12) או WENRAS (יום 0-6), ואז WENR (יום 6-12). התמונות צולמו ביום 2, ביום השישי וביום ה-12 של התרבות באמצעות תוכנת הדמיה חיה. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר (B) ביטוי גנים יחסי של סמן TRC גלובלי Kcnq1 מופחת באופן משמעותי כאשר תרופות A8301 ו- SB202190 נמצאים במהלך בידול אורגנויד. כל נקודה מייצגת שכפול ביולוגי אחד, שכלל שלוש בארות מלוכלות. שינוי ממוצע בביטוי גנים יחסי (קו אופקי) חושב על-ידי ממוצע של שלושה שכפולים ביולוגיים. קווי שגיאה: ±SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אורגנוידים לשוניים מבטאים סמני תאי טעם קנוניים. שינוי סף מחזור (Ct) ערך של סמן TRC גלובלי Kcnq1,סמן אפיתל ללא טעם ציטוקרטין 13(Krt13),סוג I TRC סמן Entpd2,סוג II מריר TRC סמן Gnat3, וסוג III חמוץ TRC סמן Car4,לעומת גן משק הבית Rpl19. כל נקודה מייצגת שכפול ביולוגי אחד, שכלל שלוש בארות מלוכלות מצלחת של 48 בארות. שינוי ממוצע בערך Ct (קו אופקי) עבור כל סמן חושב על-ידי ממוצע של שלושה עותקים משוכפלים ביולוגיים. מבחן tשל סטודנט לא משוער, *p < 0.05. קווי שגיאה: ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הרכבה של אורגנוידים לשוניים למיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה. (A)נוצרת מחרוזת בעובי של כ-1 מ"מ של חימר מידול לא רעיל. (B)החימר מפוסל כמרובע ~ 20 מ"מ x 20 מ"מ במרכז שקופית מיקרוסקופ 24 מ"מ x 75 מ"מ. (C)22 מ"מ x 22 מ"מ מרובע מכסה את החותמים האורגנוידים המושעים באמצעי הרכבה. סרגל קנה מידה: 10 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: אימונולאבלינג של אורגנוידים לשוניים שלמים. תמונות קונפוקליות של אורגנוידים קבועים, מחוסנים. (A)קטע אופטי של אורגנויד מוכתם עבור סמן אפיתל ללא טעם KRT13 (ירוק) וסמן TRC כללי KRT8 (מגנטה). (B)הקרנה מקסימלית של ערימת z קונפוקלית של אורגנויד אחד מוכתם עבור סוג I סמן תא דמוי גליה NTPDase2 (ירוק) ו KRT8 (מגנטה). (C)הקרנה מקסימלית של ערימת z קונפוקלית של שני organoids המוצגים חלקית (קווי מתאר מקווקווים לבנים) ואורגנואיד שלם אחד מוכתם עבור סוג III חמוץ זיהוי סמן תא CAR4 (ירוק), וסמן תא סוג II מריר GUSTDUCIN (מגנטה). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר עבור A, B ו- C. סמן גרעיני DAPI (כחול, עמודה ימנית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם גן | פריימר קדמי (5'-3') | פריימר הפוך (5'-3') | מספר הערכה | ||||||
| מכונית4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TgatCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
טבלה 1: רצפי פריימר המשמשים עבור כמותית RT-PCR.
טבלה משלימה 1: השוואה של רכיבי מדיה של תרבות האורגנוידים הלינגואלית שפורסמו. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דיווח כאן היא שיטה יעילה וניתן לחזור בקלות עבור culturing, תחזוקה, ועיבוד organoids לשוני נגזר מתאי גזע טעם עכבר למבוגרים. נמצא כי שימוש בשלושה CVPs מ Lgr5 בן 8 עד 20 שבועות-עכברי EGFP מספיק כדי להשיג ~ 10,000 GFP+ תאים לשימוש ניסיוני, וכתוצאה מכך 50 בארות מצופות בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוחות 48-well. הסרת אפיתליה תעלת CVP ממוטבת על ידי הזרקת האפיתל הלינגואלי עם דיספאז II טרי ופתרון קולגנאז מסוג I, ואחריו דגירה של 33 דקות. עם זאת, זמן דגירה קצר יותר, עליקוטים ישנים של אנזימים, מגרשים שונים, או באמצעות אנזימים מיצרנים שונים יכול לגרום להסרת תעלה לא שלמה. לעומת זאת, זמן דגירה ארוך יותר גורם לעיכול יתר של הרקמה, וכתוצאה מכך אובדן שלמות רקמת הטעם. לאחר קילוף, העשרה נוספת עבור תעלות CVP נעשה על ידי חיתוך האפיתל המקיף את CVP.
זה קריטי כי כל צינורות microcentrifuge בשימוש במהלך תהליך הניתוק והאיסוף מצופים FBS כדי למנוע רקמות ותאים מלהידבק לקירות הפלסטיק של הצינורות, אשר מפחית באופן משמעותי את ההתאוששות של תאים מבודדים (נתונים לא הראו). שימוש בשכבת אור של FBS והסרת נוזל עודף מהצינורות לפני השימוש ממזער השפעות מעכבות אפשריות על טריפסין או אנזימים אחרים.
אורגנוידים לשוניים גדלו בהצלחה מרקמת CVP מנותקת ללא מיון מוקדם של LGR5+ תאים17. למרות ששיטה זו גורמת להיווצרות של organoids, מצאנו כי חלק קטן יותר של organoids אלה מכילים תאי טעם לעומת אלה שגדלו מן האבות מבודדים (נתונים לא הראו). מיון זרימה עבור Lgr5-EGFP+ תאים מעשיר עבור אבות מוסמכים לטעם, וכתוצאה מכך שיעור גבוה יותר של organoids גדוש טעם. נכון לעכשיו, אנו אוספים את כל התאים מעל לסף של פלואורסצנטיות אוטומטית של GFP (איור 3); עם זאת, ייתכן כי רמות הבהירות GFP קשורים עם יעילות ויוצר organoid משתנה או כשירות טעם. השערה זו טרם נבדקה אך היא מהווה שדרה מבטיחה לעבודה עתידית שכן היא יכולה לאפשר העשרה נוספת של אורגנוידים המכילים תאי טעם.
ידוע כי צפיפות ה ציפוי משפיעה על היעילות של בידול organoid, ואנו ממליצים כי צפיפות ציפוי אופטימלית ייקבע לפני ניסויים28. גודל ועומק של בארות, כמו גם נפח ג'ל מטריצה, יש לקחת בחשבון בעת הקמת צפיפות ציפוי. בהתבסס על העבודה הראשונית שלנו (נתונים לא הראו), אנו מוצאים כי בצלחת 48-well, 15 μL של ג'ל מטריצה וצפיפות ציפוי של 200 תאים לבאר מאפשר הרחבה יעילה organoid ובידול של כל שלושת סוגי TRC. מצאנו כי organoids לשוני ניתן לתרבות בהצלחה ובשחזור תמצית קרום מרתף גורם גדילה מופחתת (RGF BME), חלופה ג'ל מטריצה סינתטי ופחות יקר. מטריצות חלופיות אחרות עשויות גם לתמוך בתרבות האורגנוידים הלינגואלית, אך נדרשת בדיקה נוספת כדי לחקור אפשרות זו.
במהלך ה ציפוי, תאים שנאספו צריכים להיות תוחמים ביסודיות אך בעדינות בג'ל מטריצה על ידי צנרת לעתים קרובות למעלה ולמטה כדי לשמור על השעיית התא הומוגנית. הצינור המכיל את תערובת ג'ל מטריצת התא צריך להישמר גם על קרח במהלך כל תהליך ה ציפוי כדי למנוע ג'ל מטריצה מ gelling בצדי הצינור. אמצעים אלה מבטיחים התפלגות שווה של תאים על פני בארות, מניבים תוצאות ניתנות לשחזור יותר כאשר תאי ציפוי ידניים. ראוי לציין, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות microfluidic לספק אפשרויות תפוקה גבוהה עבור חלוקת תאים והוא כלי מבטיח לעבודה עתידית29.
כדי להעריך ביטוי גנים באורגנוידים מתורבתים, נמצא כי יש צורך לאגד לפחות שלוש בארות עבור כל שכפול ביולוגי כדי להשיג מספיק RNA ועקביות על פני שכפולים (איור 6). כמו כן נקבע כי מיד ליסינג organoids שנקטפו על פי הוראות היצרן הספציפי מייעל את האיכות והכמות של RNA שחולץ. אמנם לא נבדק כאן, אפשרויות אחסון אחרות כגון הקפאת הבזק או resuspension ריאגנטים אחסון עשוי גם לשמר תפוקת RNA ואיכות.
ביצוע אימונוהיסטוכימיה על organoids יכול להיות מאתגר, כמו נוגדנים ראשוניים ומשניים חייבים לחדור כל ג'ל מטריצה שיורית ואת אפיתל organoid כולו. בדוחות קודמים, organoids תוקנו בעוד עדיין מושעה ג'ל מטריצה, אשר לאחר מכן נדרש ריכוזים גבוהים מאוד של פתרון נוגדנים ראשוני לחשוף ביטוי חלבון17,18. בדומה לדיווחים אחרים, הסרת organoids מג'ל מטריצה באמצעות פתרון שחזור התא לפני קיבעון נמצאה כדי להגביר את היעילות של כתמים ללא צורך בריכוז נוגדנים גבוה30,31; עם זאת, זיהוי של כמה סמני תא טעם, למשל, CAR4, דורש ריכוז גבוה יותר של נוגדנים. יתר על כן, דגירה organoids אנטיצרה ראשונית במשך 3 לילות מגביר את ההסתברות של כריכת נוגדנים. עם זאת, שיטה זו עשויה גם להגביר פלואורסצנטיות רקע אם organoids אינם שטופים מספיק לאחר חיסונים. חשוב לציין, ניתן לשמור פתרון נוגדנים ראשי מדולל ולהשתמש בו בהצלחה פעם אחת או יותר אם הוא מאוחסן במשך פחות משבוע (הנתונים אינם מוצגים). להדמיה אופטימלית, האורגנוידים מותקנים על ידי הצבת כיסוי על גבי היקף חימר של חימר דוגמנות כדי לשמר את המבנה התלת-ממדי שלהם. הצבת זכוכית הכיסוי ישירות על השקופית דוחסת ושוברת אורגנוידים, ומונעת ניתוח נכון.
תרבות האורגנויד היא טכניקה ישימה וחסכונית ביותר. יישומים מסוימים כוללים, אך אינם מוגבלים, מודל מחלות הקרנת סמים וחקר תאי גזע וביולוגיה התפתחותית32. לכן, חיוני לתקנן מודלים organoid כדי לאפשר רבייה על פני מעבדות. בעתיד, זה יהיה שימושי לפתח שיטה סטנדרטית להעברת organoids לשונית המבטיח כי טעם עוצמה תאי גזע ניתן להפיץ על פני מעברים סדרתיים, ובכך להפחית את הצורך בבעלי חיים נוספים כדי ליצור organoids יותר. חשוב לציין, בעוד organoids לשוני מורכבים הן טעם ותאי אפיתל שאינם טעם, הארגון של תאים אלה שונה בהשוואה למערכת הטעם in vivo. פערים בין organoids ואפיתל טעם ב vivo עשויים לנבוע מהמדיה המשמשת לתרבות האורגנוידים ו / או משום שלאורגנואידים אין אינטראקציה עם מיקרונוירונמנט בלוטות הטעם, כולל אותות חשובים מהעצבים הגוסטטוריים והפרופריה של למינה הנדרשים להיווצרות בלוטות טעם ותחזוקה22,33,34,35. עבודה עתידית לשלב עצבים או vasculature לתוך תרבות organoid לשונית, אסטרטגיה שאומצה כעת במערכות organoid אחרות, יכול לאפשר מידול מדויק יותר של אפיתל טעם in vivo 36,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר פיטר דמפסי ומוניקה בראון (אוניברסיטת קולורדו Anschutz קמפוס רפואי Organoid ורקמות מודל משאב משותף) על מתן מדיה מותנית WNR ודיונים יקרי ערך. אנו מודים גם לטכנולוגיות התאים של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קולורדו ולמשאבים משותפים של Cytometry זרימה, במיוחד דמיטרי בטורין, על מומחיות במיון תאים. עבודה זו מומנה על-ידי: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, ו- NIH/NCI R21 CA236480 ל- LAB, ו- R21DC016131 ו- R21DC016131-02S1 ל- DG, ו- F32 DC015958 ל- EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
