Summary
Protokol, yetişkin farelerin arka tat papillasından izole edilmiş tat kök hücrelerinden elde edilen dil organoidlerini kültleme ve işleme için bir yöntem sunar.
Abstract
Tat alma duyusu, hızla yenilenen tat reseptör hücrelerinden (WC' ler) oluşan dildeki tat tomurcukları ile aracılık eder. Bu sürekli ciro, yerel ata hücreleri tarafından desteklenmektedir ve tat fonksiyonunu çok sayıda tıbbi tedavi ile bozulmaya eğilimli hale getirir ve bu da yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Bu nedenle, bu sürecin ilaç tedavisi bağlamında incelenmesi, tat progenitör fonksiyonunun ve TRC üretiminin etkilenip etkilenmediğini ve nasıl etkilendiğini anlamak için hayati öneme sahiptir. Etik kaygılar ve insan tat dokusunun sınırlı kullanılabilirliği göz önüne alındığında, insanlara benzer bir tat sistemine sahip fare modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman alıcı, pahalı ve yüksek verim çalışmalarına uygun olmayan in vivo yöntemlerle karşılaştırıldığında, murine lingual organoidler deneylerin birçok çoğaltma ve daha az fare ile hızlı bir şekilde çalıştırılmasını sağlayabilir. Burada, daha önce yayınlanan protokoller uyarlanmıştır ve yetişkin farelerin sirkülatör papillasından (CVP) izole edilmiş tat progenitör hücrelerinden tat organoidleri üretmek için standartlaştırılmış bir yöntem sunulmuştur. CVP ekspres LGR5'teki progenitör hücreleri tadın ve LGR5EGFP-IRES-CreERT2 alel taşıyan farelerden EGFP floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) ile izole edilebilir. Sıralanmış hücreler matris jel tabanlı bir 3D kültür sistemi üzerine kaplanır ve 12 gün boyunca kültürlenir. Organoidler kültür döneminin ilk 6 günü çoğalma yoluyla genişler ve daha sonra tatsız epitel hücreleri ile birlikte üç tat hücresi tipini de ürettikleri bir farklılaşma evresi girerler. Organoidler, RNA ekspresyasyonu ve immünohistokimyasal analiz için büyüme sürecinde 12. Yetişkin kök hücrelerden lingual organoid üretimi için kültür yöntemlerinin standartlaştırılması, tekrarlanabilirliği artıracak ve dilsel organoidleri tat işlev bozukluğu yaşayan hastalara yardımcı olmak için mücadelede güçlü bir ilaç tarama aracı olarak ilerletecektir.
Introduction
Kemirgenlerde, dil tat tomurcukları, ön, bilateral tay papilla posteriorly dağıtılan mantar biçimi papillaların yanı sıra dilin posterodorsal orta hattında tek bir circumvallate papilla (CVP) ile barındırılır1. Her tat tostu, tip I glial benzeri destek hücreleri, tatlı, acı ve umamiyi algılayan tip II hücreleri ve ekşi2, 3,4'üalgılayan tip III hücrelerini içeren 50-100 kısa ömürlü, hızla yenilenen tat reseptör hücrelerinden (WC) oluşur. Fare CVP'sinde, BAZAL lamina boyunca LGR5+ kök hücreler tüm TRC tiplerini ve tatsız epitel hücrelerini üretir5. Tat soyunun yenilenmesinde, LGR5 kız hücreleri ilk olarak bir tat tokasına giren ve üç TRC tip6'danherhangi birine farklılaşabilen mitotik tat öncül hücreleri (tip IV hücreleri) olarak belirtilir. TRC'lerin hızlı cirosu, radyasyon ve bazı ilaç tedavileri 7 , 8 , 9 , 10,11,12,13dahil olmak üzere tıbbi tedavilerle tat sistemini bozulmaya açık hale getirir. Bu nedenle, tat kök hücre regülasyonu ve TRC farklılaşması bağlamında tat sistemini incelemek, tat disfonksiyonunun nasıl azaltılacağını veya önlenebileceğini anlamak için hayati öneme sahiptir.
Fareler, insanlara benzer şekilde düzenlenmiş bir tat sistemine sahip oldukları için tat biliminde in vivo çalışmalar için geleneksel bir modeldir14,15,16. Bununla birlikte, fareler yüksek verim çalışmaları için ideal değildir, çünkü bakımı pahalıdır ve çalışmak için zaman alıcıdır. Bunun üstesinden gelmek için son yıllarda in vitro organoid kültürü yöntemleri geliştirilmiştir. Tat organoidleri, organoidlerin izole fare CVP epitel kültürlü ex vivo17'dentomurcukladığı bir işlem olan yerel CVP dokusundan üretilebilir. Bu organoidler in vivo tat sistemi ile uyumlu çok katmanlı bir epitel gösterir. Ex vivo CVP kültürü gerektirmeyen organoidleri üretmenin daha verimli bir yolu Ren veark. İlk olarak bağırsak organoidlerini büyütmek için geliştirilen yöntemleri ve kültür medyasını uyarlayarak, fare CVP'sinden tek lgr5-GFP+ progenitör hücreleri izole ettiler ve matris jel19ile kapladılar. Bu tek hücreler, kültürün ilk 6 günü boyunca çoğalan,8. Bugüne kadar lingual organoid model sistemini kullanan birden fazla çalışma yayınlanmıştır17,18,20,21,22; ancak, bu organoidleri oluşturmak için kullanılan yöntemler ve kültür koşulları yayınlar arasında farklılık gösterir (Tamamlayıcı Tablo 1). Bu nedenle, bu yöntemler, yetişkin fare CVP'nin LGR5+ atalarından türetilen lingual organoidlerin kültürü için ayrıntılı bir standartlaştırılmış protokol sunmak için burada ayarlanmış ve optimize edilmiştir.
Lingual organoidler, tat hücresi gelişimini ve yenilenmesini sağlayan hücre biyolojik süreçlerini incelemek için benzersiz bir model sağlar. Lingual organoidlerin uygulamaları genişledikçe ve daha fazla laboratuvar in vitro organoid modellerini kullanmaya doğru ilerledikçe, alanın tekrarlanabilirliği artırmak için standartlaştırılmış protokoller geliştirmeye ve benimsemeye çaba göstermesi önemlidir. Dil organoidlerinin tat bilimi içinde standart bir araç olarak kurulması, tek kök hücrelerin yetişkin tat sisteminin farklılaştırılmış hücrelerini nasıl ürettiğini birbirinden ayıran yüksek verim çalışmalarına olanak sağlayacaktır. Ek olarak, lingual organoidler, tat homeostazı üzerindeki potansiyel etkiler için ilaçları hızlı bir şekilde taramak için kullanılabilir ve daha sonra hayvan modellerinde daha ayrıntılı olarak araştırılabilir. Bu yaklaşım nihayetinde gelecekteki ilaç alıcıları için yaşam kalitesini artıran tedaviler tasarlama çabalarını artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi, Hayvan Refahı Yasası ve Halk Sağlığı Hizmet Politikasına uygun olarak AAALAC onaylı bir tesiste gerçekleştirildi ve Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan LGR5EGFP-IRES-CreERT2 fareleri Jackson Laboratuvarı, Stok No. 008875'dandır.
NOT: Protokolün sorunsuz ve zamanında ilerlemesini sağlamak için aşağıdaki adımlar başlamadan önce tamamlanmalıdır: su banyounu 37 °C'ye ayarlayın, santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın, 10 mg/mL Dispase, Collagenase ve Elastase stok çözeltilerinden enjeksiyon ve ayrışma enzimi çözümleri yapın (bkz. Malzeme Tablosu),matris jelini -20 °C dondurucudan çıkarın (~48 kuyu plakası için gerekli 750 μL) ve şişeyi buzun içine batırarak çözün en az 3-4 saat, sulandırılmamış FBS'deki ön kat mikrosantrifüj tüpleri, oda sıcaklığında en az 30 dakika hafifçe sallanarak (doku toplama için iki 2 mL tüp, ayrışmış hücreler için iki 1,5 mL tüp ve hücre sıralayıcısından tek hücre toplanması için bir 1,5 mL tüp; kullanmadan önce fazla FBS'yi çıkarın).
1. CVP epitelinin izolasyonu
NOT: Tam 48 kuyu plakası için yeterli LGR5+ hücresi elde etmek için, aynı tüpte üç Adet Lgr5-EGFP CVP toplayın ve aynı anda işleyin. Daha da önemlisi, en az bir vahşi tip çöp arkadaşının CVP'sini ayrı bir tüpte paralel olarak hasat edin ve işleyin ve FACS parametrelerini ayarlamak için bir gating kontrolü olarak kullanın (bkz. Temsili Sonuçlar).
- Fareleri IACUC yönetmeliklerine göre CO2 boğulması ile ötenazi yapın, ardından bilateral torakotomi, servikal çıkık, kafa kesme veya exsanguination gibi onaylanmış ikincil bir yöntem.
- Yanakları kesmek ve çeneyi kırmak için büyük steril diseksiyon makası kullanın. Dili kaldırın ve dili ağız boşluğunun zemininden ayırmak için dil frenulumunun kesilmesini kesin. Dili kesin ve steril buz gibi Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salininde (dPBS) Ca2+ ve Mg2+ile toplayın.
- Intermolar seçkinliğin sadece ön kısmını jiletle keserek ön dili çıkarın ve atın (Şekil 1A, kesik çizgi). Arka dilden herhangi bir saç ve fazla sıvı çıkarmak için hassas bir görev mendili kullanın.
- 1 mL şırıngayı 200-300 μL enjeksiyon enzim çözeltisi ile doldurun (son konsantrasyon: 2 mg/mL tip-I Collagenase ve 5 mg/mL Dispase II içinde Ca2+/Mg2+içeren dPBS, 10 mg/mL stok çözeltisinden seyreltilmiştir) ve cvp'ye sadece ön gelene kadar intermolar eminence'ın hemen üzerine 30 G x1/2iğne yerleştirin (Şekil 1B,siyah ok), kara kutu). Enzim çözeltisini cvp'nin altına ve yan kenarlarına epitel ve alttaki dokular (lamina propria, kas) arasına enjekte edin. Enjeksiyon yapılırken şırınnayı dilden yavaşça ve sürekli olarak çekin.
- Dili steril Ca2+/ Mg2 +- oda sıcaklığında tam olarak 33 dakika boyunca serbest dPBS'de kuluçkaya yatırın.
- Ekstra ince diseksiyon makası kullanarak epitelde iki taraflı ve CVP'ye sadece ön olarak küçük kesikler yapın ve epitelleri ince epuslarla kaldırarak hafifçe soyun. Hendek epitel alttaki bağ dokusundan arındırıldıktan sonra, FBS ile önceden kaplanmış boş bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. CVP epitelini ayırmadan önce veya sonra epitel kırpmayı yapın (Şekil 1C, D).
2. CVP epitelinin ayrışması
NOT: CVP epitel ve kaplamasının ayrışması Şekil 2'degrafiksel olarak temsil edilmektedir.
- Soyulmuş CVP epitel içeren tüplere (son konsantrasyon: 2 mg/mL tip-I Collagenase, 2 mg/mL Elastase ve Ca2+/Mg2+-içeren dPBS içeren dPBS'de 5 mg/mL Dispaz II) soyulmuş CVP epitel içeren tüplere (son konsantrasyon: 2 mg/mL tip-IL Elastaz) ekleyin. 37 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika kuluçkaya yaslanın. Girdap kısaca her 15 dakikada bir.
NOT: Enzim kokteyl inkübasyonunun son 15 dakikası boyunca 37 °C su banyosunda ön ısıtma% 0.25 Trypsin-EDTA. - Kuluçkadan sonra, girdap (üç darbe) daha sonra 1 dakika boyunca bir cam Pasteur pipet ile üçe üçe üçlenir. Doku parçaları yerleştikten sonra, ayrışmış hücrelerin ilk koleksiyonunu içeren süpernatantı, genotipe karşılık gelen yeni FBS kaplı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Kalan doku parçalarını adım 2.3'te açıklandığı gibi daha fazla işleyin. aşağıda.
- Süpernatant'ı 370 x g'da 5 dakika ve pelet hücrelerine 4 °C'de döndürün.
- Ortaya çıkan süpernatantı çıkarın ve hücre peletini Floresan-Aktif Hücre Sıralama (FACS) Tamponunda (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) ve Ca2+/Mg 2+ -free PBS'de%1FBS (CVP başına 50 μL)) yeniden dürtme. Buzda sakla.
- 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını gerçekleştirirken, orijinal 2 mL mikrosantrifüj tüplerine önceden ısıtılmış %0.25 trypsin-EDTA (CVP başına 200 μL) ekleyerek kalan doku parçalarını adım 2.2'den ayırın ve 37 °C su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Girdap kısaca her 10 dakikada bir.
- Kuluçkadan sonra, doku parçaları (üç darbe) içeren tüpü girdaplayın, ardından 1 dakika boyunca bir cam Pasteur pipet ile üçe bölün. Doku parçaları yerleştikten sonra, süpernatantı adım 2.2.2'den hücreleri içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Kalan doku parçalarını içeren tüpleri atın.
- 370 x g'da 5 dakika ve pelet hücrelerine 4 °C'de ayrışmış hücrelere sahip tüpleri döndürün.
- FACS Buffer'daki (CVP başına 100 μL) süpernatant ve resuspend hücre peletlerini çıkarın. Buzda sakla.
- Hücreleri 30 μm naylon ağ filtresinden geçirin ve FACS'den önce hücre karışımlarına DAPI (emisyon= 450 nm) ekleyin. Yeşil floresan protein kanalını kullanarak LGR5-GFP+ hücrelerini FACS aracılığıyla izole edin (φekscitasyon = 488 nm; φemisyon = 530 nm). 100 μm nozul kullanarak hücreleri, 300 μL Ca 2+ /Mg 2 + serbest dPBS içeren taze bir FBS kaplı1,5mL mikrosantrifüj tüpüne ayırın. Hücreleri kaplayana kadar buza yerleştirin.
3. Lgr5-EGFP hücrelerinin kaplaması
- Akış sitometresinden alınan LGR5+ hücre süspansiyonunun hacmini belirleyin.
- Sıralayıcıdan elde edilen hücre sayısına bağlı olarak, μL başına hücre sayısını hesaplayın. Ardından, kaplama için istenen sayıda hücre elde etmek için gereken hacmi belirleyin (48 kuyu plakasının kuyusu başına 200 hücre kullanıyoruz) ve askıya alınan hücrelerin toplam hacmini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpü 370 x g'da 5 dakika ve pelet hücrelerine 4 °C'de döndürün (pelet görünmeyebilir). Üst saltantayı çıkarın ve tüpü buza yerleştirin.
- Hücre peletini uygun miktarda matris jelinde (48 kuyu plakası için kuyu başına 15 μL) hafifçe yeniden kullanın; hücreleri matris jelinde iyice dağıtmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Her kuyunun ortasına 15 μL matris jel/hücre karışımı yerleştirin. Matris jelinin jelleşmesini önlemek için kaplama sırasında mikrosantrifüj tüpünü 50 mL konik bir tüpte buz üzerinde tutun. Hücrelerin kuyular arasında eşit bir dağılımını sağlamak için her üç kuyuda yukarı ve aşağı pipetleme yaparak kaplama boyunca matris jel / hücre karışımını karıştırmaya devam edin.
- Matris jelleşmesini sağlamak için plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre (%37 °C, %5 CO2, ~%95 nem) yerleştirin. Ardından, her kuyuya 300 μL oda sıcaklığı WENRAS + Y27632 ortam ekleyin ve plakayı inkübatöre geri verin.
4. Organoid bakımı
NOT: Organoidler, rekombinant EGF ve Wnt3a, Noggin ve R-spondin23içeren% 50 şartlandırılmış medyadan oluşan geleneksel organoid medyada (WENR) yetiştirilir. İlaçlar A8301 ve SB202190 büyümeyi optimize etmek için kültür döneminin ilk 6 günü için eklenir (WENRAS medya) (Şekil 5), daha sonra farklılaşmayı teşvik etmek için kaldırılır (WENR medya)20. Y27632, hayatta kalmayı teşvik etmek için kültürün ilk 2 günü için eklenir. Kültür zaman çizelgesine göre ortam koşulları Şekil 4'te sunulmuştur.
- Kaplamadan iki gün sonra, WENRAS + Y27632 ortamlarını 1 mL pipet kullanarak her kuyudan çıkarın ve çapraz kontaminasyon olmamasını sağlayın. Matris jelini bozmamak için kuyunun kenarına 300 μL WENRAS ortamı ekleyin. Plakayı inkübatöre geri verin.
- Kültür aşaması için uygun ortamı kullanarak medyayı her 2 günde bir değiştirin (Şekil 4). Organoidleri, organoidlerin hasat etmeye hazır olduğu 12 güne kadar koruyun.
5. RNA işleme
- RNA için organoidlerin toplanması
- Matris jelini depolimerize etmek için 30 dakika boyunca 48 kuyu plakasını buza yerleştirin.
- 1 mL pipet kullanarak organoid ortamı yukarı çekin; daha sonra, ortam kuyuya geri döndükçe, matris jelini çizmek ve daha fazla parçalamak için pipetin ucunu kullanın. İçeriği 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, üç kuyunun içeriğini bir tüpte bire birin. Tüpleri oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika santrifüj edin.
- Herhangi bir organoid çıkarmadan mümkün olduğunca fazla medya süpernatantı çıkarın; ardından, oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika boyunca tüpleri tekrar aşağı çevirin.
- Kalan ortamı çıkarın ve organoidleri 350 μL lizis tamponu + β-mercaptoethanol (βME) (1 mL lizis tamponu başına 10 μL βME) içinde yeniden söyün. Numuneleri hemen RNA ekstraksiyonu için buza yerleştirin veya -80 °C'de saklayın.
- Nicel RT-PCR analizi
- Spektrofotometre ile RNA miktarını ölçün. CDNA Sentez Kiti kullanarak RNA'yı ters yazıya dök.
- 5 ng RNA'ya eşdeğer cDNA'yı 200 nM önceden doğrulanmış ileri ve ters astarlar (Tablo 1) ve floresan PCR Master Mix ile karıştırın. qRT-PCR reaksiyonlarını 40 döngü boyunca çalıştırın: 15 s için 95 °C, ardından 60 s için 60 °C.
6. İmmünohistokinoloji
- Organoidlerin toplanması ve sabitlenerek sabitlenerek
- Matris jelini gevşetmek için 30 dakika boyunca 48 kuyu plakası buzun üzerine yerleştirin.
- Organoid ortamı çıkarın ve her kuyuya 400 μL buz gibi PBS ekleyin. Ardından, PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 400 μL buz gibi Hücre Kurtarma Çözümü ekleyin. 30 dakika boyunca 4 °C'de hafifçe sallayın.
- PBS'de % 1 BSA ile 1 mL pipet ucu kaplayın ve matris jelini parçalamak için kuyunun içeriğini hafifçe yukarı ve aşağı borulayın. Organoidleri buza yerleştirilen 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Her kuyuyu 300 μL PBS + %1 BSA ile durulayın ve kalan organoidleri ilgili tüplere aktarın. Her tüpten Hücre Kurtarma Çözümü/PBS + BSA'yı çıkarın. 400 μL buz gibi PBS ekleyin, ardından başka bir buz gibi PBS durulama ile tekrarlayın.
- PBS'yi çıkarın ve organoidleri oda sıcaklığında inkübasyon yaparak 20 dakika boyunca 300 μL buz gibi% 4 PFA (0,1 M PB'de) ile sabitlayın. PFA'yı çıkarın ve organoidleri 400 μL buz gibi PBS ile durulayın.
- PBS'yi kaldırın; ardından, 400 μL PBS + % 1 BSA ekleyin. 4 °C'de saklayın.
- İmmünofluoresans boyama
- Organoidleri 500 μL PBS + % 1 BSA'da durulayın. Daha sonra, organoidleri blokaj çözeltisinde kuluçkaya yatırın (%5 normal keçi veya eşek serumu, %1 sığır serum albümini, %0,3 Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) 2 saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayın.
- Birincil antikor çözeltisini (blokaj çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorlar) ekleyin ve 4 °C'de 3 gece boyunca hafifçe sallayın.
- Organoidleri 500 μL PBS + % 0,2 Triton ile 1 saat boyunca 4x yıkayın, oda sıcaklığında hafifçe sallayın. İkincil antikor çözeltisi (blokaj çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlar) ve kaya organoidlerini bir gecede 4 °C'de ışıktan korunarak ekleyin.
- Organoidleri 500 μL PBS + % 0,2 Triton ile 1 saat boyunca 3x yıkayın, ışıktan kornun ve oda sıcaklığında hafifçe sallayın. DAPI ile kuluçkaya yaslanın 1:10.000 0.1 M PB'de 20 dakika boyunca seyreltilir, sallanır ve oda sıcaklığında kaplanır.
- Organoidleri 0,1 M PB ile 20 dakika boyunca 3x yıkayın, hafifçe sallayın ve oda sıcaklığında örtün.
- Ters konfokal mikroskopi için organoidlerin slayt montajı.
NOT: Slayt montaj işleminin adım adım resimleri Şekil 7'de gösterilmiştir.- Mikroskop kaydırağı üzerinde toksik olmayan modelleme kilinin ~1 mm kalınlığında 22 x 22 mm karelik bir çevresi oluşturun.
- Mikrosantrifüj tüpünden 0,1 M PB çıkarın ve organoidleri 100 μL montaj ortamında hafifçe yeniden diriltin; daha sonra kil meydanının ortasına aktarın.
- Montaj ortamı neredeyse zirveye gelene kadar kil karesini doldurun. Ardından, kil üzerine 22 x 22 mm kare kapak kapağı yerleştirin ve kapatmak için kapak kılıfının kenarlarına sıkıca bastırın. Üreticinin talimatlarına göre kürlesin (burada, 1-2 gün oda sıcaklığında) ve 4 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fareler, LGR5+ kök hücrelerin izole edilebileceği dil üzerinde arka tarafta bulunan bir CVP'ye sahiptir (Şekil 1A, kara kutu). CVP altında ve çevresinde bir enzim çözeltisinin enjeksiyonu (Şekil 1B) epitelin hafif şişmesine ve bağ dokusunun sindirimine neden olur. CVP epitelinin alttaki dokudan kolayca ayrılmasını sağlayan 33 dakikalık bir inkübasyonun ardından yeterli sindirim elde edilir. CVP epitelini soymaya çalışırken, siperlerin bozulmamasını veya zarar görmemesini sağlamak için CVP'den yeterli mesafede kesimler yapılmalıdır (Şekil 1C). Bu aynı zamanda cvp zarar vermeden epips kullanarak epitel kavramayı sağlar. CVP'yi çevreleyen epitelin kırpılması hedef olmayan hücreleri temizler ve manipüle edilen doku kütlesini azaltarak aşağıdaki adımların verimliliğini artırır (Şekil 1D). Mikrosantrifüj tüpüne CVP epitel eklemeden önce iki siperin (Şekil 1C, siyah oklar) mevcut olup olmadığını kontrol etmek önemlidir; CVP'nin başarılı bir şekilde soyulması Von Ebner bezlerinin ve kanallarının bir kısmını içerir (Şekil 1D, siyah oklar). Soyulmuş epitel bu iki opak yapıyı içermiyorsa, hendek epitel büyük olasılıkla bağ dokusunun eksik sindirimi nedeniyle yırtılır.
Lgr5-EGFP hücrelerini toplamak için uygun FACS ayarlarını oluşturmak için, ayrışmış CVP'lerden hücreler ayrı olarak vahşi tip ve Lgr5-EGFP farelerinden elde edilir. Vahşi tip CVP hücreleri, ilk olarak, hücre popülasyonlarının scatterplot çıktısı içinde ilgi özelliklerine göre kategorize edildiği bir işlem olan gating parametrelerini belirlemek için analiz edilir24. Burada, kaplama için hücreleri tanımlamak için dört parametre kullanıldı. İlk parametre olan ileri saçılma, tespit edilen yüzey alanına göre parçacıkları ve döküntüleri filtreler. Bu parametre sıralama sırasında algılanan tüm olayların ~%70'ini kaldırır (Şekil 3). Width parametresi, tek hücrelerin (singlet) seçilmesini sağlamak için olayları boyuta göre daha fazla filtreler. Olayların yaklaşık %90'ı singlet'tır (Şekil 3). Nükleer işaretleyici DAPI ölü ama canlı hücreler tarafından alınmaz ve böylece ölü hücrelerin sıraılmasına izin verir25. Bu protokol, olayların% 90'ından fazlası canlı hücreler olduğu için hücre canlılığını optimize eder (Şekil 3). Son olarak, GFP gating parametreleri vahşi tür hücrelerinin otomatik oluşturma düzeyinin üzerinde ayarlanır. Vahşi tip hücreler toplanmaz; sadece GFP floresan için bir gating kontrolü olarak kullanılırlar. Vahşi tip numuneden belirlenen gating parametreleri ile, Lgr5-EGFP örneğinden hücreler daha sonra toplama için sıralanacak akış sitometresi boyunca çalıştırılır. Kapılar, belirli hücre popülasyonlarının net kümelenmesine uyum sağlamak için Lgr5-EGFP sıralamasının başında ayarlanabilir, ancak orta sıranın ortasında önemli ölçüde değiştirilmemelidir. Üç havuzlu Lgr5-EGFP CVP'nin ayrıştırmalarının ortalama 10.000 GFP+ hücre de dahil olmak üzere ~ 500.000 hücre verdiği bulunmuştur.
Organoidlerin optimal büyümesi ve farklılaşması için uygun medya ve kültür koşulları hayati öneme sahiptir. Lingual organoidleri kullanan önceki çalışmalar, medya bileşenlerini Wnt3a, EGF, Nogginve R-spondin 17 , 18 ,19, 20,21,22dahil olmak üzere bağırsak organoid alanından gelenlerden sonra modelledi. Bununla birlikte, lingual organoidler benzer bir yöntem (WENR ortamı) kullanılarak kültürlendiğinde, organoidler verimli bir şekilde büyümez (Şekil 5A). İnsan bağırsak organoidlerinde, organoid büyümesini teşvik etmek için A8301 (TGFß sinyal inhibitörü) ve SB202190 (p38 MAPKinaz sinyal inhibitörü) ilaçları kullanılır26. Gerçekten de, bu inhibitörlerin (WENRAS medyası) eklenmesi, lingual organoidlerin sağlam büyümesine neden olur (Şekil 5A). İlginçtir ki, bu inhibitörleri 6 gün sonra medyadan kaldırmak, genel TRC işaretleyicisi Kcnq1'indaha yüksek ifade edilmesiyle sonuçlanır A8301 ve SB202190'ın tat hücresi farklılaşmasına engel olduğunu düşündürür (Şekil 5B). Böylece, WENRAS medyasında organoidlerin sırasıyla 0-6 günlerinden, WENR ortamlarının ise 6-12 .
Organoid hücre tipi bileşimi qRT-PCR veya immünostokimya ile karakterize edilebilir. Olgun organoidler hem Kcnq1 ve KRT8 ile işaretlenmiş tat hücrelerini hem de Krt13 /KRT13(Şekil 6,8A)ile işaretlenmiş tatsız epitel hücrelerini içerir. Bu, izole LGR5+ hücrelerinin in vivo olduğu gibi benzer bir in vitroya sahip olduğunu göstermektedir, çünkü yetişkin dilinde, Lgr5-GFP+ hücreleri hem tat hem de tatsız soylar üretir5. Ayrıca, Krt13 tüm 3 TRC belirteçlerinden daha yüksek seviyelerde ifade edilir (Şekil 6), organoidlerin ağırlıklı olarak tatsız epitel hücrelerden oluştuğunu düşündürmektedir. Aslında, gen ekspresyumu27'nin göreceli nicelemesi, Krt13'ün genel TRC işaretleyicisi Kcnq1'den 50 kat daha yüksek ifade edildiğini gösterir (Student's t-test, p = 0.0004). Dil tatsız epitel1'ebenzer bir tat oranına sahip olduğu için bu beklenir. Organoidler her üç TRC tipünü de ifade eder (Şekil 6, 8B,C). Tip I hücreleri (Entpd2ile işaretlenmiş) ve acı tip II hücreler (Gnat3ile işaretlenmiş) tat organoidlerinde yüksek oranda ifade edilirken, ekşi algılama tipi III hücreleri (Car4ile işaretlenmiş) daha az yaygındır (Şekil 6). TRC'ler, in vivoolarak gözlenen ayrık tat tomurcuk yapılarında değil, organoidlerde rastgele dağıtılır (Şekil 8).
Şekil 1: Kesik dil ve soyulmuş CVP epitel. (A) Dil parçalara ayırılır ve ön dil, intermolar eminliğin (kesik çizgi) sadece ön kısmı kesilerek çıkarılır, CVP (kara kutu) (B) dahil olmak üzere arka dil bırakılarak, intermolar eminence'e (siyah ok) sadece ön kenar yerleştirilir ve enzim karışımı CVP'nin (kara kutu) altına ve yan kenarlarına enjekte edilir. (C) CVP siperlerini çevreleyen soyulmamış soyulmuş epitel (siyah oklar) ve (D) kesilmiş soyulmuş CVP epitel. Von Ebner'in bezleri ve kanalları(D, siyah oklar) siperlerin başarılı bir şekilde soyulması sonrasında görülebilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lingual organoid üretimi iş akışı. Dil Lgr5-EGFP farelerinden çıkarılır. CVP siper epitel (kırmızı kutu) alttaki bağ dokusundan soyulur ve tek hücrelere ayrıştırilir. GFP+ hücreler, 48 kuyulu bir plakada kuyu başına 200 hücre yoğunluğunda matris jel içinde izole edilir ve kaplanr. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Floresan-Aktif Hücre Sıralama için Gating. (A) Kontrol (vahşi tip CVP hücreleri) çalışması, ileri saçılma yoluyla döküntüleri ve kırık hücreleri ortadan kaldıracak FACS kapılarını belirler, yan dağılım genişliği yoluyla singlet'ları tanımlar, DAPIneg canlısını DAPI+ ölü hücrelerden ayırır ve vahşi tip hücrelerin otoflüoresans seviyesini oluşturur. (B) Daha önce belirlenen kapılar, enkazsız, tek, canlı, Lgr5-EGFP+ hücrelerini izole etmek için deneysel çalıştırmaya (Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 CVP hücreleri) uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Lingual organoid kültür zaman çizelgesi ve gerekli ortam. ROCK inhibitörü Y27632, hücre sağkalımını teşvik etmek için kültürün ilk 48 h'si için medyaya eklenir. Çoğalma aşamasında organoidler büyümeyi optimize etmek için A8301 ve SB202190 (WENRAS) içeren şartlandırılmış ortamla beslenir. Bu ilaçlar, farklılaşmayı teşvik etmek için 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İlaçlar A8301 ve SB202190 organoid büyümesini ve farklılaşmayı etkiler. (A) WENR medyasında (gün 0-12), WENRAS medyasında (gün 0-12) veya WENRAS'ta (gün 0-6), sonra WENR'de (6-12. gün) yetişen organoidlerin brightfield görüntüleri. Görüntüler, canlı görüntüleme yazılımı kullanılarak kültürün 2. Ölçek çubuğu: 400 μm (B) Organoid farklılaşması sırasında A8301 ve SB202190 ilaçları mevcut olduğunda küresel bir TRC işaretleyicisi Kcnq1'in bağıl gen ekspresyasyonu önemli ölçüde azalır. Her nokta, üç havuzlu kuyu içeren bir biyolojik kopyayı temsil eder. Göreceli gen ekspresyonunda (yatay çizgi) ortalama değişim ortalama üç biyolojik çoğalma ile hesaplanmıştır. Hata çubukları: ±SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Lingual organoidler kanonik tat hücresi belirteçlerini ifade eder. Küresel TRC işaretleyicisi Kcnq1'indöngü eşiği (Ct) değerindeki değişiklik, tatsız epitel belirteci sitokeratin 13 (Krt13), tip I TRC işaretleyici Entpd2, tip II acı TRC işaretleyici Gnat3ve tip III ekşi TRC işaretleyici Car4, temizlik geni Rpl19ile karşılaştırıldığında. Her nokta, 48 kuyulu bir plakadan üç havuzlu kuyu içeren bir biyolojik kopyayı temsil eder. Her belirteç için Ct değerindeki (yatay çizgi) ortalama değişim ortalama üç biyolojik kopya ile hesaplanmıştır. Eşleşmeyen Öğrencinin t-testi, *p < 0.05. Hata çubukları: ± SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Ters konfokal mikroskopi için lingual organoidlerin montajı. (A) Toksik olmayan modelleme kilinin ~1 mm kalınlığında bir dizesi oluşturulur. (B) Kil, 24 mm x 75 mm mikroskop kaydırağın ortasında ~20 mm x 20 mm kare olarak şekillendirilir. (C) 22 mm x 22 mm kare kapak keçesi, montaj ortamında asılı organoidleri kapatır. Ölçek çubuğu: 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Bozulmamış lingual organoidlerin immünoblabeling. Sabit, bağışıklığı baskılanmış organoidlerin konfokal görüntüleri. (A) Tatsız epitel işaretleyici KRT13 (yeşil) ve genel TRC işaretleyici KRT8 (macenta) için boyanmış bir organoidin optik bölümü. (B) Tip I glial benzeri hücre işaretleyici NTPDase2 (yeşil) ve KRT8 (macenta) için boyanmış bir organoid konfokal z yığınının maksimum projeksiyonu. (C) Kısmen gösterilen iki organoid (beyaz kesikli anahatlar) ve tip III ekşi tespit hücre işaretleyiciSI CAR4 (yeşil) ve sert algılama tipi II hücre işaretçisi GUSTDUCIN (macenta) için boyanmış bir konfokal z yığınının maksimum projeksiyonu. Ölçek çubuğu: A, B ve C. Nükleer işaretleyici DAPI (mavi, sağ sütun) için 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen Adı | İleri astar (5'-3') | Ters astar (5'-3') | Değerlendirme Numarası | ||||||
| Araba4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tablo 1: Nicel RT-PCR için kullanılan astar dizileri.
Ek Tablo 1: Yayınlanan lingual organoid kültür medya bileşenlerinin karşılaştırılması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bildirilen, yetişkin fare tadı kök hücrelerinden elde edilen lingual organoidleri kültleme, sürdürme ve işleme için etkili ve kolayca tekrarlanabilir bir yöntemdir. 8 ila 20 haftalık Lgr5-EGFP farelerinin üç CVP kullanmanın deneysel kullanım için ~ 10.000 GFP+ hücre elde etmek için yeterli olduğu ve 48 kuyu plakalarında kuyu başına 200 hücre yoğunluğunda 50 kuyu ile sonuçlandığını buldu. CVP hendek epitelinin çıkarılması, lingual epitelin taze yapılmış Dispase II ve tip-I Collagenase çözeltisi ile enjekte edilmesi ve ardından 33 dakikalık bir inkübasyon ile optimize edilir. Bununla birlikte, daha kısa bir kuluçka süresi, eski enzim aliquots, farklı lotlar veya farklı üreticilerin enzimlerini kullanmak eksik hendek çıkarılmasına neden olabilir. Tersine, daha uzun bir kuluçka süresi dokunun aşırı sindirimine neden olur ve tat dokusu bütünlüğünün kaybına neden olur. Peelingden sonra, CVP'yi çevreleyen epitel kırpılarak CVP siperleri için daha fazla zenginleştirme yapıldı.
Ayrışma ve toplama işlemi sırasında kullanılan tüm mikrosantrifüj tüplerinin, doku ve hücrelerin tüplerin plastik duvarlarına yapışmasını önlemek için FBS ile kaplanması kritik öneme sahiptir, bu da izole edilmiş hücrelerin geri kazanımını önemli ölçüde azaltır (veriler gösterilmez). Hafif bir FBS katını kullanmak ve kullanmadan önce tüplerden fazla sıvıyı çıkarmak, Tripsin veya diğer enzimler üzerindeki olası inhibitör etkileri en aza indirir.
Lingual organoidler, LGR5+ hücrelerin önceden sıralanmadan ayrışmış CVP dokusundan başarıyla yetiştirilmiştir17. Bu yöntem organoid oluşumu ile sonuçlansa da, bu organoidlerin daha küçük bir kısmının izole edilmiş atalardan yetişenlere kıyasla tat hücreleri içerdiğini bulduk (veriler gösterilmemektedir). Lgr5-EGFP+ hücreleri için akış sıralama, tat yetkin ataları için zenginleşir ve daha yüksek oranda tat ikmali organoidleri ile sonuçlanır. Şu anda, tüm hücreleri GFP otofluoresans eşiğinin üzerinde topluyoruz (Şekil 3); bununla birlikte, GFP parlaklık seviyelerinin değişken organoid şekillendirme verimliliği veya tat yeterliliği ile ilişkili olması mümkündür. Bu hipotez henüz test edilmemiştir, ancak tat hücresi içeren organoidlerin daha da zenginleştirilmesine izin verebileceğinden gelecekteki çalışmalar için umut verici bir yoldur.
Kaplama yoğunluğunun organoid farklılaşmanın verimliliğini etkilediği iyi bilinmektedir ve deneyden önce optimum kaplama yoğunluğunun belirlenmesini öneririz28. Kaplama yoğunluğu kurulurken kuyuların büyüklüğü ve derinliğinin yanı sıra matris jel hacmi de göz önünde bulundurulmalıdır. Ön çalışmalarımıza dayanarak (veriler gösterilmedi), 48 kuyulu bir plakada, 15 μL matris jeli ve kuyu başına 200 hücrelik bir kaplama yoğunluğunun, her üç TRC tipinin de verimli organoid genişlemesine ve farklılaşmasına izin verdiğini görüyoruz. Sentetik ve daha ucuz matris jel alternatifi olan Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Ekstresi'nde (RGF BME) lingual organoidlerin başarılı ve tekrarlanabilir bir şekilde kültürlenebileceğini bulduk. Diğer alternatif matrisler de lingual organoid kültürünü desteklese de, bu olasılığı araştırmak için daha fazla test yapılması gerekir.
Kaplama sırasında, toplanan hücreler hücre süspansiyonu homojen tutmak için sık sık yukarı ve aşağı pipetlenerek matris jelinde iyice ancak hafifçe yeniden kullanılmalıdır. Hücre matrisi jel karışımını içeren tüp, matris jelinin tüpün yanlarında jelleşmesini önlemek için tüm kaplama işlemi sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Bu önlemler, hücrelerin kuyular arasında eşit bir şekilde dağılımını sağlayarak, hücreleri elleriyle kapladığında daha tekrarlanabilir sonuçlar verir. Özellikle, mikroakışkan teknolojilerdeki son gelişmeler hücre dağıtımı için yüksek verim seçenekleri sağlar ve gelecekteki çalışmalar için umut verici bir araçtır29.
Kültürlü organoidlerde gen ekspresyonlarını değerlendirmek için, çoğaltmalar arasında yeterli RNA ve tutarlılık elde etmek için her biyolojik çoğaltma için en az üç kuyu havuzu yapılması gerektiği bulunmuştur (Şekil 6). Ayrıca, hasat edilen organoidlerin belirli üreticinin talimatlarına göre hemen yutulmasının, çıkarılan RNA'nın kalitesini ve miktarını optimize ettiği belirlenmiştir. Burada test olmasa da, depolama reaktiflerinde flaş dondurma veya yeniden depolama gibi diğer depolama seçenekleri de RNA verimini ve kalitesini koruyabilir.
Organoidler üzerinde immünhistokimya yapmak zor olabilir, çünkü birincil ve ikincil antikorlar herhangi bir kalıntı matris jeli ve tüm organoid epitellere nüfuz etmelidir. Önceki raporlarda, organoidler matris jelinde hala askıya alınırken sabitlenmiştir, bu da daha sonra protein ekspresyonunun ortaya çıkarmak için son derece yüksek konsantrasyonlarda birincil antikor çözeltisigerektirmiştir 17,18. Diğer raporlara benzer şekilde, fiksasyondan önce Hücre Kurtarma Çözeltisi kullanarak organoidlerin matris jelindençıkarılması,yüksek antikor konsantrasyonuna gerek kalmadan lekelenme verimliliğini artırdığı bulunmuştur30,31; bununla birlikte, CAR4 gibi bazı tat hücresi belirteçlerinin tespiti daha yüksek bir antikor konsantrasyonu gerektirir. Ayrıca, primer antiserada organoidlerin 3 gece kuluçkaya yatırılarak antikor bağlanma olasılığı artar. Bununla birlikte, organoidler immünostainasyondan sonra yeterince yıkanmazsa, bu yöntem arka plan floresansını da artırabilir. Daha da önemlisi, seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi kaydedilebilir ve bir haftadan az bir süre saklanırsa bir veya daha fazla kez başarıyla yeniden kullanılabilir (veriler gösterilmez). Optimum görüntüleme için organoidler, 3D yapılarını korumak için modelleme kilinin kil çevresinin üzerine bir kapak parçası yerleştirilerek monte edilir. Kapak camını doğrudan kaydırağın üzerine yerleştirmek organoidleri sıkıştırır ve kırarak uygun analizi önler.
Organoid kültürü son derece uygulanabilir, uygun maliyetli bir tekniktir. Bazı uygulamalar hastalık modellemesi ve ilaç taraması ile kök hücre ve gelişim biyolojisi çalışmasını içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir32. Bu nedenle, laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik sağlamak için organoid modellerinin standart hale getirmek çok önemlidir. Gelecekte, kök hücre gücünün seri geçitler üzerinde yayılabileceğini garanti eden ve böylece daha fazla organoid üretmek için ek hayvanlara olan ihtiyacı azaltan lingual organoidleri geçirmek için standartlaştırılmış bir yöntem geliştirmek yararlı olacaktır. Daha da önemlisi, lingual organoidler hem tat hem de tatsız epitel hücrelerden oluşurken, bu hücrelerin organizasyonu in vivo tat sistemine göre farklılık gösterir. Organoidler ve tat epitel in vivo arasındaki tutarsızlıklar organoid kültürü için kullanılan ortamdan ve/veya organoidlerin tat tomurcuk mikroçevresi ile etkileşimden yoksun olması nedeniyle, gustatory sinirlerden gelen önemli sinyaller ve tat tomurcuk oluşumu ve bakımı için gerekli olan lamina propriası da dahil olmak üzere22,33,34,35olabilir. Sinirleri veya vaskülatları lingual organoid kültürüne dahil etmek için gelecekteki çalışmalar, şu anda diğer organoid sistemlerinde benimsenen bir strateji, in vivo tat epitelinin daha doğru modellenmesine izin verebilir36,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, WNR şartlı medya ve değerli tartışmalar sağladıkları için Dr. Peter Dempsey ve Monica Brown'a (Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Organoid ve Doku Modelleme Paylaşılan Kaynağı) teşekkür eder. Ayrıca Colorado Üniversitesi Kanser Merkezi Hücre Teknolojileri ve Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynaklarına, özellikle Dmitry Baturin'e hücre sıralama uzmanlığı için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma şu şekilde finanse edildi: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 ve NIH/NCI R21 CA236480'den LAB'ye ve R21DC016131 ve R21DC016131-02S1'den DG'ye ve F32 DC015958'den EJG'ye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
