Summary
Protokollen presenterer en metode for dyrking og behandling av linguale organoider avledet fra smaksstammeceller isolert fra den bakre smaken papilla av voksne mus.
Abstract
Smakssansen formidles av smaksløker på tungen, som består av raskt fornyende smaksreseptorceller (TRCer). Denne kontinuerlige omsetningen drives av lokale stamceller og gjør smaksfunksjonen utsatt for forstyrrelser av en rekke medisinske behandlinger, noe som igjen påvirker livskvaliteten sterkt. Å studere denne prosessen i sammenheng med narkotikabehandling er derfor avgjørende for å forstå om og hvordan smaksforfedrederfunksjon og TRC-produksjon påvirkes. Gitt de etiske bekymringene og begrenset tilgjengelighet av menneskelig smaksvev, brukes musemodeller, som har et smakssystem som ligner på mennesker. Sammenlignet med in vivo-metoder, som er tidkrevende, dyre og ikke mottagelige for studier med høy gjennomstrømning, kan murine lingual organoider gjøre det mulig å kjøre eksperimenter raskt med mange replikeringer og færre mus. Her har tidligere publiserte protokoller blitt tilpasset og en standardisert metode for å generere smakorganoider fra smaksforfedrederceller isolert fra circumvallate papilla (CVP) av voksne mus presenteres. Smak forfedre celler i CVP uttrykke LGR5 og kan isoleres via EGFP fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) fra mus som bærer en Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 allele. Sorterte celler er belagt på et matrisegelbasert 3D-kultursystem og dyrket i 12 dager. Organoider utvides de første 6 dagene av kulturperioden via spredning og går deretter inn i en differensieringsfase, hvor de genererer alle tre smakscelletypene sammen med ikke-smak epitelceller. Organoider kan høstes ved modning på dag 12 eller når som helst under vekstprosessen for RNA-uttrykk og immunhiistokjemisk analyse. Standardisering av kulturmetoder for produksjon av linguale organoider fra voksne stamceller vil forbedre reproduserbarheten og fremme språklige organoider som et kraftig verktøy for legemiddelscreening i kampen for å hjelpe pasienter som opplever smaksdysfunksjon.
Introduction
Hos gnagere er lingual smaksløker plassert i soppform papiller fordelt fremre, bilateral foliat papillisk bakre, samt en enkelt circumvallate papilla (CVP) ved den bakre midtlinjen av tungen1. Hver smaksløk består av 50-100 kortvarige, raskt fornyende smaksreseptorceller (TRCer), som inkluderer type I glial-lignende støtteceller, type II-celler som oppdager søte, bitre og umami, og type III-celler som oppdager sure2,3,4. I musen CVP produserer LGR5+ stamceller langs basal lamina alle TRC-typer samt ikke-smak epitelceller5. Når du fornyer smakslinjen, blir LGR5-datterceller først spesifisert som post-mitotic smak forløperceller (type IV-celler) som skriver inn en smaksløk og er i stand til å differensiere i noen av de tre TRC-typene6. Den raske omsetningen av TRCer gjør smakssystemet utsatt for forstyrrelser ved medisinske behandlinger, inkludert stråling og visse legemiddelbehandlinger7,8,9,10,11,12,13. Dermed er det viktig å studere smakssystemet i sammenheng med smaksstammecelleregulering og TRC-differensiering for å forstå hvordan du kan redusere eller forhindre smaksdysfunksjon.
Mus er en tradisjonell modell for in vivo-studier i smaksvitenskap siden de har et smakssystem organisert på samme måte som mennesker14,15,16. Mus er imidlertid ikke ideelle for studier med høy gjennomstrømning, da de er dyre å vedlikeholde og tidkrevende å jobbe med. For å overvinne dette har in vitro organoide kulturmetoder blitt utviklet de siste årene. Smak organoider kan genereres fra innfødt CVP vev, en prosess der organoider knopper av fra isolert mus CVP epitel dyrket ex vivo17. Disse organoidene viser et flerlags epitel i samsvar med in vivo smakssystemet. En mer effektiv måte å generere organoider som ikke krever ex vivo CVP kultur ble utviklet av Ren et al. i 201418. Tilpasningsmetoder og kulturmedier utviklet seg først for å vokse tarmorganoider, de isolerte enkle Lgr5-GFP+ stamceller fra mus CVP og belagt dem i matrisegel19. Disse enkeltcellene genererte linguale organoider som sprer seg i løpet av de første 6 dagene av kulturen, begynner å skille seg rundt dag 8, og ved slutten av kulturperioden inneholder ikke-smak epitelceller og alle tre TRC-typer18,20. Til dags dato har flere studier som bruker det linguale organoidmodellsystemet blitt publisert17,18,20,21,22; Metoder og kulturforhold som brukes til å generere disse organoidene varierer imidlertid på tvers av publikasjoner (Supplerende tabell 1). Dermed har disse metodene blitt justert og optimalisert her for å presentere en detaljert standardisert protokoll for kulturen av lingual organoider avledet fra LGR5+ forfedre av voksen mus CVP.
Lingual organoider gir en unik modell for å studere cellebiologiske prosesser som driver smakscelleutvikling og fornyelse. Etter hvert som anvendelsene av linguale organoider utvides og flere laboratorier beveger seg mot å bruke in vitro organoid-modeller, er det viktig at feltet streber etter å utvikle og vedta standardiserte protokoller for å forbedre reproduserbarheten. Etablering av linguale organoider som et standardverktøy innen smaksvitenskap ville muliggjøre studier med høy gjennomstrømning som erter fra hverandre hvordan enkeltstammeceller genererer de differensierte cellene i det voksne smakssystemet. I tillegg kan linguale organoider brukes til raskt å screene legemidler for potensielle påvirkninger på smak homeostase, som deretter kan undersøkes grundigere i dyremodeller. Denne tilnærmingen vil til slutt styrke innsatsen for å utarbeide terapier som forbedrer livskvaliteten for fremtidige narkotikamottakere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrene ble utført i et AAALAC-akkreditert anlegg i samsvar med Guide for care and use of Laboratory Animals, Animal Welfare Act og Public Health Service Policy, og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Colorado Anschutz Medical Campus. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 mus som brukes i denne protokollen er fra The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
MERK: Følgende trinn bør fullføres før du begynner å sikre jevn og rettidig progresjon av protokollen: sett vannbadet til 37 °C, sett sentrifuge til 4 °C, lag injeksjons- og dissosiasjonsenzymløsninger fra 10 mg/ml Dispase,Collagenase og Elastase lagerløsninger (se Materialtabell), fjern matrisegelen fra -20 °C fryser (~750 μL nødvendig for en 48-brønnsplate) og tine ved å senke hetteglasset i is for ved minst 3-4 t, pre-coat mikrocentrifuge rør i ufortynnet FBS ved å gynge forsiktig ved romtemperatur i minst 30 min (to 2 ml rør for vevsoppsamling, to 1,5 ml rør for dissosierte celler, og ett 1,5 ml rør for innsamling av enkeltceller fra cellesortering; fjern overflødig FBS før bruk).
1. Isolering av CVP epitel
MERK: For å få nok LGR5+ celler for en full 48-brønns plate, samle tre Lgr5-EGFP CVPer i samme rør og prosess samtidig. Det er viktig å høste og behandle CVP for minst ett vilt type kull parallelt i et eget rør og bruke det som en gatingkontroll for å angi FACS-parametere (se Representative Results).
- Euthanize musene med CO 2-kvælning i henhold til IACUC-forskrifter, etterfulgt av en godkjent sekundær metode som bilateral thoracotomy, cervical dislocation, decapitation eller exsanguination.
- Bruk stor steril disseksjon saks for å kutte kinnene og bryte kjeven. Løft tungen og kutt den språklige frenulumen for å skille tungen fra gulvet i munnhulen. Klipp ut tungen og samle den i steril iskald Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (dPBS) med Ca2+ og Mg2+.
- Fjern og kast den fremre tungen ved å skjære bare fremre av den intermolare eminensen med et barberblad (Figur 1A, stiplet linje). Bruk en delikat oppgaveserviett for å fjerne hår og overflødig væske fra den bakre tungen.
- Fyll 1 ml sprøyte med 200-300 μL injeksjonsenzymoppløsning (sluttkonsentrasjon: 2 mg/ml type-I kollagenase og 5 mg/ml dispase II ica. 2+/Mg2+-inneholdende dPBS, fortynnet fra 10 mg/ml lagerløsninger) og sett inn en 30 G x 1/2 nål like over den intermolare eminensen (Figur 1B, svart pil) til bare fremre til CVP ( Figur1B, svart boks). Injiser enzymoppløsningen under og ved sidekantene av CVP mellom epitelet og det underliggende vevet (lamina propria, muskel). Trekk sprøyten langsomt og kontinuerlig ut av tungen mens injeksjonen utføres.
- Inkuber tungen i steril Ca2+/Mg2+-fri dPBS ved romtemperatur i nøyaktig 33 min.
- Lag små kutt i epitelet bilateralt og bare fremre til CVP ved hjelp av ekstra fin disseksjon saks, og skrell epitelet forsiktig ved å løfte det med fine tang. Når grøftepitelet er fritt for det underliggende bindevevet, plasserer du det i et tomt 2 ml mikrosenterrør forhåndsbelagt med FBS. Klipp epitelet før eller etter at CVP-epitelet er tatt av (Figur 1C, D).
2. Dissosiasjon av CVP epitel
MERK: Dissosiasjon av CVP-epitelet og platingen er representert grafisk i figur 2.
- Tilsett dissosiasjonsenzymcocktailen (sluttkonsentrasjon: 2 mg/ml type-I Kollagenase, 2 mg/ml Elastase og 5 mg/ml Dispase II i Ca2+/Mg2+som inneholder dPBS, fortynnet fra 10 mg/ml lagerløsninger) til rør som inneholder skrelt CVP-epithelia (200 μL per CVP). Inkuber i et 37 °C vannbad i 45 minutter. Vortex kort hver 15 min.
MERK: Førkrigs 0,25% Trypsin-EDTA i 37 °C vannbad i løpet av de siste 15 min av enzymcocktailinkubasjon. - Etter inkubasjon triturerer virvel (tre pulser) deretter med en pasteurpipette i glass i 1 min. Etter at vevstykker har avgjort seg, pipetterer du supernatanten som inneholder første samling av dissosierte celler, til nye FBS-belagte 1,5 ml mikrocentrifugerør som tilsvarer genotypen. Behandle de resterende vevsdelene ytterligere som beskrevet i trinn 2.3. under.
- Snurr supernatanten i 5 min ved 370 x g og 4 °C til pelletsceller.
- Fjern den resulterende supernatanten og resuspend cellepellet i Fluorescence-Aktivert cellesortering (FACS) Buffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) og 1% FBS i Ca2 +/ Mg2 +- gratis PBS (50 μL per CVP)). Oppbevar på is.
- Mens du utfører trinn 2.2.1 og 2.2.2, dissociate de resterende vev stykker fra trinn 2.2 ved å legge forvarmet 0.25% trypsin-EDTA (200 μL per CVP) til den opprinnelige 2 ml microcentrifuge rør og inkubere i en 37 °C vannbad i 30 min. Vortex kort hver 10 min.
- Etter inkubasjon, virvel røret som inneholder vev stykker (tre pulser) deretter triturate med et glass Pasteur pipette i 1 min. Etter at vevstykker har avgjort seg, pipetterer du supernatanten inn i 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder celler fra trinn 2.2.2. Kast rørene som inneholder de resterende vevsstykkene.
- Snurr rørene med dissosierte celler i 5 min ved 370 x g og 4 °C til pelletsceller.
- Fjern supernatant og resuspendcellepellets i FACS Buffer (100 μL per CVP). Oppbevar på is.
- Før cellene gjennom et 30 μm nylonnettfilter og tilsett DAPI (λutslipp = 450 nm) til celleblandinger før FACS. Isoler Lgr5-GFP+ celler via FACS ved hjelp av den grønne fluorescerende proteinkanalen (λexcitation = 488 nm; λutslipp = 530 nm). Sorter cellene ved hjelp av en 100 μm dyse i et friskt FBS-belagt 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 300 μL Ca2+/ Mg2 + gratis dPBS. Legg cellene på is til de er plating.
3. Plating av Lgr5-EGFP celler
- Bestem volumet av LGR5+ cellefjæring mottatt fra strømningscytometeret.
- Basert på antall celler hentet fra sorteringen, beregn antall celler per μL. Bestem deretter volumet som trengs for å oppnå ønsket antall celler for plating (vi bruker 200 celler per brønn av en 48-brønns plate) og overfør det totale volumet av suspenderte celler til et nytt mikrosenterrør.
- Snurr røret i 5 min ved 370 x g og 4 °C til pelletsceller (pellets er kanskje ikke synlig). Fjern supernatanten og legg røret på is.
- Resuspend cellepellet forsiktig i riktig mengde matrisegel (15 μL per brønn for 48-brønnsplater); pipette opp og ned forsiktig for å distribuere celler grundig i matrisegel. Plasser 15 μL matrisegel/celleblanding i midten av hver brønn. Oppbevar mikrosentrifugerøret på is i et konisk rør på 50 ml under plating for å hindre at matrisegelen gelerer. Fortsett å blande matrisegel/celleblanding gjennom plating ved å pipettere opp og ned hver tredje brønn for å sikre en jevn fordeling av celler på tvers av brønner.
- Plasser platen i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2, ~95 % fuktighet) i 10 minutter for å tillate matrisegelgelling. Tilsett deretter 300 μL romtemperatur WENRAS + Y27632 medier til hver brønn og returner platen til inkubatoren.
4. Vedlikehold av organoid
MERK: Organoider dyrkes i konvensjonelle organoidmedier (WENR) som består av rekombinant EGF og 50% betingede medier som inneholder Wnt3a, Noggin og R-spondin23. Legemidler A8301 og SB202190 legges til de første 6 dagene av kulturperioden for å optimalisere veksten (WENRAS media) (figur 5), og deretter fjernes for å fremme differensiering (WENR media)20. Y27632 er lagt til de første 2 dagene av kulturen for å fremme overlevelse. Medieforholdene i forhold til kulturtidslinjen presenteres i figur 4.
- To dager etter plating, fjern WENRAS + Y27632 medier fra hver brønn ved hjelp av en 1 ml pipette, noe som sikrer ingen krysskontaminering. Tilsett 300 μL WENRAS-medier nedover siden av brønnen for ikke å forstyrre matrisegelen. Returner platen til inkubatoren.
- Endre mediet annenhver dag ved hjelp av riktige medier for kulturstadiet (Figur 4). Vedlikehold organoider til dag 12, når organoidene er klare til å høste.
5. RNA-behandling
- Høsting av organoider for RNA
- Legg 48-brønnsplate på is i 30 min for å depolymerisere matrisegelen.
- Bruk en 1 ml pipette, trekk opp organoidmediet; Deretter, når media returneres til brønnen, bruk spissen av pipetten til å klø og videre bryte opp matrisegelen. Overfør innholdet til et 1,5 ml mikrosenterrør, og samle innholdet i tre brønner i ett rør. Sentrifuger rørene i 5 min ved 300 x g ved romtemperatur.
- Fjern så mye media supernatant som mulig uten å fjerne organoider; Deretter spinner du ned rør igjen i 5 min ved 300 x g ved romtemperatur.
- Fjern de resterende mediene og resuspender organoidene i 350 μL lysisbuffer + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME per 1 ml lysisbuffer). Plasser prøvene på is for umiddelbar RNA-ekstraksjon eller oppbevar ved -80 °C.
- Kvantitativ RT-PCR-analyse
- Mål RNA-mengde via spektrofotometer. Omvendt transkribering av RNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett.
- Bland cDNA tilsvarende 5 ng RNA med 200 nM forhåndsvalserte forover- og reversprimere (tabell 1) og fluorescerende PCR Master Mix. Kjør qRT-PCR-reaksjonen i 40 sykluser ved: 95 °C i 15 s, deretter 60 °C i 60 s.
6. Immunohistokjemi
- Høsting og festing av organoidene
- Plasser 48-brønnsplaten på is i 30 min for å løsne matrisegelen.
- Fjern organoidmediet og tilsett 400 μL iskald PBS til hver brønn. Fjern deretter PBS og tilsett 400 μL iskald cellegjenvinningsløsning til hver brønn. Gyng forsiktig ved 4 °C i 30 min.
- Belegge en 1 ml pipetspiss med 1 % BSA i PBS, og rør forsiktig innholdet i brønnen opp og ned for å bryte opp matrisegelen. Overfør organoidene til et 1,5 ml mikrosenterrør plassert på is.
- Skyll hver brønn med 300 μL PBS + 1% BSA og overfør eventuelle gjenværende organoider til de tilsvarende rørene. Fjern cell recovery løsning / PBS + BSA fra hvert rør. Tilsett 400 μL iskald PBS, og gjenta deretter med en annen iskald PBS-skylling.
- Fjern PBS og fest organoider med 300 μL iskald 4% PFA (i 0,1 M PB) i 20 min, inkuberer ved romtemperatur. Fjern PFA og skyll organoider med 400 μL iskald PBS.
- Fjern PBS; Tilsett deretter 400 μL PBS + 1% BSA. Oppbevars ved 4 °C.
- Immunfluorescensfarging
- Skyll organoider i 500 μL PBS + 1% BSA. Deretter inkuberer du organoider i blokkeringsløsning (5% normal geit eller eselserum, 1% bovint serumalbumin, 0,3% Triton X 100 i 1x PBS pH 7,3) i 2 timer, og gynger forsiktig ved romtemperatur.
- Tilsett den primære antistoffløsningen (primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning) og berg forsiktig i 3 netter ved 4 °C.
- Vask organoider 4x i 1 time med 500 μL PBS + 0,2% Triton, gynger forsiktig ved romtemperatur. Tilsett sekundær antistoffoppløsning (sekundære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning) og bergorganoider over natten, beskyttet mot lys, ved 4 °C.
- Vask organoider 3x i 1 time med 500 μL PBS + 0,2% Triton, beskyttet mot lys og gynger forsiktig ved romtemperatur. Inkuber med DAPI fortynnet 1:10,000 i 0,1 M PB i 20 min, rocking og dekket ved romtemperatur.
- Vask organoidene 3x i 20 min med 0,1 M PB, gyng forsiktig og tildekket ved romtemperatur.
- Skyv montering av organoider for invertert konfektmikroskopi.
MERK: Trinnvise bilder av skyvemonteringsprosessen vises i figur 7.- Lag en ~1 mm tykk 22 x 22 mm firkantet omkrets av ikke-giftig modelleringsleire på et mikroskopsklie.
- Fjern 0,1 M PB fra mikrocentrifugerøret, og resuspend organoider forsiktig i 100 μL monteringsmedium av valg; deretter overføres til midten av leireplassen.
- Fyll leireplassen til monteringsmediet er nesten til toppen. Plasser deretter 22 x 22 mm firkantede deksler over leire og trykk godt ned på sidene av dekslene for å forsegle. La det kurere i henhold til produsentens instruksjoner (her romtemperatur i 1-2 dager) og lagre ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus har en CVP, plassert bakre på tungen, hvorfra LGR5+ stamceller kan isoleres (Figur 1A, svart boks). Injeksjon av en enzymoppløsning under og rundt CVP (figur 1B) resulterer i liten hevelse i epitelet og fordøyelsen av bindevevet. Tilstrekkelig fordøyelse oppnås etter en 33 min inkubasjon, noe som gjør det enkelt separasjon av CVP-epitelet fra det underliggende vevet. Ved forsøk på å skrelle CVP-epitelet, bør det kuttes i tilstrekkelig avstand fra CVP for å sikre at grøftene ikke blir forstyrret eller skadet (figur 1C). Dette gjør det også mulig for en å gripe epitelet ved hjelp av tang uten å skade CVP. Trimming av epitelet rundt CVP fjerner ikke-målceller og øker effektiviteten til følgende trinn ved å redusere vevsmassen som manipuleres (Figur 1D). Det er viktig å kontrollere at de to grøftene (Figur 1C, svarte piler) er til stede før du legger til CVP-epitel i mikrocentrifugerøret; vellykket peeling av CVP inkluderer en del av Von Ebners kjertler og kanaler (Figur 1D, svarte piler). Hvis det skrellede epitelet ikke inneholder disse to ugjennomsiktige strukturene, er grøftepitelet mest sannsynlig revnet på grunn av ufullstendig fordøyelse av bindevevet.
For å etablere riktige FACS-innstillinger for å samle Lgr5-EGFP-celler, hentes celler fra dissosierte CVPer separat fra vill type og Lgr5-EGFP-mus. Wild type CVP-celler analyseres først for å etablere gatingparametere, en prosess der populasjoner av celler er kategorisert innenfor scatterplot-utgangen etter egenskaper av interesse24. Her ble fire parametere brukt til å identifisere celler for plating. Den første parameteren, fremoverspredning, filtrerer ut partikler og rusk basert på det oppdagede overflateområdet. Denne parameteren fjerner ~70 % av alle oppdagede hendelser under sorteringen (Figur 3). Breddeparameteren filtrerer videre hendelser basert på størrelse for å sikre valg av enkeltceller (singlets). Omtrent 90 % av hendelsene er singlets (figur 3). Atommarkøren DAPI er tatt opp av døde, men ikke levende celler og tillater dermed at døde celler sorteres ut25. Denne protokollen optimaliserer celle levedyktigheten, siden over 90 % av hendelsene er aktive celler (figur 3). Til slutt er GFP-gatingparametere satt over autofluorescence-nivået av ville typeceller. Wild-typeceller samles ikke inn. de brukes utelukkende som en gating kontroll for GFP fluorescens. Med gatingparametere bestemt fra wild type-prøven, kjøres celler fra Lgr5- EGFP-prøvenderetter gjennom strømningscytometeret som skal sorteres for innsamling. Gates kan justeres i begynnelsen av Lgr5-EGFP-sorteringen for å imøtekomme klar klynge av visse cellepopulasjoner, men bør ikke endres betydelig mellomsortering. Det ble funnet at dissosiasjonen av tre samlede Lgr5-EGFP CVPer gir ~ 500,000 XNUMX celler, inkludert et gjennomsnitt på 10,000 GFP+ celler.
Riktige medie- og kulturforhold er avgjørende for optimal vekst og differensiering av organoider. Tidligere studier som brukte språklige organoider modellerte mediekomponentene etter de fra tarmorganoidfeltet, inkludert Wnt3a, EGF, Noggin og R-spondin17,18,19,20,21,22. Men når linguale organoider dyrkes ved hjelp av en lignende metode (WENR-medier), vokser organoider ikke effektivt (Figur 5A). I humane tarmorganoider brukes legemidler A8301 (en TGFß signalhemmer) og SB202190 (en p38 MAPKinase signalhemmer) til å fremme organoid vekst26. Faktisk induserer tilsetning av disse inhibitorene (WENRAS media) robust vekst av linguale organoider (figur 5A). Interessant nok resulterer fjerning av disse inhibitorene fra media etter 6 dager i høyere uttrykk for generell TRC-markør Kcnq1, noe som tyder på at A8301 og SB202190 hindrer smakscelledifferensiering (Figur 5B). Dermed oppnås optimal vekst og differensiering ved å dyrke organoider i WENRAS-medier fra henholdsvis dag 0-6 og WENR-medier fra henholdsvis dag 6-12 (figur 4, figur 5).
Organoid celletypesammensetning kan karakteriseres av qRT-PCR eller immunohistokjemi. Eldre organoider inneholder både smaksceller, merket med Kcnq1 og KRT8, og ikke-smak epitelceller, merket med Krt13/KRT13 (Figur 6, 8A). Dette antyder isolerte LGR5+ celler har en lignende potens in vitro som de gjør in vivo siden, i voksen tunge, Lgr5-GFP+ celler produserer både smak og ikke-smak avstamninger5. Videre uttrykkes Krt13 på høyere nivåer enn alle 3 TRC-markører (figur 6), noe som tyder på at organoider hovedsakelig består av ikke-smak epitelceller. Faktisk indikerer relativ kvantifisering av genuttrykk27 at Krt13 uttrykkes 50 ganger høyere enn den generelle TRC-markøren Kcnq1 (Student t-test, p = 0,0004). Dette forventes, da tungen har en lignende andel smak versus ikke-smak epitel1. Organoider uttrykker alle tre TRC-typer (Figur 6, 8B, C). Type I-celler (merket med Entpd2) og bitre type II-celler (merket med Gnat3) uttrykkes høyt i smakorganoider, mens sure sensing type III-celler (merket med Car4) er mindre vanlige (Figur 6). TRCer distribueres tilfeldig i organoider (figur 8) i stedet for i diskrete smaksløkstrukturer observert in vivo.
Figur 1: Dissekert tunge og skrelt CVP epitel. (A) Tungen spres ut, og den fremre tungen fjernes ved å kutte bare fremre av den intermolare eminensen (stiplet linje), forlater den bakre tungen, som inkluderer CVP (svart boks) (B) En nål settes inn bare fremre til intermolar eminens (svart pil), og enzymblanding injiseres under og til sidekantene på CVP (svart boks). (C) Untrimmed peeled epitel rundt CVP grøfter (svarte piler) og (D) trimmet skrelt CVP epitel. Von Ebners kjertler og kanaler (D, svarte piler) er synlige etter vellykket peeling av skyttergravene. Skalastang: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for lingual organoidgenerering. Tungen er fjernet fra Lgr5-EGFP mus. CVP grøft epithelia (rød boks) skrelles fra det underliggende bindevevet og dissosieres i enkeltceller. GFP+ celler er isolert og belagt i matrisegel med en tetthet på 200 celler per brønn i en 48-brønns plate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gating for fluorescensaktivert cellesortering. (A) Kontrollen (wild type CVP-celler) kjører bestemmer FACS-portene som eliminerer rusk og ødelagte celler via fremoverspredning, identifiserer singlets via sidespredningsbredde, skiller DAPIneg live fra DAPI+ døde celler, og etablerer autofluorescence-nivået av ville type celler. (B) Tidligere bestemte porter brukes på eksperimentell kjøring (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP-celler) for å isolere ruskfrie, enkle, levende, Lgr5-EGFP+ celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidslinje for lingual organoid kultur og nødvendige medier. ROCK-hemmer Y27632 legges til media for de første 48 h kultur for å fremme celleoverlevelse. I spredningsfasen mates organoider betinget medium som inneholder A8301 og SB202190 (WENRAS) for å optimalisere veksten. Disse stoffene holdes tilbake fra media (WENR) fra dag 6 for å fremme differensiering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Legemidler A8301 og SB202190 påvirker organoid vekst og differensiering. (A) Brightfield-bilder av organoider dyrket i enten WENR-medier (dag 0-12), WENRAS-medier (dag 0-12) eller WENRAS (dag 0-6), deretter WENR (dag 6-12). Bilder ble tatt på dag 2, dag 6 og dag 12 av kulturen ved hjelp av live bildeprogramvare. Skala bar: 400 μm (B) Relativ genuttrykk av en global TRC markør Kcnq1 er betydelig redusert når narkotika A8301 og SB202190 er til stede under organoid differensiering. Hvert punkt representerer en biologisk replikering, som inkluderte tre samlede brønner. Gjennomsnittlig endring i relativ genuttrykk (horisontal linje) ble beregnet ved gjennomsnittet av tre biologiske replikeringer. Feilfelt: ±SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Lingual organoider uttrykker kanoniske smakscellemarkører. Endring i syklusterskelverdi (Ct) for global TRC-markør Kcnq1, ikke-smak epitelmarkør cytokeratin 13 (Krt13), type I TRC-markør Entpd2, type II bitter TRC-markør Gnat3og type III sur TRC-markør Car4, sammenlignet med rengjøringsgenet Rpl19. Hvert punkt representerer en biologisk replikering, som inkluderte tre sammenssamlede brønner fra en 48-brønnsplate. Gjennomsnittlig endring i Ct-verdi (vannrett linje) for hver indikator ble beregnet ved å beregne gjennomsnittet av tre biologiske replikeringer. Ikke-sammenkoblet student t-test, * p < 0,05. Feilfelt: ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Montering av linguale organoider for invertert konfokal mikroskopi. (A) Det opprettes en ~1 mm tykk streng med ikke-giftig modelleringsleire. (B) Leiren er utformet som en ~20 mm x 20 mm firkant i midten av en 24 mm x 75 mm mikroskop lysbilde. (C) En 22 mm x 22 mm firkantet dekslerlip tetninger organoider suspendert i monteringsmedium. Skalastang: 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Immunregulering av intakte linguale organoider. Confocal bilder av faste, immunosterte organoider. (A) Optisk del av en organoid farget for ikke-smak epitelmarkør KRT13 (grønn) og generell TRC-markør KRT8 (magenta). (B) Maksimal projeksjon av en konfokal z-stabel med en organoid farget for type I glial-lignende cellemarkør NTPDase2 (grønn) og KRT8 (magenta). (C) Maksimal projeksjon av en konfokal z-stabel med to delvis viste organoider (hvit-stiplede konturer) og en komplett organoid farget for type III surt detekterende cellemarkør CAR4 (grønn) og bittert detekterende type II cellemarkør GUSTDUCIN (magenta). Skalalinje: 100 μm for A, B og C. Kjernefysisk markør DAPI (blå, høyre kolonne). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gen navn | Fremoverprimer (5'-3') | Omvendt primer (5'-3') | Vurderingsnummer | ||||||
| Bil4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tabell 1: Primersekvenser som brukes til kvantitativ RT-PCR.
Supplerende tabell 1: Sammenligning av publiserte linguale organoidkulturmediekomponenter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rapportert her er en effektiv og lett repeterbar metode for dyrking, vedlikehold og behandling av språklige organoider avledet fra voksne musesmak stamceller. Det ble funnet at bruk av tre CVPer fra 8 til 20 uker gamle Lgr5-EGFP-mus er tilstrekkelig til å oppnå ~ 10.000 GFP+ celler for eksperimentell bruk, noe som resulterer i 50 brønner belagt med en tetthet på 200 celler per brønn i 48-brønnsplater. Fjerning av CVP grøft epithelia er optimalisert ved å injisere lingual epitel med nylaget Dispase II og type-I Collagenase løsning, etterfulgt av en 33 min inkubasjon. Imidlertid kan en kortere inkubasjonstid, gamle enzym aliquots, forskjellige partier eller bruk av enzymer fra forskjellige produsenter føre til ufullstendig fjerning av grøft. Omvendt forårsaker en lengre inkubasjonstid over fordøyelsen av vevet, noe som resulterer i tap av smaksvevsintegritet. Etter peeling ble ytterligere berikelse for CVP-grøfter gjort ved å trimme bort epitelet rundt CVP.
Det er kritisk at alle mikrocentrifuge rør som brukes under dissosiasjons- og innsamlingsprosessen er belagt med FBS for å forhindre at vev og celler holder seg til rørenes plastvegger, noe som reduserer utvinningen av isolerte celler betydelig (data ikke vist). Bruk av et lett lag med FBS og fjerning av overflødig væske fra rørene før bruk minimerer mulige hemmende effekter på Trypsin eller andre enzymer.
Lingual organoider har blitt dyrket vellykket fra dissosiert CVP vev uten forutgående sortering av LGR5+ celler17. Selv om denne metoden resulterer i dannelse av organoider, har vi funnet ut at en mindre andel av disse organoidene inneholder smaksceller sammenlignet med de som vokser fra isolerte forfedre (data ikke vist). Flow sortering for Lgr5-EGFP+ celler beriker for smak-kompetente forfedre, noe som resulterer i en høyere andel smak-fylt organoider. For tiden samler vi alle celler over terskelen til GFP autofluorescence (Figur 3); Det er imidlertid mulig at GFP-lysstyrkenivåer er forbundet med variabel organoid som danner effektivitet eller smakskompetanse. Denne hypotesen er ennå ikke testet, men er en lovende mulighet for fremtidig arbeid, da det kan tillate ytterligere berikelse av smakscelleholdige organoider.
Det er velkjent at plating tetthet påvirker effektiviteten av organoid differensiering, og vi anbefaler at optimal plating tetthet bestemmes før eksperimentering28. Størrelsen og dybden på brønnene, samt matrisegelvolum, bør vurderes ved etablering av platingtetthet. Basert på vårt foreløpige arbeid (data ikke vist), finner vi at i en 48-brønns plate tillater 15 μL matrisegel og en platingtetthet på 200 celler per brønn effektiv organoid ekspansjon og differensiering av alle tre TRC-typer. Vi har funnet ut at lingual organoider kan dyrkes vellykket og reprodusert i Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract (RGF BME), et syntetisk og rimeligere matrisegelalternativ. Andre alternative matriser kan også støtte lingual organoidkultur, men videre testing er nødvendig for å undersøke denne muligheten.
Under plating bør oppsamlede celler være grundig, men forsiktig resuspendert i matrisegel ved ofte pipettering opp og ned for å holde celleopphenget homogent. Røret som inneholder cellematrisegelblandingen, bør også holdes på is under hele platingprosessen for å forhindre at matrisegelen gelerer på sidene av røret. Disse tiltakene sikrer en jevn fordeling av celler på tvers av brønner, noe som gir mer reproduserbare resultater når hånd-plating celler. Spesielt gir den siste utviklingen innen mikrofluidisk teknologi høye gjennomstrømningsalternativer for celledispensering og er et lovende verktøy for fremtidig arbeid29.
For å vurdere genuttrykk i dyrkede organoider ble det funnet å være nødvendig å samle minst tre brønner for hver biologiske replikering for å oppnå tilstrekkelig RNA og konsistens på tvers av replikeringer (figur 6). Det ble også fastslått at umiddelbart lysing høstede organoider i henhold til spesifikke produsentens instruksjoner optimaliserer kvaliteten og mengden ekstrahert RNA. Selv om de ikke er testet her, kan andre lagringsalternativer som flash-frysing eller resuspension i lagringsreagenser også bevare RNA-utbytte og kvalitet.
Å utføre immunhiistokjemi på organoider kan være utfordrende, da primære og sekundære antistoffer må trenge inn i enhver gjenværende matrisegel og hele organoid epitelet. I tidligere rapporter ble organoider løst mens de fortsatt var suspendert i matrisegel, som senere krevde ekstremt høye konsentrasjoner av primær antistoffløsning for å avsløre proteinuttrykk17,18. I likhet med andre rapporter ble det funnet å fjerne organoider fra matrisegel ved hjelp av Cell Recovery Solution før fiksering for å øke effektiviteten av farging uten behov for en høy antistoffkonsentrasjon30,31; Imidlertid krever påvisning av noen smakscellemarkører, for eksempel CAR4, en høyere konsentrasjon av antistoff. Videre øker inkubering av organoider i primær antisera i 3 netter sannsynligheten for antistoffbinding. Denne metoden kan imidlertid også øke bakgrunnsfluorescensen hvis organoider ikke vaskes tilstrekkelig etter immunstaining. Det er viktig at fortynnet primær antistoffløsning kan lagres og brukes på nytt en eller flere ganger hvis den lagres i mindre enn en uke (data ikke vist). For optimal avbildning er organoider montert ved å plassere en dekslelip på toppen av en leire omkrets av modellering av leire for å bevare sin 3D-struktur. Plassering av dekselglasset direkte på lysbildet komprimerer og bryter organoider, og forhindrer riktig analyse.
Organoid kultur er en svært anvendelig, kostnadseffektiv teknikk. Noen applikasjoner inkluderer, men er ikke begrenset til, sykdomsmodellering og legemiddelscreening og studiet av stamcelle- og utviklingsbiologi32. Derfor er det avgjørende å standardisere organoidmodeller for å tillate reproduserbarhet på tvers av laboratorier. I fremtiden vil det være nyttig å utvikle en standardisert metode for å passere linguale organoider som garanterer at smake stamcellestyrke kan forplantes over serielle passasjer, og dermed redusere behovet for flere dyr for å generere flere organoider. Viktig, mens lingual organoider består av både smak og ikke-smak epitelceller, er organiseringen av disse cellene forskjellig sammenlignet med in vivo smakssystemet. Avvik mellom organoider og smak epitel in vivo kan skyldes media som brukes til organoid kultur og / eller fordi organoider mangler interaksjon med smaksløkmikromiljøet, inkludert viktige signaler fra gustatory nerver og lamina propria som kreves for smaksløkdannelse og vedlikehold22,33,34,35. Fremtidig arbeid for å innlemme nerver eller vaskulatur i lingual organoidkultur, en strategi som for tiden blir vedtatt i andre organoidsystemer, kan tillate mer nøyaktig modellering av in vivo smak epitel36,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Peter Dempsey og Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) for å gi WNR betingede medier og verdifulle diskusjoner. Vi takker også University of Colorado Cancer Center Cell Technologies og Flow Cytometry Shared Resources, spesielt Dmitry Baturin, for cellesorteringsekspertise. Dette arbeidet ble finansiert av: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 og NIH/NCI R21 CA236480 til LAB, og R21DC016131 og R21DC016131-02S1 til DG, og F32 DC015958 til EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
