Summary
このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。
Abstract
味覚は舌の味覚芽によって媒介され、急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成されています。この継続的な売上高は、局所的な前駆細胞によって動力を与えられ、多数の医療によって混乱を招きやすい味覚機能を提供し、生活の質に深刻な影響を与えます。したがって、薬物治療の文脈でこのプロセスを研究することは、味前駆物質機能とTRC産生が影響を受けるかどうか、そしてどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。倫理的な懸念と人間の味の組織の限られた可用性を考えると、マウスモデルは、人間と同様の味覚システムを持つ、一般的に使用されています。時間がかかり、高価で、高スループットの研究に適していない in vivo 方法と比較して、マウスリングアルガノイドは、多くの複製と少ないマウスで実験を迅速に実行することができます。ここで、以前に公開されたプロトコルが適応され、成体マウスの周回乳頭(CVP)から分離された味覚前駆細胞からオルガノイドの味覚を生成するための標準化された方法が提示されている。CVP発現LGR5中の前駆細胞を味わい、Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 アレルを運ぶマウスからEGFP蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単離することができる。並べ替えられた細胞は、マトリックスゲルベースの3D培養システムにメッキされ、12日間培養されます。オルガノイドは、増殖を介して培養期間の最初の6日間増殖し、その間に非味上皮細胞と共に3つの味細胞タイプすべてを生成する分化段階に入る。オルガノイドは、12日目の成熟時、またはRNA発現および免疫組織化学分析のための成長過程でいつでも収穫することができる。成体幹細胞から言語性オルガノイドを生産するための培養方法を標準化することは、味覚機能障害を経験している患者を助けるために戦いの強力な薬物スクリーニングツールとして再現性を向上させ、言語オルガノイドを進めます。
Introduction
げっ歯類では、舌の後臭中線で舌の舌の前に分布する乳頭の真菌、両側葉乳頭、ならびに単一の周回乳頭(CVP)に舌の味覚芽が収容される。各味覚芽は、50〜100の短命で急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成され、I型グリア様支持細胞、甘味、苦い、旨味を検出するII型細胞、酸味2、3、4を検出するIII型細胞が含まれる。マウスCVPにおいて、基底層に沿ったLGR5+幹細胞は、非味の上皮細胞と同様に、すべてのTRCタイプを産生する5。味覚系統を更新する場合、LGR5娘細胞は、味覚芽に入り、3つのTRCタイプ6のいずれかに分化することができる、まず、味覚後前駆細胞(IV型細胞)として指定される。TRCの急速な回転は、放射線および特定の薬物療法を含む治療によって中断されやすい味覚システムをレンダリングします7,8,9,10 ,11,12,13.したがって、味覚機能の制御とTRC分化のコンテキストで味覚システムを研究することは、味覚機能障害を軽減または予防する方法を理解するために不可欠である。
マウスは、ヒト14、15、16と同様に組織された味覚システムを有するため、味覚科学におけるインビボ研究の伝統的なモデルである。しかし、マウスは維持コストが高く、作業に時間がかかるため、高スループット研究には適していません。これを克服するために、インビトロオルガノイド培養方法が近年開発されている。味オルガノイドは、天然のCVP組織から生成することができ、単離マウスCVP上皮培養ex vivo17からオルガノイドが芽を出すプロセスである。これらのオルガノイドは、インビボ味覚システムと一致する多層上皮を示す。ex vivo CVP培養を必要としないオルガノイドを生成するより効率的な方法は、2014年18年にRenらによって開発されました。腸オルガノイドを成長させるために最初に開発された方法および培養培地を適応させ、マウスCVPから単一のLgr5-GFP+前駆細胞を単離し、マトリックスゲル19にめっきした。培養の最初の6日間に増殖するこれらの単一細胞は、8日目頃に分化し始め、培養期間の終わりまでに非味覚上皮細胞および3種類のTRCタイプ18、20すべてを含む。現在までに、言語オルガノイドモデルシステムを利用した複数の研究が17、18、20、21、22に掲載されています。しかしながら、これらのオルガノイドを生成するために使用される方法と培養条件は、出版物によって異なる(補足表1)。したがって、これらの方法は、ここで調整され、成人マウスCVPのLGR5+前駆体に由来する言語オルガノイドの培養のための詳細な標準化されたプロトコルを提示するように最適化されている。
言語オルガノイドは、味細胞の発達と再生を駆動する細胞生物学的プロセスを研究するためのユニークなモデルを提供します。イン ビトロ オルガノイドモデルの活用に向けて、言語オルガノイドの応用が拡大し、ラボが増える中、再現性を高めるために標準化されたプロトコルの開発と採用に取り組む分野が重要です。味覚科学の中で標準的なツールとして言語オルガノイドを確立することは、単一の幹細胞が成体味システムの分化された細胞を生成する方法を引き離す高スループット研究を可能にする。さらに、舌間オルガノイドは、味の恒常性に影響を与える可能性のある薬物を迅速にスクリーニングするために使用することができ、動物モデルでより徹底的に調査することができます。このアプローチは、最終的には、将来の薬物レシピエントの生活の質を向上させる治療法を考案するための努力を強化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用ガイド、動物福祉法、公衆衛生サービスポリシーに従ってAAALAC認定施設で行われ、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用されるLgr5EGFP-IRES-CreERT2 マウスは、ジャクソン研究所、ストック第008875からである。
注:プロトコルのスムーズかつタイムリーな進行を確実にするために、次の手順を開始する前に完了する必要があります:37 °Cに水浴を設定し、 遠心分離機を4°Cに設定し、10mg/mLディスパス、コラゲナーゼ、エラスターゼストック溶液( 材料表を参照)から注入と解離酵素溶液を作り、-20°C冷凍庫(48ウェルプレートに必要な約750 μL)からマトリックスゲルを取り除き、氷にバイアルを浸して解凍します。少なくとも3〜4時間、希釈されていないFBSのプレコートマイクロ遠心チューブを、少なくとも30分間室温で穏やかに揺動させることで(組織採取用の2つの2つの2mLチューブ、解離された細胞用の2つの1.5mLチューブ、および細胞ソーターからの単一細胞の収集のための1つの1.5 mLチューブ;使用前に余分なFBSを除去する)。
1. CVP上皮の単離
注:フル48ウェルプレートに十分なLGR5+セルを得るために、同じチューブに3つのLgr5-EGFP CMPを収集し、同時に処理します。重要なのは、少なくとも1つの野生型のリッターのCVPを別のチューブで並行して収穫して処理し、FACSパラメータを設定するためのゲート制御としてそれを利用する(代表的な結果を参照)。
- IACUCの規則に従ってCO2 窒息でマウスを安楽死させ、続いて両側性回膜切除術、頸椎脱臼、切断、または排泄などの承認された二次的方法を行う。
- 大きな無菌解剖はさみを使用して頬を切断し、顎を壊します。舌を持ち上げ、舌を切り取り、舌を口腔の床から分離します。舌を切り取り、無菌の氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)でCa2+ とMg2+を収集します。
- カミソリの刃で間臼歯の前部を切り取ることによって前舌を取り除き、捨てる(図1A、破線)。後舌から髪と余分な液体を取り除くために繊細なタスクワイプを使用してください。
- 1 mL シリンジに200-300 μLの注射酵素溶液(最終濃度:2 mg/mL-I コラゲラーゼ、5 mg/mL ジスパーゼ II を Ca2+/Mg2+-dPBS で充填し、 10 mg/mL ストック溶液から希釈し、CVP(図1B、1B、)の前部になるまで、30 G x 1/2 針をインターモルエミデンス (図 1B、黒矢印) のすぐ上に挿入します。 ブラックボックス)。下の下の、下のCVPの側端に酵素溶液を注入し、下皮と下層組織(層状層、筋肉)の間に。注射が行われると、ゆっくりと、継続的に舌から注射器を引き出します。
- 正確に33分間室温で無菌Ca2+/Mg2+フリーdPBSで舌をインキュベートします。
- 上皮に二国間で小さな切り傷を加え、余分な細かい解剖はさみを使用してCVPの前部に切り、細かい鉗子で持ち上げて上皮をそっと剥がします。トレンチ上皮が下層の結合組織から解放されたら、FBSであらかじめコーティングされた空の2 mLマイクロ遠心チューブに入れる。CVP上皮を剥離する前または後に上皮のトリミングを行います(図1C,D)。
2. CVP上皮の解離
注: CVP 上皮とめっきの解離は 図 2にグラフィカルに表されています。
- 解離酵素カクテル(最終濃度:2mg/mLタイプIコラゲターゼ、2mg/mLエラスターゼ、および5mg/mLディスパーゼIIをCa2+/Mg 2+含有dPBSで、10mg/mLストック溶液から希釈)を皮をむいたCVPエピテリア(CVPあたり200μL)を含むチューブに加えます。37°Cの水浴で45分間インキュベートします。渦は15分ごとに短時間。
注:プレウォーム0.25%トリプシン-EDTAは、酵素カクテルインキュベーションの最後の15分の間に37°C水浴中に。 - インキュベートに続いて、渦(3パルス)をガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートします。組織片が沈着した後、ピペットは解化細胞の最初のコレクションを含む上清を、遺伝子型に対応する新しいFBSコーティングされた1.5 mLマイクロ遠心分離管に入る。残りの組織片をさらに工程2.3に記載されるように処理する。以下に。
- 上清を370xgで5分間、ペレット細胞に4°C回転させます。
- 得られた上清を除去し、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)バッファ(1 mM EDTA、25 mM HEPES(pH 7.0)および1%FBSのCa2+/Mg2+-free PBS(CVPあたり50 μL)で細胞ペレットを再懸濁します。氷の上に保管してください。
- ステップ2.2.1および2.2.2を実施しながら、ステップ2.2から残りの組織片を解離し、前もって加えた0.25%トリプシン-EDTA(CVPあたり200μL)を元の2mLマイクロ遠心チューブに加え、37°Cの水浴に30分間インキュベートします。渦は10分ごとに短時間。
- インキュベーションに続いて、組織片(3パルス)を含むチューブをボルテックスし、ガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートします。組織片が沈着した後、ステップ2.2.2から細胞を含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに上清をピペットする。残りの組織片を含むチューブを捨てます。
- 370 x g で 5 分間解約した細胞と 4 °C の細胞をペレットセルにスピンします。
- FACSバッファ(CVPあたり100 μL)の上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁します。氷の上に保管してください。
- 30 μm ナイロン メッシュフィルタを通してセルを通過し、FACS の前に DAPI (λ放出= 450 nm) をセル混合物に追加します。緑色蛍光タンパク質チャネル(λ励起= 488 nm;λ放出=530nm)を使用してFACSを介してLgr5-GFP+細胞を単離する。100 μm のノズルを使用して、300 μL の Ca2+/Mg2+フリー dPBS を含む新しい FBS コーティングされた 1.5 mL マイクロ遠心チューブに細胞を並べ替えます。めっきするまで氷の上に細胞を置きます。
3. Lgr5-EGFP細胞のめっき
- フローサイトメーターから受け取ったLGR5+細胞懸濁液の体積を決定します。
- ソーターから得られた細胞数に基づいて、μL当たりの細胞数を計算します。次に、めっきに必要な数の細胞を得るために必要な体積を決定し(48ウェルプレートのウェルあたり200細胞を使用します)、その総懸濁細胞の体積を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 370 x g で 5 分間、ペレット細胞に 4 °C (ペレットが見えない場合があります) にチューブを回転させます。上清を取り除き、チューブを氷の上に置きます。
- 適切な量のマトリックスゲル(48ウェルプレートの場合はウェルあたり15 μL)で細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。ピペットを上下に緩やかにして、マトリックスゲルで細胞を完全に分配します。各ウェルの中央に15μLのマトリックスゲル/セル混合物を入れます。メッキ中にマイクロ遠心チューブを氷の上に50 mLの円錐チューブに入れたままにして、マトリックスゲルがゲル化するのを防ぎます。ウェル全体の細胞の均等な分布を確保するために、3つのウェルごとに上下にピペットを介してメッキ全体でマトリックスゲル/細胞混合物を混合し続けます。
- プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)に10分間置き、マトリックスゲル化を可能にします。次に、300 μL の室温 WENRAS + Y27632 培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。
4. オルガノイドメンテナンス
注:オルガノイドは、組換えEGFおよびWnt3a、ノギン、およびR-spondin23を含む50%のコンディショニング培地を含む従来のオルガノイド培地(WENR)で増殖される。A8301およびSB202190は、培養期間の最初の6日間に対して、成長を最適化するために添加される(WENRAS培地)(図5)、次いで分化を促進するために除去される(WENR培地)20。Y27632は、生存を促進するために培養の最初の2日間に添加される。カルチャのタイムラインに関連するメディア条件を 図 4に示します。
- めっきの2日後、1 mL ピペットを使用して各ウェルからWENRAS + Y27632培地を取り出し、クロスコンタミネーションを防ぎます。ウェルの側面に300 μLのWENRAS培地を加えて、マトリックスゲルを破壊しないようにします。プレートをインキュベーターに戻します。
- カルチャ段階に適したメディアを使用して、2 日ごとにメディアを変更します (図 4)。オルガノイドは、オルガノイドが収穫する準備ができている12日目まで維持します。
5. RNA処理
- RNA用オルガノイドの収穫
- 48ウェルプレートを氷の上に30分間置き、マトリックスゲルを脱重化します。
- 1 mL ピペットを使用して、オルガノイドメディアを引き上げます。次に、媒体がウェルに戻されると、ピペットの先端を使用して、マトリックスゲルを引っ掻いてさらに分解します。1つの管の3つの井戸の内容物をプールする1.5 mLのマイクロ遠心分離管に内容物を移す。室温で300×gで5分間チューブを遠心分離します。
- オルガノイドを除去することなく、できるだけ多くのメディア上清を除去する。その後、室温で300 x g で5分間チューブを再びスピンダウンします。
- 残りの培地を取り出し、オルガノイドを350μLのリシスバッファー+βメルカプトエタノール(βME)(1mLのリシスバッファーあたり10 μL βME)で再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、すぐにRNA抽出を行うか、-80°Cで保存します。
- 定量的RT-PCR分析
- 分光光度計を介してRNA量を測定します。cDNA合成キットを使用してRNAを逆転写します。
- 200 nM 事前検証されたフォワードプライマーとリバースプライマー(表1)と蛍光PCRマスターミックスを用いて、5 ng RNAに相当するcDNAを混合します。qRT-PCR反応を40サイクルで実行します:95°Cで15 s、60sの場合は60°Cを実行します。
6. 免疫染色化学
- オルガノイドの収穫と固定
- 氷の上に48ウェルプレートを30分間置き、マトリックスゲルを緩めます。
- オルガノイド培地を取り出し、各井戸に400μLの氷冷PBSを加えます。その後、PBSを取り除き、400 μLの氷冷細胞回収液を各ウェルに追加します。4°Cで30分間静かに揺れる。
- PBSで1%BSAで1mLピペットチップをコーティングし、ウェルの内容物を上下に軽くピペットしてマトリックスゲルを分解します。オルガノイドを氷の上に置かれた1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。
- 300 μL PBS + 1% BSA でそれぞれを十分にすすい、残りのオルガノイドを対応するチューブに移します。各チューブから細胞回収液/PBS+BSAを除去します。400 μLの氷冷PBSを加え、別の氷冷PBSリンスで繰り返します。
- PBSを取り除き、300 μL氷冷4%PFA(0.1 M PB)でオルガノイドを20分間固定し、室温でインキュベートします。400 μL の氷冷PBSで PFA とオルガノイドをすすい取ります。
- PBS を削除します。その後、400 μL PBS + 1% BSA を追加します。4 °Cで保管。
- 免疫蛍光染色
- オルガノイドを500 μL PBS + 1% BSAでリンスします。次いで、ブロッキング溶液中のオルガノイド(5%正常ヤギまたはロバ血清、1%ウシ血清アルブミン、0.3%トリトンX100中1x1xPBS pH 7.3)を2時間インキュベートし、室温で穏やかに揺れる。
- 一次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈された一次抗体)を加え、4°Cで3泊静かにロックします。
- オルガノイドを500 μL PBS + 0.2% トリトンで1時間4倍洗浄し、室温で穏やかに揺れる。二次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈された二次抗体)とロックオルガノイドを一晩加え、光から保護し、4°Cで保護する。
- オルガノイドを500 μL PBS + 0.2% トリトンで3倍洗浄し、光から保護し、室温で穏やかに揺れる。DAPIでインキュベート 1:10,000 0.1 M PB で 0.1 M PB で 20 分間、ロッキングし、室温で覆います。
- オルガノイド3倍を0.1M PBで20分間洗い、穏やかに揺れ、室温で覆います。
- 逆焦点顕微鏡用オルガノイドのスライド取り付け。
注: スライドの取り付けプロセスのステップバイステップの画像を 図 7に示します。- 顕微鏡スライド上に、非毒性モデリング粘土の厚さ22 x 22mm角の周長から約1mmを作成します。
- マイクロ遠心分離チューブから0.1 M PBを取り出し、オルガノイドを好みの100 μLの取り付け媒体で静かに再懸濁します。その後、粘土の正方形の中心に移ります。
- 土の土が土の上に近くなるまで粘土の正方形を埋めます。その後、22 x 22 mm の正方形のカバースリップを粘土の上に置き、カバースリップの側面をしっかりと押し下げてシールします。メーカーの指示に従って治し(ここでは、1〜2日間室温)、4°Cで保管してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マウスは、舌の後に位置する1つのCVPを有し、そこからLGR5+ 幹細胞を単離することができる(図1A、ブラックボックス)。CVPの下および周辺の酵素溶液の注入(図1B)は、上皮のわずかな腫脹および結合組織の消化をもたらす。十分な消化は、33分のインキュベーションに続いて達成され、これは基底組織からCVP上皮を容易に分離することを可能にする。CVP上皮を剥がそうとすると、トレンチが破壊されたり損傷したりしないように、CVPから十分な距離で切断を行う必要があります(図1C)。これにより、CVPを損傷することなく鉗子を使用して上皮を握ることもできます。CVPを取り囲む上皮をトリミングすると、非標的細胞が除去され、操作される組織質量を減少させることで以下のステップの効率が向上する(図1D)。CVP上皮をマイクロ遠心管に添加する前に、2つのトレンチ(図1C、黒矢印)が存在することを確認することが重要です。CVPの剥離に成功した場合、フォン・エブネルの腺とダクトの一部(図1D、黒矢印)が含まれます。剥離した上皮にこれら2つの不透明な構造が含まれていない場合、トレンチ上皮は結合組織の不完全な消化のために破裂する可能性が最も高い。
Lgr5-EGFP細胞を収集するための適切なFACS設定を確立するために、解離されたCVPから細胞は野生型およびLgr5-EGFPマウスから別々に得られる。野生型CVP細胞は、まず、細胞の集団が関心の特性24によって散布図出力内に分類される細胞の集団を確立するために分析される。ここでは、最終的にめっき用の細胞を同定するために4つのパラメータを使用した。最初のパラメータである前方散乱は、検出された表面積に基づいてパーティクルとデブリを除外します。このパラメータは、ソート中に検出されたすべてのイベントの 70% を削除します (図 3)。width パラメーターは、サイズに基づいてイベントをさらにフィルター処理して、単一セル (シングル) を確実に選択します。イベントの約 90% はシングルトです (図 3)。核マーカーDAPIは死んだが生きている細胞によって取り上げられるので、死んだ細胞を25に分類することができます。このプロトコルは、イベントの 90% 以上がライブ セルであるとして、セルの生存率を最適化します (図 3)。最後に、GFPの格言パラメータは、野生型細胞の自己蛍光レベル以上に設定される。野生型細胞は収集されません。それらはGFP蛍光のための格言制御としてのみ使用される。野生型サンプルから決定された格紙パラメータを使用すると、Lgr5-EGFPサンプルの細胞がフローサイトメーターを介して実行され、コレクションのためにソートされます。ゲートは、Lgr5-EGFP ソートの最初に調整して、特定の細胞集団の明確なクラスタリングに対応できますが、中間ソートの途中で大幅に変更しないでください。プールされた3つのLgr5-EGFP CvPsの解離は、平均10,000GFP+細胞を含む〜500,000個の細胞を生み出すことがわかった。
適切なメディアと培養条件は、オルガノイドの最適な成長と分化のために不可欠です。言語オルガノイドを利用した以前の研究は、Wnt3a、EGF、ノギン、およびR-spondin 17、18、19、20、21、22を含む腸オルガノイド分野のものの後にそれらの培地成分をモデル化した。しかしながら、同様の方法で有機オルガノイドを培養する場合(WENR培地)、オルガノイドは効率的に増殖しない(図5A)。ヒト腸オルガノイドにおいて、A8301(TGFßシグナル伝達阻害剤)およびSB202190(p38 MAPキナーゼシグナル伝達阻害剤)がオルガノイド増殖促進のために使用されている。実際、これらの阻害剤(WENRAS培地)を添加すると、言語オルガノイドの強い成長を誘導する(図5A)。興味深いことに、6日後にこれらの阻害剤を培地から除去すると、一般的なTRCマーカー Kcnq1の発現が高くなり、A8301およびSB202190が味覚細胞分化を妨げることを示唆する(図5B)。したがって、6~12日目(図4、図5)からWENRAS培地中のオルガノイドをWENRAS培地で培養することにより、最適な成長と分化が得られる。
オルガノイド細胞型組成物は、qRT-PCRまたは免疫組織化学によって特徴づけることができる。成熟したオルガノイドは、両方の味細胞を含みます, Kcnq1とKRT8によってマーク, 非味の上皮細胞, Krt13 /KRT13によってマーク (図 6,8A).これは、単離されたLGR5+細胞が生体内と同様の効力を有することを示唆している。したがって、成人の舌では、Lgr5-GFP+細胞は味と非味の系統の両方を産生する5。 また、Krt13は、全3TRCマーカー(図6)よりも高いレベルで発現しており、オルガノイドが主として非味の上皮細胞で構成されていることを示唆している。実際、遺伝子発現27の相対的定量は、Krt13が一般的なTRCマーカー Kcnq1よりも50倍高く発現されていることを示している(学生のt-test、p=0.0004)。 舌は非味上皮1と同様の割合の味を有するので、これは予想される。オルガノイドは、3つのTRCタイプすべてを表現します(図6、8B、C)。I型細胞(Entpd2によってマークされる)および苦いII型細胞(Gnat3によってマークされる)は味オルガノイドで高く発現され、酸味感型III型細胞(Car4によってマークされる)はあまり一般的ではない(図6)。TRCは、生体内で観察される離散的な味覚芽構造ではなくオルガノイド(図8)にランダムに分布している。
図1: 解剖舌及びCVP上皮を剥離した。 (A)舌を解剖し、前舌を切り取って、CVP(ブラックボックス)を含む後舌を残して、CVP(黒い矢印)の下に、そして、酵素混合物をCBOXの外側に注入する。(C)CVPトレンチ(黒矢印)を取り囲む皮をむかず上皮(D)と(D)は、剥離したCVP上皮を剥離した。フォン・エブナーの腺とダクト(D、黒矢印)は、トレンチの剥離に成功した後に見えます。スケールバー: 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:言語オルガノイド生成のワークフロー 舌はLgr5-EGFPマウスから除去される。CVPトレンチ上皮(赤い箱)は、下層の結合組織から剥離し、単一細胞に解離される。GFP+ 細胞は、48ウェルプレートでウェルあたり200細胞の密度で単離され、マトリックスゲルでメッキされます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光活性化細胞選別のためのガッティング(A)コントロール(野生型CVP細胞)は、前方散乱によって破片や壊れた細胞を排除するFACSゲートを決定し、側面散乱幅を介してシングルを識別し、DAPI+死細胞から生きているDAPInegを分離し、野生型細胞の自己蛍光レベルを確立する。(B)以前に決定されたゲートは、実験実行(Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP細胞)に適用され、破片を単離、単生、Lgr5-EGFP+細胞に分離する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:言語オルガノイド培養タイムラインと必要な培地 ROCK阻害剤Y27632は、細胞の生存を促進するために培養の最初の48時間のために培地に添加される。増殖段階の間、オルガノイドはA8301およびSB202190(WENRAS)を含む調整された培地を供給され、成長を最適化する。これらの薬物は、分化を促進するために6日目から培地(WENR)から差し控えられている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:薬物A8301およびSB202190はオルガノイドの成長と分化に影響を与える。 画像は、ライブイメージングソフトウェアを使用して、培養の2日目、6日目、12日目に撮影されました。スケールバー:400μm(B)グローバルTRCマーカー Kcnq1の相対遺伝子発現は、オルガノイド分化中に薬物A8301およびSB202190が存在すると有意に低下する。各ポイントは、3つのプールされた井戸を含む1つの生物学的複製を表します。相対遺伝子発現の平均変化(水平線)は、3つの生物学的複製を平均することによって算出した。エラーバー: ±SD.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:舌下オルガノイドは、正規味細胞マーカーを発現する。グローバルTRCマーカー Kcnq1のサイクル閾値(Ct)値の変化、非味覚上皮マーカーサイトケラチン13(Krt13)、I型TRCマーカー Entpd2、II型苦味TRCマーカー Gnat3、およびIII型酸っぱいTRCマーカー Car4、ハウスキーピング遺伝子Rpl19と比較した。各点は、48ウェルプレートから3つのプールされた井戸を含む1つの生物学的複製を表します。各マーカーに対するCt値(水平線)の平均変化は、3つの生物学的複製を平均することによって算出した。ペアになっていない学生のt-test,*p < 0.05.エラーバー: ± SD.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:逆焦点顕微鏡用の言語オルガノイドの取り付け(A)非毒性モデリング粘土の厚さ〜1mmの文字列が作成される。(B)粘土は、24mm×75mm顕微鏡スライドの中央に〜20mm×20mmの正方形として彫刻されています。(C)22 mm x 22 mm の正方形のカバースリップシールオルガノイドを取り付け媒体に懸濁した。スケールバー:10 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: インタクトな言語オルガノイドの免疫標識 固定された免疫染色されたオルガノイドの共焦点像。(A)非味覚上皮マーカーKRT13(緑色)および一般的なTRCマーカーKRT8(マゼンタ)に染色されたオルガノイドの光学部分。(B)I型グリア様細胞マーカーNTPDase2(緑色)およびKRT8(マゼンタ)に染色された1つのオルガノイドの共焦点zスタックの最大投影。(C)部分的に示されたオルガノイド(白い輪郭)と1つの完全なオルガノイド染色の2つの共焦点の最大投影(白破輪郭)と1つの完全なオルガノイド染色細胞マーカーCAR4(緑色)、および苦い検出型II細胞マーカーGUSTDUCIN(マゼンタ)。スケールバー:A、B、C.核マーカーDAPI(青、右列)の場合は100μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子名 | フォワードプライマー(5'-3') | リバースプライマー(5'-3') | アズセッション番号 | ||||||
| 車4 | CTGCTAGGACAAAGGTACC | CTCCACTGTGTGTTATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| エントpd2 | ガカラガートガカカッガガツグガッググ | GTTCAAGACATTACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| グナット3 | アッチャガアトカGCGC | TGGTTTCACCCGGGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGGタガーガグ | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | トキャットクッテクトクトクチャガ | トゥガクトクトチャガガガグ | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | グクトクトッグットッガッカターグ | CCCGGGAATGGAGTカ | NM_009078.2 | ||||||
表1:定量的RT-PCRに用いられるプライマー配列。
補足表1:公表された言語性オルガノイド培養培地成分の比較 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで報告されているのは、成人マウス味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養、維持、処理するための効率的かつ容易に再現可能な方法である。8〜20週齢のLgr5-EGFPマウスの3つのCvPsを使用すると、実験用に約10,000 GFP+細胞を得るのに十分であり、その結果、48ウェルプレートのウェルあたり200細胞の密度で50のウェルがメッキされることがわかりました。CVPトレンチ上皮の除去は、新たに作られたディスパーゼIIおよびI型コラゲターゼ溶液でリンガル上皮を注入し、続いて33分のインキュベーションを行うことによって最適化される。しかし、インキュベーション時間が短い場合、古い酵素アリコート、ロットが異なる、または異なるメーカーの酵素を使用すると、トレンチ除去が不完全になります。逆に、潜伏時間が長いと組織の過剰消化が生じ、味覚組織の完全性が失われる。剥離後、CVPトレンチに対するさらなる濃縮は、CVPを取り囲む上皮をトリミングすることによって行われた。
解離および回収プロセス中に使用されるすべてのマイクロ遠心分離管は、組織および細胞がチューブのプラスチック壁に付着するのを防ぐためにFBSでコーティングされ、単離された細胞の回収を大幅に減少させることが重要です(データは示されていません)。FBSのライトコートを使用し、使用前にチューブから余分な液体を除去することは、トリプシンまたは他の酵素に対する可能な阻害効果を最小限に抑えます。
LGR5+細胞17の事前選別を行うことなく、分離したCVP組織からリンガルオルガノイドが正常に増殖している。この方法はオルガノイドの形成をもたらすが、我々はこれらのオルガノイドの小さな割合が単離前駆細胞から成長したものに比べて味細胞を含むことがわかった(データは示していない)。Lgr5-EGFP+細胞のフローソートは、味に優れた前駆物質のために濃縮し、味を満たすようなオルガノイドの割合が高くなります。現在、我々はGFP自己蛍光の閾値を超える全ての細胞を収集する(図3);しかし、GFPの輝度レベルは、可変オルガノイド形成効率または味のコンピテンシーに関連している可能性があります。この仮説はまだテストされていませんが、味細胞含有オルガノイドのさらなる濃縮を可能にする可能性があり、将来の作業のための有望な道です。
めっき密度がオルガノイド分化の効率に影響を及ぼすことはよく知られており、実験28の前に最適なめっき密度を決定することをお勧めします。メッキ密度を確立する際には、ウェルのサイズと深さ、ならびにマトリックスゲル体積を考慮する必要があります。私たちの予備作業(図示しないデータ)に基づいて、48ウェルプレートでは、15μLのマトリックスゲルと200個の細胞のめっき密度が、3種類のTRCタイプすべてにおいて効率的なオルガノイドの膨張と分化を可能にすることがわかりました。我々は、リンガルオルガノイドが正常に、再発見可能な成長因子基質膜抽出物(RGF BME)、合成および安価なマトリックスゲル代替物で培養できることを発見しました。他の代替マトリックスも言語オルガノイド培養をサポートする可能性がありますが、この可能性を調査するにはさらなる検査が必要です。
めっきの間、収集した細胞は、細胞懸濁液を均一に保つために頻繁に上下にピペット処理を行い、マトリックスゲルに十分に注意して再懸濁する必要があります。細胞マトリックスゲル混合物を含むチューブは、マトリックスゲルがチューブの側面にゲル化するのを防ぐために、めっきプロセス全体の間に氷上に保持する必要があります。これらの措置は、ウェル間の細胞の均等な分布を保証し、手めっき細胞でより再現可能な結果をもたらす。特に、マイクロ流体技術の最近の発展は、セルの分配のための高いスループットオプションを提供し、将来の仕事29のための有望なツールです。
培養されたオルガノイドにおける遺伝子発現を評価するためには、各生物学的複製に対して少なくとも3つのウェルをプールして、複製全体で十分なRNAと一貫性を得る必要があることがわかった(図6)。また、特定のメーカーの指示に従って収穫されたオルガノイドを直ちに解凍することで、抽出されたRNAの質と量が最適化されると判断されました。ここではテストを行っていませんが、フラッシュフリーズやリサスペンションなどの他のストレージオプションは、RNAの収率と品質を保持する可能性があります。
一次抗体および二次抗体は、任意の残留マトリックスゲルおよびオルガノイド上皮全体に浸透しなければならないので、オルガノイドに免疫組織化学を行うことは困難であり得る。これまでの報告では、オルガノイドはマトリックスゲルにまだ懸濁したまま固定され、その後、タンパク質発現17,18を明らかにするために極めて高濃度の一次抗体溶液が必要であった。他の報告と同様に、固定前の細胞回収液を用いてマトリックスゲルからオルガノイドを除去すると、高い抗体濃度30,31を必要とせずに染色の効率を高めることが判明した。しかしながら、いくつかの味覚細胞マーカーの検出には、例えば、CAR4、抗体のより高い濃度が必要である。また、3夜の一次抗セラでオルガノイドをインキュベートすると、抗体結合の確率が高くなる。しかし、この方法は、免疫染色後にオルガノイドが十分に洗浄されていない場合のバックグラウンド蛍光を増加させることもある。重要なことに、希釈された一次抗体溶液は保存し、1週間未満保存すれば1回以上再利用することができます(データは示されていません)。最適なイメージングのために、オルガノイドは、モデリング粘土の粘土の周囲の上にカバースリップを配置して3D構造を維持することによって取り付けられます。カバーガラスをスライド上に直接置くとオルガノイドが圧縮され、破壊され、適切な分析が妨げられます。
オルガノイド培養は、非常に適用可能でコスト効率の高い技術です。いくつかの用途は、これらに限定されないが、疾患のモデル化および薬物スクリーニングおよび幹細胞および発生生物学32の研究を含む。したがって、ラボ全体で再現性を持たされるように、オルガノイドモデルを標準化することが重要です。将来的には、舌下オルガノイドを通過させる標準化された方法を開発して、連続通路上に幹細胞の効力を伝播させ、より多くのオルガノイドを生成する追加の動物の必要性を減らすことが有用であろう。重要なことに、舌間オルガノイドは味と非味の上皮細胞の両方で構成されているが、これらの細胞の組織はインビボ味覚システムと比較して異なる。生体内でのオルガノイドと味の上皮との間の不一致は、オルガノイド培養に使用される培地や、オーガノイドが味覚芽の形成および維持に必要な有数の気味神経および薄層プロプリアからの重要なシグナルを含む味覚芽微小環境との相互作用を欠いているために、22、33、34、35に起因する可能性がある。神経または血管系を言語オルガノイド培養物に組み込む今後の研究は、他のオルガノイド系で現在採用されている戦略であり、in vivo味上皮36,37のより正確なモデリングを可能にする可能性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、WNR条件付きメディアと貴重な議論を提供してくれたピーター・デンプシー博士とモニカ・ブラウン(コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスオルガノイドと組織モデリング共有リソース)に感謝したいと考えています。また、コロラド大学がんセンターの細胞技術とフローサイトメトリー共有リソース、特にドミトリー・バトゥリンの細胞選別の専門知識に感謝します。この作品は、次の資金を提供しました: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1、DC012383-S2、NIH/NCI R21 CA236480からLABへ、R21DC016131およびR21DC016131-02S1からDG、およびF32 DC015958からEJGへ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
