Summary
Protokollet presenterar en metod för odling och bearbetning av linguala organoider som härrör från smakstamceller isolerade från den bakre smakpapilla av vuxna möss.
Abstract
Smaksinnet förmedlas av smaklökar på tungan, som består av snabbt förnyande smakreceptorceller (TRCs). Denna kontinuerliga omsättning drivs av lokala stamceller och gör smakfunktionen benägen för störningar genom en mängd medicinska behandlingar, vilket i sin tur allvarligt påverkar livskvaliteten. Att studera denna process i samband med läkemedelsbehandling är därför avgörande för att förstå om och hur smak avkomma funktion och TRC produktion påverkas. Med tanke på de etiska problemen och den begränsade tillgången på mänsklig smakvävnad används musmodeller, som har ett smaksystem som liknar människor, ofta. Jämfört med in vivo-metoder, som är tidskrävande, dyra och inte mottagliga för studier med hög genomströmning, kan murinspråkiga organoider göra det möjligt att köra experiment snabbt med många replikat och färre möss. Här har tidigare publicerade protokoll anpassats och en standardiserad metod för att generera smakorganoider från smakprogenitorceller isolerade från omkretspaljilla (CVP) hos vuxna möss presenteras. Smaka av stamceller i CVP express LGR5 och kan isoleras via EGFP fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) från möss som bär en Lgr5EGFP-IRES-CreERT2-allel. Sorterade celler pläteras på ett matrisgelbaserat 3D-odlingssystem och odlas i 12 dagar. Organoider expanderar under de första 6 dagarna av kulturperioden via spridning och går sedan in i en differentieringsfas, under vilken de genererar alla tre smakcelltyperna tillsammans med icke-smakepitela celler. Organoider kan skördas vid mognad vid dag 12 eller när som helst under tillväxtprocessen för RNA-uttryck och immunohistokemisk analys. Standardisering av odlingsmetoder för produktion av linguala organoider från vuxna stamceller kommer att förbättra reproducerbarheten och främja linguala organoider som ett kraftfullt läkemedel screening verktyg i kampen för att hjälpa patienter som upplever smak dysfunktion.
Introduction
Hos gnagare är linguala smaklökar inrymda i svampform papillae fördelad främre, bilaterala bladpafeillaer baktill, liksom en enda cirkumvallate papilla (CVP) vid den bakre midlinen på tungan1. Varje smakknopp består av 50-100 kortlivade, snabbt förnyande smakreceptorceller (TRCs), som inkluderar typ I-glialiknande stödceller, typ II-celler som upptäcker söta, bittra och umami och typ III-celler som detekterarsura 2,3,4. I musen CVP producerar LGR5+ stamceller längs basal lamina alla TRC-typer samt icke-smak epitelceller5. Vid förnyelse av smak härstamningen anges LGR5 dotterceller först som post-mitotic smakprekursorceller (typ IV celler) som går in i en smaklök och kan differentiera till någon av de tre TRCtyperna 6. Den snabba omsättningen av TRCs gör smaksystemet mottagligt för störningar genom medicinska behandlingar, inklusive strålning och vissa läkemedelsbehandlingar7,8,9,10,11,12,13. Att studera smaksystemet i samband med smakstamcellsreglering och TRC-differentiering är därför avgörande för att förstå hur man mildrar eller förhindrar smakdysfunktion.
Möss är en traditionell modell för in vivo-studier i smakvetenskap eftersom de har ett smaksystem organiserat på samma sätt som människor14,15,16. Möss är dock inte idealiska för studier med hög genomströmning, eftersom de är dyra att underhålla och tidskrävande att arbeta med. För att övervinna detta har in vitro organoidkulturmetoder utvecklats under de senaste åren. Smakorganoider kan genereras från inhemsk CVP-vävnad, en process där organoider knoppar av från isolerade mus CVP epitel odlas ex vivo17. Dessa organoider visar ett flerskiktat epitel som överensstämmer med in vivo-smaksystemet. Ett effektivare sätt att generera organoider som inte kräver ex vivo CVP-kultur utvecklades av Ren et al. 201418. Anpassa metoder och kultur medier först utvecklats för att växa intestinala organoider, isolerade de singel Lgr5-GFP+ stamceller från mus CVP och pläterade dem i matrisgel19. Dessa enstaka celler genererade linguala organoider som förökar sig under de första 6 dagarna av kulturen, börjar skilja runt dag 8, och i slutet av kulturperioden innehåller icke-smak epitelceller och alla tre TRC typer18,20. Hittills har flera studier som använder det språkliga organoidmodellsystemet publicerats17,18,20,21,22; Metoder och odlingsförhållanden som används för att generera dessa organoider varierar dock mellan publikationerna(tilläggstabell 1). Således har dessa metoder justerats och optimerats här för att presentera ett detaljerat standardiserat protokoll för kulturen av linguala organoider som härrör från LGR5+ föregångare till vuxna mus CVP.
Linguala organoider ger en unik modell för att studera cellbiologiska processer som driver smakcellsutveckling och förnyelse. I och med att tillämpningarna av linguala organoider expanderar och fler laboratorier rör sig mot att använda in vitro-organoidmodeller är det viktigt att fältet strävar efter att utveckla och anta standardiserade protokoll för att förbättra reproducerbarheten. Att etablera linguala organoider som ett standardverktyg inom smakvetenskap skulle möjliggöra studier med hög genomströmning som retar isär hur enstaka stamceller genererar de differentierade cellerna i vuxensmakssystemet. Dessutom kan linguala organoider användas för att snabbt screena läkemedel för potentiella effekter på smakhomeostas, som sedan skulle kunna undersökas mer noggrant i djurmodeller. Detta tillvägagångssätt kommer i slutändan att öka ansträngningarna för att utforma terapier som förbättrar livskvaliteten för framtida läkemedelsmottagare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i en AAALAC-ackrediterad anläggning i enlighet med guiden för vård och användning av laboratoriedjur, djurskyddslagen och folkhälsopolitiken och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Colorado Anschutz Medical Campus. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 möss som används i detta protokoll är från The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
OBS: Följande steg bör slutföras innan protokollet börjar säkerställa en smidig och i rätt tid: ställ in vattenbadet på 37 °C. ställa in centrifugen till 4 °C, göra enzymlösningar för injektion och dissociation från 10 mg/ml Dispase, Collagenase och Elastase stock solutions (se Materialförteckning),ta bort matrisgel från -20 °C frys (~750 μL behövs för en 48-brunnsplatta) och tina genom att dränka flaskan i is för at minst 3-4 h, pre-coat mikrocentrifugrör i outspädda FBS genom att gunga försiktigt vid rumstemperatur i minst 30 min (två 2 ml rör för vävnadsuppsamling, två 1,5 ml-rör för dissocierade celler och ett 1,5 ml-rör för insamling av enstaka celler från sorteringscellen; ta bort överflödig fbs före användning).
1. Isolering av CVP epitel
OBS: För att få tillräckligt med LGR5+ celler för en full 48-brunnsplatta, samla tre Lgr5-EGFP CVPs i samma rör och bearbeta samtidigt. Viktigt är att skörda och bearbeta CVP för minst en vild typ av kullmat parallellt i ett separat rör och använda det som en gating kontroll för att ställa in FACS-parametrar (se representativa resultat).
- Avliva mössen med CO2-kvävning enligt IACUC-reglerna, följt av en godkänd sekundär metod som bilateral thoracotomi, massundersökningsförskjutning, halshuggning eller exsanguination.
- Använd stor steril dissekeringssax för att skära kinderna och bryta käken. Lyft tungan och skär den linguala frenulumen för att separera tungan från golvet i munhålan. Skär ut tungan och samla den i steril iskall Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (dPBS) med Ca2+ och Mg2+.
- Ta bort och kassera den främre tungan genom att skära bara fram den intermolära eminensen med ett rakblad (Figur 1A, streckad linje). Använd en delikat uppgiftsservett för att ta bort hår och överflödig vätska från den bakre tungan.
- Fyll 1 ml spruta med 200-300 μL injektionsenzymlösning (slutlig koncentration: 2 mg/ml typ-I-kollagenas och 5 mg/ml dispas ii i Ca2+/Mg2+-innehållande dPBS, späds ut från 10 mg/ml stamlösningar) och sätt in en 30 G x 1/2 nål strax ovanför den intermolära eminensen(figur 1B,svart pil)tills den bara är främre till CVP(figur 1B, svart låda). Injicera enzymlösningen under och vid CVP: s laterala kanter mellan epitel och underliggande vävnader (lamina propria, muskel). Dra långsamt och kontinuerligt ut sprutan ur tungan när injektionen utförs.
- Inkubera tungan i steril Ca2+/Mg2+-fria dPBS vid rumstemperatur i exakt 33 min.
- Gör små snitt i epitel bilateralt och bara främre till CVP med extra fin dissekeringssax och skala försiktigt epitelet genom att lyfta det med fina tångar. När dikesepitelet är fritt från den underliggande bindväven, placera den i ett tomt 2 ml mikrocentrifugrör förlackerat med FBS. Gör epitelbeskärningen före eller efter det att CVP-epitelet har lossats (figur 1C,D).
2. Dissociation av CVP epitel
OBS: Dissociation av CVP-epitel och plätering representeras grafiskt i figur 2.
- Tillsätt dissociationsenzymcocktailen (slutlig koncentration: 2 mg/ml typ-I Collagenase, 2 mg/mL Elastase och 5 mg/ml Dispase II i Ca2+/Mg2+-innehållande dPBS, utspädd från 10 mg/ml stamlösningar) till rör som innehåller skalad CVP epithelia (200 μL per CVP). Inkubera i ett 37 °C vattenbad i 45 min. Virvel kort var 15:e minut.
OBS: Förvärmning 0,25% Trypsin-EDTA i 37 °C vattenbad under de sista 15 min enzymcocktailinkubation. - Efter inkubation triturerar virvel (tre pulser) sedan med en glas pastörpipett i 1 min. Efter vävnad bitar bosätta sig, pipett supernatant som innehåller första samlingen av dissociated celler, i nya FBS-belagda 1,5 mL microcentrifuge rör som motsvarar genotyp. Bearbeta de återstående vävnadsdelarna ytterligare enligt beskrivningen i steg 2.3. under.
- Snurra supernatanten i 5 min vid 370 x g och 4 °C till pelletsceller.
- Ta bort det resulterande supernatanten och återanvänd cellpelleten i fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) och 1% FBS i Ca2+/ Mg2 +-fri PBS (50 μL per CVP)). Förvara på is.
- När du utför steg 2.2.1 och 2.2.2, ta avstånd från de återstående vävnadsbitarna från steg 2.2 genom att tillsätta förvärmda 0,25% trypsin-EDTA (200 μL per CVP) till de ursprungliga 2 mL mikrocentrifugrören och inkubera i ett 37 °C vattenbad i 30 min. Virvel kort var 10:e minut.
- Efter inkubation virvelröret som innehåller vävnadsbitar (tre pulser) och triturera sedan med en glas Pasteur pipett i 1 min. När vävnadsbitarna har lagt sig, pipetten supernaten i de 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller celler från steg 2.2.2. Kassera rören som innehåller de återstående vävnadsbitarna.
- Snurra rören med dissocierade celler i 5 min vid 370 x g och 4 °C till pelletsceller.
- Ta bort supernatant och återanvänd cellpellets i FACS Buffer (100 μL per CVP). Förvara på is.
- För cellerna genom ett 30 μm nylonnätfilter och tillsätt DAPI(λ-emission = 450 nm) till cellblandningar före FACS. Isolera Lgr5-GFP+ celler via FACS med hjälp av den gröna fluorescerande proteinkanalen (λexcitation = 488 nm;λ-emission = 530 nm). Sortera cellerna med ett munstycke på 100 μm i ett färskt FBS-belagt 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 300 μL Ca2+/Mg2+ fritt dPBS. Placera cellerna på is tills de plätering.
3. Plätering av Lgr5-EGFP-celler
- Bestäm volymen av LGR5+ cellfjädring som erhållits från flödescytometern.
- Beräkna antalet celler per μL baserat på antalet celler som erhålls från sorteraren. Bestäm sedan den volym som behövs för att få önskat antal celler för plätering (vi använder 200 celler per brunn på en 48-brunnsplatta) och överför den totala volymen suspenderade celler till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Snurra röret i 5 minuter vid 370 x g och 4 °C till pelletsceller (pellet kanske inte är synlig). Ta bort supernaten och lägg röret på is.
- Återanvänd försiktigt cellpelleten i lämplig mängd matrisgel (15 μL per brunn för 48-brunnsplattor); pipett upp och ner försiktigt för att noggrant fördela celler i matrisgel. Placera 15 μL matrisgel/cellblandning i mitten av varje brunn. Håll mikrocentrifugröret på is i ett koniskt rör på 50 ml under plätering för att förhindra att matrisgel gelen geleras. Fortsätt att blanda matrisgel/cellblandning under hela pläteringen genom att pipetta upp och ner var tredje brunn för att säkerställa en jämn fördelning av celler över brunnar.
- Placera plattan i inkubatorn (37 °C, 5 % CO2, ~95 % luftfuktighet) i 10 minuter för att möjliggöra matrisgelgel. Tillsätt sedan 300 μL rumstemperatur WENRAS + Y27632-media till varje brunn och sätt tillbaka plattan i inkubatorn.
4. Organoid underhåll
OBS: Organoider odlas i konventionella organoida medier (WENR) bestående av rekombinant EGF och 50% konditionerade medier som innehåller Wnt3a, Noggin och R-spondin23. Läkemedel A8301 och SB202190 läggs till under de första 6 dagarna av kulturperioden för att optimera tillväxten (WENRAS-media) (Figur 5), sedan tas bort för att främja differentiering (WENR-media)20. Y27632 läggs till under de första 2 dagarna av kulturen för att främja överlevnad. Medieförhållandena i förhållande till kulturtidslinjen presenteras i figur 4.
- Två dagar efter plätering, ta bort WENRAS + Y27632-media från varje brunn med en 1 ml pipett, vilket säkerställer ingen korskontaminering. Tillsätt 300 μL WENRAS-media längs sidan av brunnen för att inte störa matrisgelen. Sätt tillbaka plattan på inkubatorn.
- Byt media varannan dag med hjälp av lämpliga medier för kulturscenen (figur 4). Underhåll organoider fram till dag 12, när organoiderna är redo att skörda.
5. RNA-bearbetning
- Skörda organoider för RNA
- Placera 48-brunnsplattan på is i 30 minuter för att avpolymerisera matrisgelen.
- Använd en 1 ml pipett och dra upp det organoida mediet; sedan, när mediet returneras till brunnen, använd pipettens spets för att skrapa och ytterligare bryta upp matrisgelen. Överför innehållet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och samla innehållet i tre brunnar i ett rör. Centrifugera rören i 5 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur.
- Ta bort så mycket media supernatant som möjligt utan att ta bort några organoider; snurra sedan ner rören igen i 5 min vid 300 x g vid rumstemperatur.
- Ta bort resterande media och återanvänd organoiderna i 350 μL lysbuffert + β-merkaptoethanol (βME) (10 μL βME per 1 ml lysbuffert). Placera proverna på is för omedelbar RNA-extraktion eller förvara vid -80 °C.
- Kvantitativ RT-PCR-analys
- Mät RNA-kvantiteten via spektrofotometer. Omvänd transkribera RNA med hjälp av ett cDNA Synthesis Kit.
- Blanda cDNA motsvarande 5 ng RNA med 200 nM förvalt framåt- och omvänd primers(tabell 1)och fluorescerande PCR Master Mix. Kör qRT-PCR-reaktionen i 40 cykler vid: 95 °C för 15 s, sedan 60 °C för 60 s.
6. Immunohistokemi
- Skörd och fixering av organoider
- Placera 48-brunnsplattan på is i 30 minuter för att lossa matrisgelen.
- Ta bort organoidmedierna och tillsätt 400 μL iskallt PBS till varje brunn. Ta sedan bort PBS och tillsätt 400 μL iskallt cellåtervinningslösning till varje brunn. Vagga försiktigt vid 4 °C i 30 min.
- Täck en 1 ml rörspets med 1% BSA i PBS och rör försiktigt innehållet i brunnen upp och ner för att bryta upp matrisgelen. Överför organoiderna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör placerat på is.
- Skölj varje brunn med 300 μL PBS + 1% BSA och överför eventuella återstående organoider till motsvarande rör. Ta bort cellåterställningslösning/PBS + BSA från varje rör. Tillsätt 400 μL iskallt PBS och upprepa sedan med en annan iskall PBS-sköljning.
- Ta bort PBS och fixera organoider med 300 μL iskallt 4% PFA (i 0,1 M PB) i 20 minuter, inkubera vid rumstemperatur. Ta bort PFA och skölj organoider med 400 μL iskall PBS.
- Ta bort PBS; tillsätt sedan 400 μL PBS + 1% BSA. Förvara vid 4 °C.
- Immunofluorescens färgning
- Skölj organoider i 500 μL PBS + 1% BSA. Inkubera sedan organoider i blockerande lösning (5% normalt get- eller åsneserum, 1% bovint serumalbumin, 0,3% Triton X 100 i 1x PBS pH 7,3) i 2 h, gunga försiktigt vid rumstemperatur.
- Tillsätt den primära antikroppslösningen (primära antikroppar utspädda i blockeringslösning) och vagga försiktigt i 3 nätter vid 4 °C.
- Tvätta organoider 4x i 1 timme med 500 μL PBS + 0,2% Triton, gunga försiktigt vid rumstemperatur. Tillsätt sekundär antikroppslösning (sekundära antikroppar utspädda i blockeringslösning) och bergorganoider över natten, skyddade mot ljus, vid 4 °C.
- Tvätta organoider 3x i 1 timme med 500 μL PBS + 0,2% Triton, skyddad mot ljus och gungning försiktigt vid rumstemperatur. Inkubera med DAPI utspädd 1:10.000 i 0.1 M PB i 20 min, gunga och täckt vid rumstemperatur.
- Tvätta organoiderna 3x i 20 min med 0,1 M PB, gunga försiktigt och täckt vid rumstemperatur.
- Skjut montering av organoider för inverterad konfokal mikroskopi.
OBS: Steg-för-steg-bilder av bildmonteringsprocessen visas i figur 7.- Skapa en ~1 mm tjock 22 x 22 mm kvadratisk omkrets av giftfri modelleringslera på en mikroskoprutschbana.
- Ta bort 0,1 M PB från mikrocentrifugröret och återanvänd försiktigt organoider i 100 μL monteringsmedium. överför sedan till mitten av lertorget.
- Fyll lertorget tills monteringsmediet är nästan på toppen. Placera sedan 22 x 22 mm fyrkantigt lock över lera och tryck ner ordentligt på sidorna av täcket för att försegla. Låt det härda enligt tillverkarens instruktioner (här, rumstemperatur i 1-2 dagar) och förvara vid 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möss har en CVP, som ligger bakre på tungan, från vilken LGR5+ stamceller kan isoleras (Figur 1A, svart låda). Injektion av en enzymlösning under och runt CVP (Figur 1B) resulterar i liten svullnad av epitel och matsmältning av bindväven. Tillräcklig matsmältning uppnås efter en 33 min inkubation, vilket möjliggör enkel separation av CVP epitel från den underliggande vävnaden. Vid försök att skala CVP-epiteltheliumet bör styckningsdelar göras på tillräckligt avstånd från CVP för att säkerställa att skyttegravarna inte störs eller skadas (figur 1C). Detta gör det också möjligt att greppa epitelet med tång utan att skada CVP. Om du trimmar epitelet kring CVP tas icke-målceller bort och effektiviteten i följande steg ökar genom att minska vävnadsmassan som manipuleras (figur 1D). Det är viktigt att kontrollera att de två skyttegravarna (figur 1C, svarta pilar) är närvarande innan cvp-epitel tillsätts i mikrocentrifugröret. Framgångsrik skalning av CVP inkluderar en del av Von Ebners körtlar och kanaler (Figur 1D, svarta pilar). Om det skalade epitelet inte innehåller dessa två ogenomskinliga strukturer, är dikesepitelet troligen brustet på grund av ofullständig matsmältning av bindväven.
För att upprätta lämpliga FACS-inställningar för att samla lgr5-EGFP-celler erhålls celler från dissocierade CVPs separat från vildtyp och Lgr5-EGFP-möss. Cvp-celler av vildtyp analyseras först för att fastställa gatingparametrar, en process där populationer av celler kategoriseras inom scatterplot-utdata efter egenskaper av intresse24. Här användes fyra parametrar för att slutligen identifiera celler för plätering. Den första parametern, framåtspridning, filtrerar bort partiklar och skräp baserat på den detekterade ytan. Den här parametern tar bort ~70% av alla identifierade händelser under sorteringen (bild 3). Breddparametern filtrerar ytterligare händelser baserat på storlek för att säkerställa val av enstaka celler (singlets). Ungefär 90 % av evenemangen är singlar (figur 3). Kärnmarkören DAPI tas upp av döda men inte levande celler och tillåter därmed att döda celler sorteras ut25. Detta protokoll optimerar cellens livskraft, eftersom över 90 % av händelserna är levande celler (figur 3). Slutligen anges GFP-gatingparametrar över autofluorescensnivån för vilda typceller. Vilda typceller samlas inte in. De används endast som en gating kontroll för GFP fluorescens. Med gatingparametrar som bestäms från det vilda typprovet körs celler från lgr5-EGFP-provetsedan genom flödescytometern som ska sorteras för insamling. Grindar kan justeras i början av lgr5-EGFP-sorten för att rymma tydlig klustring av vissa cellpopulationer men bör inte ändras väsentligt mitt i sorteringen. Det konstaterades att dissociationen av tre poolade LGr5-EGFP CVPs ger ~ 500 000 celler, inklusive i genomsnitt 10 000 GFP+ celler.
Korrekta medie- och kulturförhållanden är avgörande för optimal tillväxt och differentiering av organoider. Tidigare studier med hjälp av linguala organoider modellerade sina mediekomponenter efter de från intestinala organoidfältet, inklusive Wnt3a, EGF, Noggin och R-spondin17,18,19,20,21,22. Men när linguala organoider odlas med en liknande metod (WENR-media) växer organoider inte effektivt (figur 5A). I mänskliga tarmorganoider används läkemedel A8301 (en TGFß-signalhämmare) och SB202190 (en p38 MAPKinase-signalhämmare) för att främja organoid tillväxt26. Att lägga till dessa hämmare (WENRAS-medier) inducerar en robust tillväxt av linguala organoider(figur 5A). Intressant nog resulterar avlägsnandet av dessa hämmare från media efter 6 dagar i högre uttryck för den allmänna TRC-markören Kcnq1, vilket tyder på att A8301 och SB202190 hindrar smakcellsdidelning (Figur 5B). Optimal tillväxt och differentiering erhålls således genom odling av organoider i WENRAS-medier från dag 0-6 respektive WENR-medier från dag 6-12 (figur 4, figur 5).
Organoid cell typ komposition kan karakteriseras av qRT-PCR eller immunohistokemi. Mogna organoider innehåller både smakceller, märkta med Kcnq1 och KRT8, och icke-smakande epitelceller, märkta med Krt13/KRT13 (Figur 6,8A). Detta tyder på att isolerade LGR5+ celler har en liknande styrka in vitro som de gör in vivo eftersom lgr5-GFP+ celler i vuxenspråket producerar både smak och icke-smak härstamningar5. Vidare uttrycks Krt13 på högre nivåer än alla 3 TRC-markörer (figur 6), vilket tyder på att organoider huvudsakligen består av epitelceller som inte är smak. I själva verket, relativ kvantifiering avgenuttryck 27 indikerar Krt13 uttrycks 50x högre än allmän TRC markör Kcnq1 (Studentens t-test,p = 0.0004). Detta förväntas, eftersom tungan har en liknande andel smak kontra icke-smak epitel1. Organoider uttrycker alla tre TRC-typerna(figur 6,8B,C). Typ I-celler (märkta med Entpd2)och bittra typ II-celler (märkta med Gnat3)uttrycks starkt i smakorganoider, medan suravkänning av typ III-celler (märkta med Car4)är mindre vanliga (figur 6). TRC fördelas slumpmässigt i organoider(figur 8)snarare än i diskreta smaklökstrukturer som observerats in vivo.
Figur 1: Dissekerad tunga och skalat CVP-epitel. ( A) Tungan dissekeras ut, och den främre tungan avlägsnas genom att skära bara främre av den intermolära eminensen (streckad linje), vilket lämnar den bakre tungan, som inkluderar CVP (svart låda) (B) En nål sätts in bara främre till den intermolära eminensen (svart pil), och enzymblandningen injiceras nedan och till CVP:s sidokanter (svart låda). C)Oklippt skalat epitel som omger CVP-skyttegravarna (svarta pilar)och (D)trimmat skalat CVP-epitel. Von Ebners körtlar och kanaler (D, svarta pilar) är synliga efter framgångsrik skalning av skyttegravarna. Skalstreck: 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Arbetsflöde för lingual organoidgenerering. Tungan avlägsnas från Lgr5-EGFP möss. CVP dike epithelia (röd låda) skalas från den underliggande bindväv och dissocieras till enstaka celler. GFP+ celler isoleras och plätas i matrisgel med en densitet på 200 celler per brunn i en 48-brunnsplatta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Gating för fluorescensaktiverad cellsortering. (A) Kontrollen (CVP-celler av vildtyp) bestämmer FACS-portarna som eliminerar skräp och trasiga celler via främre scatter, identifierar singlets via sidospridningsbredd, separerar DAPIneg live från DAPI+ döda celler och fastställer autofluorescensnivån för vilda typceller. (B) Tidigare fastställda grindar tillämpas på den experimentella körningen (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP-celler) för att isolera skräpfria, enstaka, levande, Lgr5-EGFP+ celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Lingual organoidkultur tidslinje och nödvändiga medier. ROCK-hämmaren Y27632 läggs till i media för de första 48 h kultur för att främja cellöverlevnad. Under spridningsfasen matas organoider konditionerat medium som innehåller A8301 och SB202190 (WENRAS) för att optimera tillväxten. Dessa läkemedel undanhålls från media (WENR) från dag 6 för att främja differentiering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Läkemedel A8301 och SB202190 påverkar organoid tillväxt och differentiering. (A) Brightfield bilder av organoider odlade i antingen WENR-media (dag 0-12), WENRAS media (dag 0-12) eller WENRAS (dag 0-6), sedan WENR (dag 6-12). Bilder togs dag 2, dag 6 och dag 12 av kultur med hjälp av live imaging programvara. Skalstång: 400 μm (B) Relativt genuttryck av en global TRC-markör Kcnq1 reduceras avsevärt när läkemedel A8301 och SB202190 förekommer under organoid differentiering. Varje punkt representerar en biologisk replikat, som inkluderade tre poolade brunnar. Genomsnittlig förändring i relativa genuttryck (horisontell linje) beräknades med medelvärdet tre biologiska replikat. Felstaplar: ±SD. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6:Linguala organoider uttrycker kanoniska smakcellsmarkörer. Förändring av cykeltröskelvärdet (Ct) för den globala TRC-markören Kcnq1,icke-smak epitelmarkören cytokeratin 13 (Krt13), typ I TRC-markör Entpd2, typ II bitter TRC-markör Gnat3och typ III sur TRC-markör Car4, jämfört med hushållningsgen Rpl19. Varje punkt representerar en biologisk replikat, som inkluderade tre poolade brunnar från en 48-brunnsplatta. Genomsnittlig förändring i Ct-värde (vågrät linje) för varje markör beräknades med i genomsnitt tre biologiska replikat. Unpaired Student's t-test,*p < 0,05. Felstaplar: ± SD. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 7:Montering av linguala organoider för inverterad konfokal mikroskopi. (A) En ~1 mm tjock sträng av giftfri modelleringslera skapas. (B) Leran skulpteras som en ~20 mm x 20 mm kvadrat i mitten av en 24 mm x 75 mm mikroskopbild. C)En 22 mm x 22 mm fyrkantslock förseglar organoider upphängda i monteringsmedium. Skalbar: 10 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Immunolabeling av intakta linguala organoider. Konfokala bilder av fasta, immunostained organoider. a)Optisk del av en organoid fläckad för icke-smak epitelmarkör KRT13 (grön) och allmän TRC-markör KRT8 (magenta). (B) Maximal projektion av en konfokal z-stack av en organoid fläckad för typ I-glialiknande cellmarkör NTPDase2 (grön) och KRT8 (magenta). C)Maximal projektion av en confocal z-stack av två delvis visade organoider (vitstreckade konturer) och en komplett organoid färgad för typ III surdetektering cell markör CAR4 (grön) och bitter detektering typ II cell markör GUSTDUCIN (magenta). Skalstång: 100 μm för A, B och C. Kärnmarkör DAPI (blå, höger kolumn). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Gennamn | Främre primer (5'-3') | Omvänd primer (5'-3') | Assession-nummer | ||||||
| Bil4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC (CTGCTAGGACAAAGGTGAACC) | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607,2 | ||||||
| Entpd2 (entpd2) | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG (GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG) | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC (OLIKA) | NM_009849,2 | ||||||
| Gnat3 (gnat3) | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC (PÅCCAGGAATCCAAGCCTGC) | TGGTTTTCACCCGGGAATGT (TGGTTTTCACCCGGGAATGT) | NM_001081143,1 | ||||||
| Kcnq1 (på 1000)090 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG (på)2019 | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434,2 | ||||||
| Krt13 (krt13) | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA (TCATCTCGGTTTGTCACTGGA) | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662,2 | ||||||
| Rpl19 (på 2) | GGTCTGGTTGGATCCCAATG (GGTCTGGTTGGATCCCAATG) | CCCGGGAATGGACAGTCA (på andra) | NM_009078,2 | ||||||
Tabell 1: Primersekvenser som används för kvantitativ RT-PCR.
Kompletterande tabell 1: Jämförelse av publicerade linguala organoida odlingsmediekomponenter. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rapporteras här är en effektiv och lätt repeterbar metod för odling, underhåll och bearbetning av linguala organoider som härrör från vuxna mussmak stamceller. Det konstaterades att använda tre CVPs från 8 till 20 veckor gamla Lgr5-EGFP möss är tillräckligt för att få ~ 10,000 GFP+ celler för experimentell användning, vilket resulterar i 50 brunnar pläterade med en densitet av 200 celler per brunn i 48-brunnsplattor. Avlägsnande av CVP dike epithelia optimeras genom att injicera lingual epitel med nytillverkade Dispase II och typ-I Collagenase lösning, följt av en 33 min inkubation. En kortare inkubationstid, gamla enzym alikvoter, olika partier eller användning av enzymer från olika tillverkare kan dock resultera i ofullständig dikesborttagning. Omvänt orsakar en längre inkubationstid översmältning av vävnaden, vilket resulterar i förlust av smakvävnadens integritet. Efter peeling gjordes ytterligare berikning för CVP skyttegravar genom att trimma bort epitel som omger CVP.
Det är viktigt att alla mikrocentrifugrör som används under dissociation och insamlingsprocessen är belagda med FBS för att förhindra att vävnad och celler fastnar på rörens plastväggar, vilket avsevärt minskar återvinningen av isolerade celler (data som inte visas). Genom att använda ett lätt lager av FBS och avlägsna överflödig vätska från rören före användning minimeras eventuella hämmande effekter på Trypsin eller andra enzymer.
Linguala organoider har odlats framgångsrikt från dissociated CVP vävnad utan föregående sortering av LGR5+ celler17. Även om denna metod resulterar i bildandet av organoider, har vi funnit att en mindre andel av dessa organoider innehåller smakceller jämfört med de som odlas från isolerade stamceller (data som inte visas). Flödessortering för Lgr5-EGFP+ celler berikar för smakbestärkande stamceller, vilket resulterar i en högre andel smakperlete organoider. För närvarande samlar vi alla celler över tröskeln för GFP autofluorescens (Figur 3); det är dock möjligt att GFP ljusstyrka nivåer är associerade med variabel organoid bildar effektivitet eller smak kompetens. Denna hypotes har ännu inte testats men är en lovande väg för framtida arbete eftersom det skulle kunna möjliggöra ytterligare berikning av smakcellsinnehållande organoider.
Det är välkänt att pläteringstäthet påverkar effektiviteten hos organoid differentiering, och vi rekommenderar att optimal pläteringstäthet bestäms före experiment28. Brunnens storlek och djup, liksom matrisgelvolym, bör beaktas vid fastställandet av pläteringstätheten. Baserat på vårt preliminära arbete (data som inte visas) finner vi att i en 48-brunnsplatta möjliggör 15 μL matrisgel och en pläteringstäthet på 200 celler per brunn effektiv organoid expansion och differentiering av alla tre TRC-typerna. Vi har funnit att lingual organoider kan odlas framgångsrikt och reproducerbart i Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract (RGF BME), ett syntetiskt och billigare matrisgelalternativ. Andra alternativa matriser kan också stödja lingual organoid kultur, men ytterligare testning krävs för att undersöka denna möjlighet.
Under plätering bör insamlade celler vara noggrant men försiktigt återanvändas i matrisgel genom att ofta pipetta upp och ner för att hålla cellfjädringen homogen. Röret som innehåller cellmatrisgelblandningen bör också hållas på is under hela pläteringsprocessen för att förhindra att matrisgel geler på rörsidorna. Dessa åtgärder säkerställer en jämn fördelning av celler över brunnar, vilket ger mer reproducerbara resultat vid handplätering av celler. Särskilt den senaste utvecklingen inom mikrofluidisk teknik ger höga genomströmningsalternativ för celldispensering och är ett lovande verktyg för framtida arbete29.
För att bedöma genuttryck i odlade organoider konstaterades det nödvändigt att slå samman minst tre brunnar för varje biologisk replikat för att erhålla tillräckligt med RNA och konsistens över replikat (figur 6). Det fastställdes också att omedelbart lysing skördade organoider enligt specifika tillverkarens instruktioner optimerar kvaliteten och kvantiteten av extraherade RNA. Även om de inte testas här, kan andra lagringsalternativ som blixtfrysning eller återsuspension i lagringsreagenser också bevara RNA-utbyte och kvalitet.
Att utföra immunohistokemi på organoider kan vara utmanande, eftersom primära och sekundära antikroppar måste tränga in i någon restmatrisgel och hela organoidepiteelet. I tidigare rapporter fixades organoider medan de fortfarande suspenderades i matrisgel, vilket därefter krävde extremt höga koncentrationer av primär antikroppslösning för att avslöjaproteinuttryck 17,18. I likhet med andra rapporter konstaterades avlägsnande av organoider från matrisgel med cellåtervinningslösning före fixering för att öka färgningseffektiviteten utan att behöva en hög antikroppskoncentration30,31; Detektion av vissa smakcellsmarkörer, t.ex. Vidare ökar inkubation av organoider i primär antisera i 3 nätter sannolikheten för antikroppsbindning. Denna metod kan dock också öka bakgrundsfluorescensen om organoider inte tvättas tillräckligt efter immunostaining. Viktigt är att utspädd primär antikroppslösning kan sparas och framgångsrikt återutnyttjas en eller flera gånger om den lagras i mindre än en vecka (data visas inte). För optimal avbildning monteras organoider genom att placera ett täckglas ovanpå en leromkrets av modelleringslera för att bevara deras 3D-struktur. Att placera täckglaset direkt på skjutbanan komprimerar och bryter organoider, vilket förhindrar korrekt analys.
Organoidkultur är en mycket tillämplig, kostnadseffektiv teknik. Vissa tillämpningar inkluderar, men är inte begränsade till, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening och studier av stamcells- och utvecklingsbiologi32. Därför är det viktigt att standardisera organoidmodeller för att möjliggöra reproducerbarhet mellan laboratorier. I framtiden skulle det vara användbart att utveckla en standardiserad metod för att passa linguala organoider som garanterar att smak stamcellspotens kan förökas över seriella passager, vilket minskar behovet av ytterligare djur för att generera fler organoider. Viktigt, medan linguala organoider består av både smak och icke-smak epitelceller, skiljer sig organisationen av dessa celler jämfört med in vivo smaksystemet. Skillnader mellan organoider och smakepiteel in vivo kan bero på de medier som används för organoid kultur och/eller på grund av att organoider saknar interaktion med smakknoppens mikromiljö, inklusive viktiga signaler från gustatory nerver och lamina propria som krävs för smakknopp bildas och underhåll22,33,34,35. Framtida arbete för att införliva nerver eller vaskulatur i lingual organoid kultur, en strategi som för närvarande antas i andra organoidsystem, kan möjliggöra mer exakt modellering av in vivo smak epitel36,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Peter Dempsey och Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) för att ge WNR betingade medier och värdefulla diskussioner. Vi tackar också University of Colorado Cancer Center Cell Technologies och Flow Cytometry Shared Resources, särskilt Dmitry Baturin, för cellsorteringsexpertis. Detta arbete finansierades av: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 och NIH/NCI R21 CA236480 till LAB och R21DC016131 och R21DC016131-02S1 till GD och F32 DC015958 till EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
