Summary
Protokollen præsenterer en metode til dyrkning og behandling af sproglige organoider afledt af smagstamceller isoleret fra den bageste smag papilla af voksne mus.
Abstract
Smagssansen medieres af smagsløg på tungen, som består af hurtigt fornyende smagsreceptorceller (TRCs). Denne fortsatte omsætning er drevet af lokale stamfaderceller og gør smagsfunktionen tilbøjelig til forstyrrelser af et væld af medicinske behandlinger, hvilket igen alvorligt påvirker livskvaliteten. Således er det vigtigt at studere denne proces i forbindelse med lægemiddelbehandling for at forstå, om og hvordan smags stamfaderfunktion og TRC-produktion påvirkes. I betragtning af de etiske bekymringer og begrænset tilgængelighed af human smag væv, musemodeller, som har en smag system svarende til mennesker, er almindeligt anvendt. Sammenlignet med in vivo-metoder, som er tidskrævende, dyre og ikke modtagelige for undersøgelser med høj gennemløb, kan murine lingual organoider gøre det muligt at køre eksperimenter hurtigt med mange replikationer og færre mus. Her er tidligere offentliggjorte protokoller blevet tilpasset, og en standardiseret metode til generering af smagsorganoider fra smag stamfaderceller isoleret fra den omkredslige papilla (CVP) af voksne mus præsenteres. Smag stamfaderceller i CVP express LGR5 og kan isoleres via EGFP fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) fra mus, der bærer en Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 allele. Sorterede celler er belagt på et matrix gel-baseret 3D-kultursystem og dyrkes i 12 dage. Organoider udvider sig i de første 6 dage af kulturperioden via spredning og går derefter ind i en differentieringsfase, hvor de genererer alle tre smagscelletyper sammen med ikke-smags epitelceller. Organoider kan høstes ved modning på dag 12 eller når som helst under vækstprocessen for RNA-udtryk og immunohistokemisk analyse. Standardisering af kulturmetoder til produktion af lingualorganoider fra voksne stamceller vil forbedre reproducerbarheden og fremme lingualorganoider som et kraftfuldt lægemiddelscreeningsværktøj i kampen for at hjælpe patienter, der oplever smagsdysfunktion.
Introduction
Hos gnavere er lingual smagsløg anbragt i fungiform papillae fordelt forreste, bilateral foliate papillae posteriorly, samt en enkelt circumvallate papilla (CVP) på den bageste midterlinje af tungen1. Hver smagsløg består af 50-100 kortvarige, hurtigt fornyende smag receptor celler (TRCs), som omfatter type I glial-lignende støtteceller, type II celler, der registrerer søde, bitter, og umami, og type III celler, der registrerer sur2,3,4. I musen CVP, LGR5+ stamceller langs basal lamina producere alle TRC typer samt ikke-smag epitelceller5. Ved fornyelse af smagslinjen specificeres LGR5-datterceller først som post-mitotiske smagsprækursorerceller (type IV-celler), der kommer ind i en smagsløg og er i stand til at differentiere sig i en af de tre TRC-typer6. Den hurtige omsætning af TRCs gør smagssystemet modtagelige for forstyrrelser af medicinske behandlinger, herunder stråling og visse lægemiddelbehandlinger7,8,9,10,11,12,13. Således er det afgørende at studere smagssystemet i forbindelse med smagsstamcelleregulering og TRC-differentiering for at forstå, hvordan man afbøder eller forhindrer smagsdysfunktion.
Mus er en traditionel model for in vivo-studier i smagsvidenskab, da de har et smagssystem organiseret på samme måde som mennesker14,15,16. Mus er dog ikke ideelle til undersøgelser med høj gennemløb, da de er dyre at vedligeholde og tidskrævende at arbejde med. For at overvinde dette er der i de senere år blevet udviklet in vitro organoidkulturmetoder. Smag organoider kan genereres fra indfødte CVP væv, en proces, hvor organoider bud off fra isolerede mus CVP epitel dyrkede ex vivo17. Disse organoider viser et flerlags epitel i overensstemmelse med in vivo smagssystemet. En mere effektiv måde at generere organoider, der ikke kræver ex vivo CVP-kultur, blev udviklet af Ren etal. i 201418. Tilpasning af metoder og kulturmedier, der først blev udviklet til at dyrke tarmorganoider, isolerede de enkelt Lgr5-GFP+ stamfaderceller fra musen CVP og belagt dem i matrix gel19. Disse enkelte celler genererede linguelle organoider, der formerer sig i løbet af de første 6 dage af kulturen, begynder at differentiere omkring dag 8, og ved udgangen af kulturperioden indeholder ikke-smag epitelceller og alle tre TRC typer18,20. Til dato er der offentliggjort flere undersøgelser, der anvender det sproglige organoidmodelsystem,17,18,20,21,22; Metoder og kulturbetingelser, der anvendes til at generere disse organoider, varierer dog på tværs af publikationer (supplerende tabel 1). Således er disse metoder blevet justeret og optimeret her for at præsentere en detaljeret standardiseret protokol for kulturen af lingual organoids afledt af LGR5+ forfædre af voksne mus CVP.
Lingual organoider giver en unik model til at studere de cellebiologiske processer, der driver smagscelleudvikling og fornyelse. Som anvendelser af lingual organoids udvide og flere laboratorier bevæger sig i retning af at udnytte in vitro organoid modeller, er det vigtigt, at området stræber efter at udvikle og vedtage standardiserede protokoller for at forbedre reproducerbarhed. Etablering lingual organoids som et standardværktøj inden for smagsvidenskab ville muliggøre høj gennemløb undersøgelser, der driller fra hinanden, hvordan enkelte stamceller generere differentierede celler i den voksne smag system. Derudover kan lingual organoids anvendes til hurtigt at screene lægemidler for potentielle virkninger på smag homøostase, som derefter kunne undersøges mere grundigt i dyremodeller. Denne tilgang vil i sidste ende øge indsatsen for at udtænke behandlinger, der forbedrer livskvaliteten for fremtidige lægemiddelmodtagere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprocedurer blev udført i en AAALAC-akkrediteret facilitet i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr, dyrevelfærdsloven og folkesundhedspolitikken og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på University of Colorado Anschutz Medical Campus. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 mus, der anvendes i denne protokol er fra The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
BEMÆRK: Følgende trin bør være afsluttet, inden de påbegyndes for at sikre en jævn og rettidig progression af protokollen: sæt vandbad til 37 °C, sæt centrifuge til 4 °C, lav injektions- og dissociationsenzymopløsninger fra de 10 mg/mL Dispase-, kollagen- og Elastaselageropløsninger (se materialetabellen),fjern matrixgel fra -20 °C-fryseren (~750 μL er nødvendig for en 48-brøndplade) og optø ved at nedsænke hætteglasset i is til ved mindst 3-4 timer, mikrocentrifugrør på forlag i ufortyndet FBS ved at vugge forsigtigt ved stuetemperatur i mindst 30 min (to 2 mL rør til vævsindsamling, to 1,5 mL rør til dissocierede celler og et 1,5 mL rør til opsamling af enkeltceller fra cellesortering; fjern overskydende FBS før brug).
1. Isolering af CVP epitel
BEMÆRK: For at få nok LGR5+ celler til en fuld 48-brønd plade, indsamle tre Lgr5-EGFP CVPs i samme rør og proces samtidigt. Det er vigtigt, at høst og behandle CVP af mindst én vild type littermate parallelt i et separat rør og bruge det som en gating kontrol til at indstille FACS parametre (se repræsentative resultater).
- Aflive musene med CO2 kvælning i henhold til IACUC regler, efterfulgt af en godkendt sekundær metode såsom bilateral thoracotomy, cervikal dislokation, halshugning, eller exsanguination.
- Brug store sterile dissektion saks til at skære kinderne og bryde kæben. Løft tungen og skær den sproglige frenulum for at adskille tungen fra gulvet i mundhulen. Skær tungen ud og saml den i steril iskold Dulbeccos fosfatbuffered saltvand (dPBS) med Ca2+ og Mg2+.
- Fjern og kassér den forreste tunge ved kun at skære forreste del af intermolar eminence med et barberblad (Figur 1A, stiplet linje). Brug en delikat opgave tørre til at fjerne hår og overskydende væske fra den bageste tungen.
- Fyld 1 mL sprøjte med 200-300 μL injektionsenzymopløsning (endelig koncentration: 2 mg/mL type-I kollagenase og 5 mg/mL Dispase II i Ca2+/Mg2+-indeholdende dPBS, fortyndet fra 10 mg/mL lageropløsninger) og indsæt en 30 G x 1/2 nål lige over den intermolar eminence (Figur 1B, sort pil) indtil blot en forreste til CVP ( Figur1B, sort boks). Indsprøjt enzymopløsningen under og ved CVP's sidekanter mellem epitelet og det underliggende væv (lamina propria, muskel). Træk sprøjten langsomt og kontinuerligt ud af tungen, mens injektionen udføres.
- Inkuber tungen i steril Ca2+/Mg2+-fri dPBS ved stuetemperatur i præcis 33 min.
- Lav små nedskæringer i epitel bilateralt og bare forreste til CVP ved hjælp af ekstra fin dissektion saks, og forsigtigt skræl epitel ved at løfte det med fine tang. Når skyttegrav epitel er fri for den underliggende bindevæv, placere det i en tom 2 mL mikrocentrifuge rør for belagt med FBS. Brug epiteltrimningen før eller efter afmontering af CVP-epitelet (Figur 1C, D).
2. Dissociation af CVP epitel
BEMÆRK: Dissociation af CVP-epitel og plating er grafisk repræsenteret i figur 2.
- Der tilsættes dissociationsenzymcocktailen (endelig koncentration: 2 mg/mL type-I kollagenase, 2 mg/mL Elastase og 5 mg/mL Dispase II iCa. 2+/Mg2+-indeholdende dPBS, fortyndet fra 10 mg/mL lageropløsninger) til rør, der indeholder skrællet CVP epithelia (200 μL pr. CVP). Inkuberes i et 37 °C vandbad i 45 min. Vortex kort hvert 15. minut.
BEMÆRK: Førkrigstidens 0,25% Trypsin-EDTA i 37 °C vandbad i løbet af de sidste 15 min af enzym cocktail inkubation. - Efter inkubation, vortex (tre pulser) derefter triturere med et glas Pasteur pipette i 1 min. Når vævsstykkerne har slået sig ned, pipettes supernatanten, der indeholder første samling af dissocierede celler, i nye FBS-belagte 1,5 mL mikrocentrifugerør svarende til genotypen. De resterende vævsstykker behandles yderligere som beskrevet i trin 2.3. under.
- Drej supernatanten i 5 min ved 370 x g og 4 °C til pilleceller.
- Fjern den resulterende supernatant, og brug cellepillen i fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) Buffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) og 1% FBS i Ca2+/Mg2+-fri PBS (50 μL pr. CVP)). Opbevar på is.
- Under udførelse af trin 2.2.1 og 2.2.2 skal de resterende vævsstykker adskilles fra trin 2.2 ved at tilsætte forvarmede 0,25 % trypsin-EDTA (200 μL pr. CVP) til de originale 2 mL mikrocentrifugrør og inkuberes i et 37 °C vandbad i 30 min. Vortex kort hvert 10. minut.
- Efter inkubation, vortex røret indeholder vævsstykker (tre bælgfrugter) derefter triturat med et glas Pasteur pipette i 1 min. Når vævsstykkerne har lagt sig, pipettes supernatanten i de 1,5 ML mikrocentrifugerør, der indeholder celler fra trin 2.2.2. Kassér rørene, der indeholder de resterende vævsstykker.
- Rør med dissocierede celler i 5 min ved 370 x g og 4 °C til pilleceller.
- Fjern supernatant- og genanvendecellepillerne i FACS Buffer (100 μL pr. CVP). Opbevar på is.
- Før cellerne gennem et 30 μm nylonnetfilter, og tilsættes DAPI (λemission = 450 nm) til celleblandinger før FACS. Isoler Lgr5-GFP+ celler via FACS ved hjælp af den grønne fluorescerende proteinkanal (λexcitation = 488 nm; λemission = 530 nm). Sorter cellerne ved hjælp af en 100 μm dyse i en frisk FBS-belagt 1,5 ml mikrocentrifuge rør indeholdende 300 μL af Ca2 +/ Mg2 + gratis dPBS. Placer cellerne på is, indtil plating.
3. Plating af Lgr5-EGFP-celler
- Bestem mængden af LGR5+ celleaffjedring modtaget fra flowcytometeret.
- Baseret på antallet af celler fra sorteringen beregnes antallet af celler pr. μL. Derefter bestemmes det volumen, der er nødvendigt for at opnå det ønskede antal celler til plating (vi bruger 200 celler pr. brønd af en 48-brønds plade) og overfører det samlede volumen af suspenderede celler til et nyt mikrocentrifugerør.
- Drej røret i 5 min ved 370 x g og 4 °C til pelletceller (pellet er muligvis ikke synlig). Fjern supernatanten og læg røret på is.
- Forsigtigt genbruge cellepillen i den passende mængde matrix gel (15 μL pr brønd for 48-brønd plader); pipette op og ned forsigtigt for at distribuere celler grundigt i matrixgel. Placer 15 μL matrix gel / celle blanding i midten af hver brønd. Opbevar mikrocentrifugrøret på is i et 50 mL konisk rør under plating for at forhindre matrixgel i at gelere. Fortsæt med at blande matrix gel / celle blanding i hele plating ved pipetter op og ned hver tredje brønde for at sikre en jævn fordeling af celler på tværs af brønde.
- Placer pladen i inkubatoren (37 °C, 5% CO2, ~95% fugtighed) i 10 min for at tillade matrix gelering. Derefter tilsættes 300 μL stuetemperatur WENRAS + Y27632 medier til hver brønd og returnere pladen til inkubatoren.
4. Organoid vedligeholdelse
BEMÆRK: Organoider dyrkes i konventionelle organoidmedier (WENR), der omfatter rekombinant EGF og 50% konditionerede medier, der indeholder Wnt3a, Noggin og R-spondin23. Lægemidler A8301 og SB202190 tilføjes i de første 6 dage af kulturperioden for at optimere væksten (WENRAS medier) (Figur 5), derefter fjernet for at fremme differentiering (WENR medier)20. Y27632 tilføjes i de første 2 dage af kulturen for at fremme overlevelse. Medieforholdene i forhold til kulturtidslinjen præsenteres i figur 4.
- To dage efter plating skal wenras + Y27632-medier fjernes fra hver brønd ved hjælp af en 1 mL pipette, hvilket sikrer ingen krydskontaminering. Tilsæt 300 μL WENRAS-medier ned langs brøndens side for ikke at forstyrre matrixgelen. Returner pladen til inkubatoren.
- Skift mediet hver anden dag ved hjælp af de relevante medier til kulturstadiet (figur 4). Vedligehold organoider indtil dag 12, når organoiderne er klar til høst.
5. RNA-behandling
- Høst af organoider til RNA
- Placer 48-brønd plade på is i 30 minutter for at depolymerize matrix gel.
- Træk organoidmedierne op ved hjælp af en 1 mL-pipette. derefter, når mediet returneres til brønden, skal du bruge spidsen af pipetten til at ridse og yderligere bryde matrixgelen. Overfør indholdet til et 1,5 mL mikrocentrifugerør, der samler indholdet af tre brønde i et rør. Centrifugere rørene i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur.
- Fjern så meget medie supernatant som muligt uden at fjerne nogen organoider; derefter drejes rør igen i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur.
- Fjern de resterende medier og brug organoiderne i 350 μL lysis buffer + β-mercaptoethanol (βME) (10 μL βME pr. 1 mL lysis buffer). Læg prøverne på is til øjeblikkelig RNA-udvinding eller opbevaring ved -80 °C.
- Kvantitativ RT-PCR-analyse
- Mål RNA-mængden via spektrofotometer. Omvendt transskribering RNA ved hjælp af en cDNA Synthesizer kit.
- Bland cDNA svarende til 5 ng RNA med 200 nM forhåndsgodkendte frem- og omvendte primere (tabel 1) og fluorescerende PCR Master Mix. Kør qRT-PCR-reaktionen i 40 cyklusser ved: 95 °C i 15 s, derefter 60 °C for 60 s.
6. Immunohistochemistry
- Høst og fastgørelse af organoider
- Placer 48-brønd plade på is i 30 minutter for at løsne matrix gel.
- Fjern organoidmediet, og tilsæt 400 μL iskold PBS til hver brønd. Fjern derefter PBS og tilsæt 400 μL iskold cellegendannelsesløsning til hver brønd. Rock forsigtigt ved 4 °C i 30 min.
- Coat en 1 mL pipet spids med 1% BSA i PBS, og forsigtigt pipet indholdet af brønden op og ned for at bryde op matrix gel. Overfør organoiderne til et 1,5 mL mikrocentrifugerør placeret på is.
- Skyl hver brønd med 300 μL PBS + 1% BSA og overfør eventuelle resterende organoider til de tilsvarende rør. Fjern Cell Recovery Solution/PBS + BSA fra hvert rør. Tilsæt 400 μL iskold PBS, og gentag derefter med endnu en iskold PBS-skylning.
- Pbs fjernes og fix organoider med 300 μL iskold 4% PFA (i 0,1 M PB) i 20 min, inkubation ved stuetemperatur. Fjern PFA og skyl organoider med 400 μL iskold PBS.
- Fjern PBS; derefter tilsættes 400 μL PBS + 1% BSA. Opbevares ved 4 °C.
- Immunofluorescence farvning
- Skyl organoider i 500 μL PBS + 1% BSA. Derefter inkuberes organoider i blokeringsopløsning (5% normal ged eller æselserum, 1% kvægserum albumin, 0,3% Triton X 100 i 1x PBS pH 7.3) i 2 timer, vuggende forsigtigt ved stuetemperatur.
- Tilsættes den primære antistofopløsning (primære antistoffer fortyndet i blokerende opløsning) og rockes forsigtigt i 3 nætter ved 4 °C.
- Vask organoider 4x i 1 time med 500 μL PBS + 0,2% Triton, vuggende forsigtigt ved stuetemperatur. Tilsættes sekundær antistofopløsning (sekundære antistoffer fortyndet i blokerende opløsning) og stenorganoider natten over, beskyttet mod lys, ved 4 °C.
- Vask organoider 3x i 1 time med 500 μL PBS + 0,2% Triton, beskyttet mod lys og vuggende forsigtigt ved stuetemperatur. Inkuberes med DAPI fortyndet 1:10.000 i 0,1 M PB i 20 min, vuggende og dækket ved stuetemperatur.
- Orgoiderne vaskes 3x i 20 min med 0,1 M PB, vuggende forsigtigt og dækket ved stuetemperatur.
- Slide montering af organoider til omvendt konfokal mikroskopi.
BEMÆRK: Trinvise billeder af diasmonteringsprocessen vises i figur 7.- Opret en ~ 1 mm tyk 22 x 22 mm firkantet omkreds af ikke-giftige modellering ler på et mikroskop dias.
- 0,1 M PB fjernes fra mikrocentrifugerøret, og de genbruges forsigtigt organoider i 100 μL monteringsmedium efter eget valg. derefter overføres til midten af lerpladsen.
- Fyld lerpladsen, indtil monteringsmediet næsten er til toppen. Derefter placeres 22 x 22 mm firkantet coverlip over ler og tryk ned fast på siderne af dækslen for at forsegle. Lad det helbrede i henhold til producentens anvisninger (her stuetemperatur i 1-2 dage) og opbevares ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus har en CVP, placeret posteriorly på tungen, hvorfra LGR5+ stamceller kan isoleres (Figur 1A, sort boks). Injektion af en enzymopløsning under og omkring CVP (figur 1B) resulterer i let hævelse af epitelet og fordøjelsen af bindevævet. Tilstrækkelig fordøjelse opnås efter en inkubation på 33 min, hvilket gør det nemt at udskille CVP-epitelet fra det underliggende væv. Når man forsøger at skrælle CVP-epitelet, skal der foretages udskæringer i tilstrækkelig afstand fra CVP for at sikre, at skyttegravene ikke forstyrres eller beskadiges (Figur 1C). Dette gør det også muligt at gribe epitelet ved hjælp af tang uden at beskadige CVP. Trimning af epitelet omkring CVP fjerner ikke-målceller og øger effektiviteten af følgende trin ved at reducere vævsmassen, der manipuleres (Figur 1D). Det er vigtigt at kontrollere, at de to skyttegrave (Figur 1C, sorte pile) er til stede, før du tilføjer CVP epitel til mikrocentrifugerøret; vellykket peeling af CVP omfatter en del af Von Ebners kirtler og kanaler (Figur 1D, sorte pile). Hvis det skrællede epitel ikke indeholder disse to uigennemsigtige strukturer, er skyttegravs epitel sandsynligvis bristet på grund af ufuldstændig fordøjelse af bindevævet.
For at etablere korrekte FACS-indstillinger til indsamling af Lgr5-EGFP-celler opnås celler fra dissocierede CVP'er separat fra vilde typer og Lgr5-EGFP-mus. Wild type CVP-celler analyseres først for at etablere gating parametre, en proces, hvor populationer af celler er kategoriseret i scatterplot output af karakteristika af interesse24. Her blev fire parametre brugt til i sidste ende at identificere celler til plating. Den første parameter, fremad scatter, filtrerer partikler og snavs baseret på det det det fundne overfladeareal. Denne parameter fjerner ~70 % af alle fundne hændelser under sorteringen (Figur 3). Breddeparameteren filtrerer yderligere hændelser baseret på størrelse for at sikre valg af enkelte celler (singlets). Ca. 90 % af hændelserne er singlets (figur 3). Den nukleare markør DAPI er taget op af døde, men ikke levende celler og dermed tillader døde celler, der skal sorteres ud25. Denne protokol optimerer cellelevedygtigheden, da over 90 % af hændelserne er dynamiske celler (Figur 3). Endelig er GFP-gatingparametre sat over autofluorescenceniveauet for celler af vilde typer. Celler af typen vildtype indsamles ikke. de anvendes udelukkende som en gating control for GFP fluorescens. Med gating parametre bestemt ud fra den vilde typeprøve køres celler fra Lgr5-EGFP-prøven derefter gennem flowcytometeret, der skal sorteres til indsamling. Gates kan justeres i begyndelsen af Lgr5-EGFP slags til at rumme klare klyngedannelse af visse cellepopulationer, men bør ikke ændres væsentligt midt på sortere. Det blev konstateret, at dissociation af tre puljede Lgr5-EGFP CVPs udbytter ~ 500.000 celler, herunder et gennemsnit på 10.000 GFP+ celler.
Ordentlige medie- og kulturforhold er afgørende for optimal vækst og differentiering af organoider. Tidligere undersøgelser, der udnyttede lingualorganoider, modellerede deres mediekomponenter efter dem fra tarmorganoidfeltet, herunder Wnt3a, EGF, Noggin og R-spondin17,18,19,20,21,22. Men når lingual organoider dyrkes ved hjælp af en lignende metode (WENR-medier), vokser organoider ikke effektivt (Figur 5A). I humane intestinale organoider anvendes lægemidler A8301 (en TGFß-signalhæmmer) og SB202190 (en p38 MAPKinase-signalhæmmer) til at fremme organoidvækst26. Hvis disse hæmmere tilføjes (WENRAS-medier), fremkalder det faktisk en robust vækst af lingualorganoider (figur 5A). Interessant nok resulterer fjernelse af disse hæmmere fra medierne efter 6 dage i højere udtryk for generel TRC-markør Kcnq1, hvilket tyder på, at A8301 og SB202190 hindrer smagscelledifferentiering (Figur 5B). Således opnås optimal vækst og differentiering ved dyrkning af organoider i WENRAS-medier fra henholdsvis dag 0-6 og WENR-medier fra henholdsvis dag 6-12 (figur 4, figur 5).
Organoid celle type sammensætning kan karakteriseres ved qRT-PCR eller immunohistochemistry. Modne organoider indeholder både smagsceller, præget af Kcnq1 og KRT8, og ikke-smags epitelceller, præget af Krt13/KRT13 (Figur 6, 8A). Dette tyder på isolerede LGR5+ celler har en lignende styrke in vitro som de gør in vivo, da Lgr5-GFP+ celler i den voksne tunge producerer både smag og ikke-smagsvarer5. Endvidere udtrykkes Krt13 på højere niveauer end alle 3 TRC-markører (Figur 6), hvilket tyder på, at organoider overvejende består af ikke-smags epitelceller. Faktisk indikerer relativ kvantificering af genekspression27 Krt13 udtrykkes 50x højere end den generelle TRC-markør Kcnq1 (Student's t-test,p = 0,0004). Dette forventes, da tungen har en lignende andel af smag versus ikke-smag epitel1. Organoider udtrykker alle tre TRC-typer (figur 6,8B, C). Type I-celler (markeret med Entpd2) og bitre type II-celler (markeret med Gnat3) udtrykkes i høj grad i smagsorganoider, mens sure sensing type III-celler (markeret med Car4) er mindre almindelige (Figur 6). TRCs er tilfældigt fordelt i organoider (figur 8) snarere end i diskrete smagsløg strukturer observeret in vivo.
Figur 1: Dissekeret tunge og skrællet CVP epitel. (A) Tungen dissekeres ud, og den forreste tunge fjernes ved at skære bare forreste del af intermolar eminence (stiplet linje), forlader den bageste tunge, som omfatter CVP (sort boks) (B) En nål indsættes bare forreste til mellemmolar eminence (sort pil), og enzymblanding injiceres nedenfor og til de laterale kanter af CVP (sort boks). (C) Utrimmet skrællet epitel omkring CVP-skyttegravene (sorte pile) og (D) trimmede skrællede CVP-epitel. Von Ebners kirtler og kanaler (D, sorte pile) er synlige efter vellykket peeling af skyttegravene. Skalalinje: 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Arbejdsgang for sprogorganoidgenerering. Tungen fjernes fra Lgr5-EGFP mus. CVP skyttegrav epithelia (rød boks) er skrællet fra den underliggende bindevæv og adskilles i enkelte celler. GFP+ celler er isoleret og belagt i matrix gel ved en densitet på 200 celler pr brønd i en 48-brønd plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Gating for fluorescensaktiveret cellesortering. (A) Kontrol (vilde type CVP-celler) køre bestemmer FACS porte, der eliminerer snavs og brudte celler via fremad scatter, identificerer singlets via side scatter bredde, adskiller DAPIneg live fra DAPI+ døde celler, og etablerer autofluorescence niveau af vilde type celler. (B) Tidligere bestemte porte anvendes på forsøgskørslen (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP-celler) for at isolere snavsfrie, enkelt, levende, Lgr5-EGFP+ celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Lingual organoid kultur tidslinje og krævede medier. ROCK-hæmmer Y27632 føjes til medierne for de første 48 h af kulturen for at fremme celleoverlevelse. I spredningsfasen fodres organoider med konditioneret medium, der indeholder A8301 og SB202190 (WENRAS) for at optimere væksten. Disse stoffer tilbageholdes fra medierne (WENR) fra dag 6 for at fremme differentiering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Lægemidler A8301 og SB202190 påvirker organoidvækst og differentiering. (A) Brightfield-billeder af organoider dyrket i enten WENR-medier (dag 0-12), WENRAS-medier (dag 0-12) eller WENRAS (dag 0-6), derefter WENR (dag 6-12). Billeder blev taget på dag 2, dag 6 og dag 12 af kultur ved hjælp af live billedbehandling software. Skalastang: 400 μm (B) Relativ genekspression af en global TRC-markør Kcnq1 reduceres betydeligt, når lægemidlerne A8301 og SB202190 er til stede under organoiddifferentiering. Hvert punkt repræsenterer en biologisk replikation, som omfattede tre poolede brønde. Gennemsnitlig ændring i relativ genekspression (vandret linje) blev beregnet ved i gennemsnit tre biologiske kopier. Fejllinjer: ±SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Lingual organoider udtrykker kanoniske smagscellemarkører. Ændring i cyklustærskelværdien (Ct) af den globale TRC-markør Kcnq1, ikke-smags epitelmarkør cytokeratin 13 (Krt13), type I TRC-markør Entpd2, type II bitter TRC-markør Gnat3og type III sur TRC-markør Car4sammenlignet med husholdningsgenet Rpl19. Hvert punkt repræsenterer en biologisk replikation, som omfattede tre poolede brønde fra en 48-brønd plade. Gennemsnitlig ændring i Ct-værdien (vandret linje) for hver markør blev beregnet ved i gennemsnit tre biologiske replikater. Umalet students t-test,*p < 0,05. Fejllinjer: ± SD. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Figur 7: Montering af linguelle organoider til omvendt konfokal mikroskopi. (A) Der skabes en 1 mm tyk streng af giftfri modellerings ler. (B) Leret er formet som en ~ 20 mm x 20 mm firkantet i midten af en 24 mm x 75 mm mikroskop dias. (C) En 22 mm x 22 mm firkantet dækslet forsegler organoider ophængt i monteringsmedium. Skalalinje: 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Immunmærkning af intakte lingualorganoider. Confocal billeder af faste, immunplettede organoider. (A) Optisk del af en organoid farves til ikke-smag epitelmarkør KRT13 (grøn) og generel TRC markør KRT8 (magenta). (B) Maksimal projektion af en confocal z-stack af en organoid farves for type I glial-lignende celle markør NTPDase2 (grøn) og KRT8 (magenta). (C) Maksimal projektion af en konfokal z-stak af to delvist viste organoider (hvidstiplede konturer) og en komplet organoid, der er farvet til type III sur detektering af cellemarkør CAR4 (grøn), og bitter detektering af type II-cellemarkøren GUSTDUCIN (magenta). Skalastang: 100 μm for A, B og C. Nuklear markør DAPI (blå, højre kolonne). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Gennavn | Fremad primer (5'-3') | Omvendt primer (5'-3') | Assessionsnummer | ||||||
| Bil4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607,2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tabel 1: Primersekvenser, der anvendes til kvantitativ RT-PCR.
Supplerende tabel 1: Sammenligning af offentliggjorte sprogorganoidkulturmediekomponenter. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rapporteret her er en effektiv og let repeterbar metode til dyrkning, vedligeholdelse og behandling lingual organoider stammer fra voksne mus smag stamceller. Det blev konstateret, at ved hjælp af tre CVPs fra 8 til 20-uger gamle Lgr5-EGFP mus er tilstrækkelig til at opnå ~ 10.000 GFP+ celler til eksperimentel brug, hvilket resulterer i 50 brønde forgyldt ved en tæthed på 200 celler pr godt i 48-brønd plader. Fjernelse af CVP skyttegrav epithelia optimeres ved at injicere lingual epitel med frisklavet Dispase II og type-I collagenase opløsning, efterfulgt af en 33 min inkubation. Men en kortere inkubationstid, gamle enzym aliquots, forskellige partier, eller ved hjælp af enzymer fra forskellige producenter kan resultere i ufuldstændig skyttegrav fjernelse. Omvendt forårsager en længere inkubationstid over fordøjelse af vævet, hvilket resulterer i tab af smagsvævsintegritet. Efter peeling blev yderligere berigelse til CVP-skyttegrave udført ved at trimme epitelet omkring CVP væk.
Det er afgørende, at alle mikrocentrifugrør, der anvendes under dissociation og indsamlingsprocessen, er belagt med FBS for at forhindre væv og celler i at klæbe til rørenes plastvægge, hvilket reducerer genopretningen af isolerede celler betydeligt (data, der ikke er vist). Ved hjælp af et let lag FBS og fjernelse af overskydende væske fra rørene før brug minimerer mulige hæmmende virkninger på Trypsin eller andre enzymer.
Lingual organoider er blevet dyrket med succes fra dissociated CVP væv uden forudgående sortering af LGR5+ celler17. Selvom denne metode resulterer i dannelsen af organoider, har vi konstateret, at en mindre andel af disse organoider indeholder smagsceller sammenlignet med dem, der dyrkes fra isolerede forfædre (data, der ikke er vist). Flow sortering for Lgr5-EGFP+ celler beriger for smagskomne forfædre, hvilket resulterer i en højere andel af smagsplette organoider. I øjeblikket samler vi alle celler over tærsklen for GFP autofluorescence (Figur 3); Det er dog muligt, at GFP lysstyrke niveauer er forbundet med variabel organoid danner effektivitet eller smag kompetence. Denne hypotese er endnu ikke blevet testet, men er en lovende vej til fremtidigt arbejde, da det kunne tillade yderligere berigelse af smagscelleholdige organoider.
Det er velkendt, at belægningsgraden påvirker effektiviteten af organoiddifferentiering, og vi anbefaler, at optimal belægningsgrad bestemmes før forsøg28. Størrelsen og dybden af brøndene, samt matrix gel volumen, bør overvejes ved fastsættelsen af belægningsgrad. Baseret på vores indledende arbejde (data ikke vist), finder vi, at i en 48-brønd plade, 15 μL af matrix gel og en plating tæthed på 200 celler pr godt giver effektiv organoid ekspansion og differentiering af alle tre TRC typer. Vi har konstateret, at lingual organoider kan dyrkes med succes og reproducerbarhed i reduceret vækstfaktor Kælder membran ekstrakt (RGF BME), en syntetisk og billigere matrix gel alternativ. Andre alternative matricer kan også støtte lingual organoid kultur, men yderligere test er nødvendig for at undersøge denne mulighed.
Under plating skal indsamlede celler være grundigt, men forsigtigt suspenderet i matrixgel ved ofte at pipetter op og ned for at holde celleaffjedringen homogen. Røret, der indeholder cellematrixgelblandingen, skal også opbevares på is under hele platingprocessen for at forhindre matrixgel i at gele på siderne af røret. Disse foranstaltninger sikrer en jævn fordeling af celler på tværs af brønde, hvilket giver mere reproducerbare resultater, når hånd-plating celler. Især den seneste udvikling inden for mikrofluidiske teknologier giver høje gennemløbsmuligheder for celledispensering og er et lovende værktøj til fremtidigt arbejde29.
For at vurdere genekspressionen i dyrkede organoider blev det anset for nødvendigt at samle mindst tre brønde for hver biologisk replikation for at opnå tilstrækkelig RNA og konsistens på tværs af replikaer (figur 6). Det blev også fastslået, at umiddelbart lysning høstede organoider i henhold til specifikke fabrikantens anvisninger optimerer kvaliteten og mængden af udvundne RNA. Selvom det ikke er testet her, kan andre opbevaringsmuligheder såsom flash-frysning eller resuspension i opbevaringsreagenser også bevare RNA-udbyttet og kvaliteten.
Udførelse af immunohistochemistry på organoider kan være udfordrende, da primære og sekundære antistoffer skal trænge ind i enhver resterende matrixgel og hele organoidepitele. I tidligere rapporter blev organoider fastsat, mens de stadig var suspenderet i matrixgel, hvilket efterfølgende krævede ekstremt høje koncentrationer af primær antistofopløsning for at afsløre proteinudtryk17,18. I lighed med andre rapporter blev det konstateret, at fjernelse af organoider fra matrixgel ved hjælp af cell recovery solution før fiksering viste sig at øge effektiviteten af farvning uden behov for en høj antistofkoncentration30,31; Påvisning af nogle smagscellemarkører, f.eks. CAR4, kræver dog en højere koncentration af antistof. Endvidere øger inkubation af organoider i primær antisera i 3 nætter sandsynligheden for antistofbinding. Denne metode kan dog også øge baggrundslyscensen, hvis organoider ikke vaskes tilstrækkeligt efter immunstainning. Det er vigtigt, at fortyndet primær antistofopløsning kan gemmes og med succes genbruges en eller flere gange, hvis den opbevares i mindre end en uge (data, der ikke er vist). For optimal billeddannelse, organoider er monteret ved at placere en coverlip på toppen af en ler perimeter af modellering ler for at bevare deres 3D-struktur. Placering af dækslet glas direkte på dias komprimerer og bryder organoider, forhindrer korrekt analyse.
Organoidkultur er en yderst anvendelig, omkostningseffektiv teknik. Nogle anvendelser omfatter, men er ikke begrænset til, sygdom modellering og lægemiddelscreening og studiet af stamcelle-og udviklingsbiologi32. Derfor er det afgørende at standardisere organoidmodeller for at tillade reproducerbarhed på tværs af laboratorier. I fremtiden vil det være nyttigt at udvikle en standardiseret metode til at videregive lingualorganoider, der garanterer, at smagsstamcellestyrke kan formeres over serielle passager, hvilket reducerer behovet for yderligere dyr til at generere flere organoider. Det er vigtigt, at mens lingualorganoider består af både smags- og ikke-smags epitelceller, adskiller organiseringen af disse celler sig i forhold til in vivo-smagssystemet. Uoverensstemmelser mellem organoider og smag epitel in vivo kan skyldes de medier, der anvendes til organoid kultur og / eller fordi organoider mangler interaktion med smagsløg mikromiljø, herunder vigtige signaler fra gustatory nerver og lamina propria, der er nødvendige for smag bud dannelse og vedligeholdelse22,33,34,35. Fremtidige arbejde med at indarbejde nerver eller vaskulatur i lingual organoid kultur, en strategi, der i øjeblikket er ved at blive vedtaget i andre organoid systemer, kunne give mulighed for mere præcis modellering af in vivo smag epitel36,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Peter Dempsey og Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid og Tissue Modellering Shared Resource) for at give WNR konditionerede medier og værdifulde diskussioner. Vi takker også University of Colorado Cancer Center Cell Technologies og Flow Cytometry Shared Resources, især Dmitry Baturin, for celle sortering ekspertise. Dette arbejde blev finansieret af: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 og NIH/NCI R21 CA236480 til LAB og R21DC016131 og R21DC016131-02S1 til GD og F32 DC015958 til EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
